En 3D Tail Explant Kultur til undersøgelse hvirveldyr Segmentering i zebrafisk

Summary

Her præsenterer vi protokollen for 3D-vævskulturen af zebrafiskens bageste kropsakse, der muliggør levende undersøgelse af hvirveldyrsegmentering. Denne explant model giver kontrol over akse forlængelse, ændring af morfogen kilder, og subcellulær opløsning væv-niveau levende billeddannelse.

Abstract

Hvirveldyr embryoner mønster deres vigtigste krop akse som gentagne somites, forløberne for ryghvirvler, muskler og hud. Somites gradvist segment fra den presomitiske mesoderm (PSM) som enden af embryoet forlænger posteriorly. Somites form med regelmæssig periodicitet og skala i størrelse. Zebrafisk er en populær modelorganisme, da den er genetisk tractable og har gennemsigtige embryoner, der giver mulighed for levende billeddannelse. Ikke desto mindre er fiskefostre viklet rundt om en stor, afrundende æggeblomme under somitogenese. Denne geometri begrænser levende billeddannelse af PSM-væv i zebrafiskembryoner, især ved højere opløsninger, der kræver en tæt objektiv arbejdsafstand. Her præsenterer vi en flad 3D-vævskulturmetode til levende billeddannelse af zebrafiskhale explants. Hale explants efterligne intakte embryoner ved at vise en proportional afmatning af aksen forlængelse og afkortning af rostrocaudal somite længder. Vi er yderligere i stand til at stall akse forlængelse hastighed gennem explant kultur. Dette gør det for første gang muligt for os at udrede den kemiske tilførsel af signalgradienter fra den mekanistiske tilførsel af aksial forlængelse. I fremtidige undersøgelser kan denne metode kombineres med en mikrofluidisk opsætning for at muliggøre tidskontrollerede farmaceutiske miksninger eller screening af segmentering af hvirveldyr uden problemer med lægemiddelindtrængning.

Introduction

Metamerisk segmentering af organismer er meget udbredt i naturen. Gentagne strukturer er afgørende for funktionaliteten af laterale organer som hvirvler, muskler, nerver, fartøjer, lemmer eller blade i en kropsplan¹. Som et resultat af sådanne fysiologiske og geometriske begrænsninger af den aksiale symmetri udviser de fleste karinaer af Bilateria- såsom annelider, leddyr og akkordater-udstilling segmentering af deres embryonale væv (f.eks. ectoderm, mesoderm) antero-posteriorly.

Hvirveldyr embryoner sekventielt segment deres paraxial mesoderm langs de store organ akse i somites med artsspecifikke intervaller, tæller, og størrelse distributioner. På trods af en sådan robusthed blandt individuelle embryoner inden for en art er somitsegmentering alsidig mellem hvirveldyrarter. Segmentering sker i et stort regime af tidsintervaller (fra 25 min i zebrafisk til 5 timer hos mennesker), størrelser (fra ~ 20 μm i hale somites af zebrafisk til ~ 200 μm i trunk somites af mus) og tæller (fra 32 i zebrafisk til ~ 300 i majsslanger)². Mere interessant er det, at fiskefostre kan udvikle sig i en lang række temperaturer (fra ~20,5 °C op til 34 °C for zebrafisk), samtidig med at deres somitter bevares med korrekt størrelsesfordeling ved at kompensere for både segmenteringsintervaller og aksiale forlængelseshastigheder. Ud over sådanne interessante træk forbliver zebrafisk som en nyttig modelorganisme til at studere segmentering i hvirveldyr på grund af den eksterne, synkrone og gennemsigtige udvikling af en mangfoldighed af søskendefostre samt deres tilgængelige genetiske værktøjer. Fra mikroskopisk perspektiv udvikler teleostembryoner sig på en voluminøs sfærisk æggeblomme, der strækker sig og afrunder det gastrulerende væv omkring det(figur 1A). I denne artikel præsenterer vi en flad 3-D vævsudgravningskultur til zebrafiskhaler. Dette strålesystem omgår æggeblommemassens sfæriske begrænsninger, hvilket giver adgang til levende billeddannelse af fiskeembryoner i høj opløsning med henblik på somite-mønstre.

Figur 1: Slide Chamber Explant System for Zebrafish Embryos. (A) Zebrafiskembryoner har fordele for levende billeddannelse, såsom gennemsigtigheden af gastrulerende embryonalt væv (blåt), men vævet dannes omkring en voluminøs sfærisk æggeblommemasse (gul), som forhindrer næsten objektiv billeddannelse i høj opløsning i intakte embryoner. Hale explants kan dissekeres begyndende med en mikrokirurgisk kniv (brun) skåret fra vævet foran somites (rød) og fortsætter ved grænsen til æggeblommen posteriorly. (B) Dissekerede hale explants kan placeres på en coverslip (lyseblå) dorsoventrally; holde neuralt væv (lysegrå) på toppen og notochord (mørkegrå) i bunden. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Denne protokol indebærer brug af levende hvirveldyr embryoner yngre end 1 dag efter befrugtning. Alle dyreforsøg blev udført under de etiske retningslinjer fra Cincinnati Children's Hospital Medical Center; dyreprotokoller blev gennemgået og godkendt af Den Institutionelle Komité for Pasning og Anvendelse af Dyr (protokol nr. 2017-0048).

1. Indsamling af embryoner

1. Sæt par zebrafisk op i krydsende tanke natten før embryosamlingsdagen. For præcis iscenesættelse kontrol af embryo udvikling, bruge barrierer mellem parring par.
2. Hæv barrierer før foretrukken gydetid og saml æg inden for 15 minutter i en 100 mm petriskål.
   1. Rengør snavs fra petriskålen. Hvis der indsamles mere end 50 embryoner fra en enkelt kobling, opdeles koblingen i flere petriskåle i overensstemmelse hermed.
3. Embryoner inkuberes i fiskesystemvand ved 28 °C, indtil de når 50% epibolystadium (5 timer efter befrugtning). Et standardiseret embryovækstmedium som E3 kan også bruges i stedet for akvariesystemets vand indtil trin 3.2.
   1. Æg, der ikke er blevet flyttet, fjernes under et stereoskop, og embryonerne flyttes til en inkubator på 23,5 °C natten over (O/N). Embryoner skal være på 8-10 somites fase morgenen efter indsamling dag.

2. Værktøjsforberedelse

1. Steriliser mikrokirurgi knivblad, nål tips (bruges til dissektion af vævet), og glas Pasteur pipette ved iblødsætning i 100% ethanol (EtOH) og brand ruder.
2. Brug to lag gennemsigtigt tape (~100-120 μm tykkelse) på 25 mm x 75 mm mikroskop dias. Skær ~ 18 mm x 18 mm firkantede brønde i midten af hvert dias tape dækker med en skalpel.
   1. Tør de forberedte slidekamre af med 70% EtOH. Disse brønde vil holde ~ 40 μL af medium.

3. Prøveforberedelse

1. Dechorionate embryoner ved hjælp af spidsen af to nål sprøjter under et stereoskop. Overfør embryoner i en separat petriskål med fiskesystemvand for at skylle.
2. Ved hjælp af et brandglaseret sterilt glas Pasteur pipette overføres embryoner i en 6 cm petriskål indeholdende dissektionsmedium (Leibovitz-15 cellekulturmedium med L-Glutamin uden Phenol Red, 0,8 mM CaCl₂ og 1× antibiotisk-antimykotisk opløsning).
   BEMÆRK: Fortsæt med at bruge en steriliseret glaspipette til alle overførsler efter dette trin.
   1. Brug en glas petriskål til explanting procedure for at undgå polystyren chips under dissektion.
3. Sæt 50 μL vævsvækstmedium (dissektionsmedium og 10% FBS) i diaskammeret.
4. Stabilisere et foster til dissektion under stereoskopet med en nålspids ved æggeblommevævskrydset nær baghjernen.
5. Hold det embryonale væv stabilt med en nål, brug den mikrokirurgiske kniv med klingen holdt på 45° for at skære vævet foran baghjernen fra hinanden og skræl æggeblommen af embryonale væv startende fra den forreste og bevæger sig mod haleknoppen (Figur 1A).
   BEMÆRK: Pas på ikke at miste hudvævet under rengøring af æggeblommen. Huden ville let skrælle som en flankerende enkelt lag elastisk væv omkring embryoet under dissektion, så det er let at genkende.
6. Når æggeblommen er helt fjernet fra embryonale kroppen, skæres det flankerende hudvæv fra tailbud. Hold den sidste dannede 3-4 somites intakt, skær de mere forreste væv ud (fuld-akse explant).
   1. Æggeblommen skal komme ud hovedsageligt intakt fra denne procedure. I tilfælde af en bristet æggeblomme kan betydelige granulater af æggeblomme forblive fastgjort til vævets ventrale overflade. Hvis det er tilfældet, skal du bruge et vippeværktøj til forsigtigt at rense de resterende æggeblommegranulat af.
      BEMÆRK: En ubalance i hudvæv på sidesiden af en explant ville ikke tillade vævet at opretholde en lige vækstretning. Den explant i stedet vil bøje mod siden af mere strakt hud. Denne ubalance kan korrigeres under stereoskopet ved at briste hudlaget ved hjælp af mikrokirurgisk kniv.
   2. For hudløse explants, tryk på en spids af huden lag med nål og skræl væv explant off med mikrokirurgiske kniv. Disse explants vil ikke forlænge deres kropsakse i kultur.
   3. Ud over de fulde akse explants kan der laves alternative explants på dette trin. For eksempel dissekere allerede segmenteret somites ved hjælp af mikrokirurgiske kniv (fuld-PSM explants) eller dissekere PSM i sin halve anteroposterior (halv-PSM explants). Se afsnit 5.1 for en anvendelse af sådanne alternative explants.
7. De dissekeret eksplant overføres straks til et 22 mm x 22 mm coverlip, hvorpå billedbilledet vil blive udført.
   1. Explanten skal placeres fladt på dorsoventralaksen, og ventralsiden berøres af dækslet (Figur 1B). Fjern forsigtigt det overskydende medie omkring vævsudgravningspressen ved hjælp af en 20 μL filtreret spidspipette.
      BEMÆRK: Forsinket overførsel af dissekerede explants til coverlip resulterer i deformationer af vævet, da det er fritaget fra æggeblommens geometriske begrænsninger.
8. Vend hurtigt og forsigtigt coverlip med explant over vækstmediet fyldt slide kammer.
   1. For at forhindre bobledannelse skal du placere en side af den firkantede coverlip på båndkammeret og slippe den anden side forsigtigt. Pas på ikke at flytte/deformere explanten i dette trin.
   2. Fjern forsigtigt overskydende medieblødning ud af kammeret ved at trykke på slidekammeret på et laboratorievæv. Coverlipet sidder stabilt på diaskammeret for levende billeddannelse på grund af væskemediets overfladespænding uden forsegling.
   3. Til langsigtet dyrkning (>6 timer) skal du bruge et større kammer. 22 mm x 50 mm rektangulære coverlips sammen med to parallelle baner af tape lag på dias kan udnyttes i sådanne tilfælde. En ~ 1 mm bred kløft kan efterlades i mellem to båndbaner for at lette luft adgang til vækstmediet.
9. Gentag trin 3.3-3.8 for at forberede flere explants. Forberedte explants vil forlænge deres A-P kropsakse med et gennemsnit på ~ 30 μm / h hastighed og segmentere deres somites med ~ 40 min intervaller ved 25 ° C (Figur 2A, Video 1).
   1. For ikke-aflange explants, anvende blidt tryk på siderne af dias holde prøven i trin 3.8.2, mens suge det overskydende medie ud på et laboratorium væv. Alternativt kan explants dyrkes i enkelt tape lag dias kamre. Også kemisk aktivering af diaskammerets overflade med type I-kollagen vil resultere i ikke-aflange explants (Figur 2B, Video 2).
      1. Udfør belægning af kammeret med type I kollagen på forhånd ved fuldt ud at dække diaskamrene med 15-20 ml prediluted kollagenopløsning ved stuetemperatur i 1 time. Brug en laminar flow hætte til denne protokol for at opretholde sterilitet. Skyl forsigtigt kamre med dissektionsmedium for enden.
   2. For embryoner ældre end 15 somite fase, montere halen explant væv sideværts i stedet for en flad (dorsoventral) mount (Video 3). For at forhindre muskeltrækninger skal du inkludere 0,004% tricainopløsning i kulturmediet som bedøvelsesmiddel³.

4. Erhvervelse af livebilleder

1. Billedprøver enten på en dissektion mulighed for widefield transmitteret lys billeddannelse af somite segmentering størrelser og perioder, eller med struktureret belysning / konfokale / lys ark mikroskopi ved hjælp af transgene reporter fiskelinjer.
2. Ekvilibrere temperaturen på vævseksplanter med billedbehandlingsrumtemperaturen i mindst 15 minutter.
   1. For mere præcis temperaturstyring skal du bruge et kommercielt temperaturstyringssystem monteret på et omvendt mikroskop.
3. Indstil billedopsamlingsrammeintervallerne til 2 - 10 minutter afhængigt af den biologiske proces af interesse.
   BEMÆRK: Segmentering af zebrafisks somit er en hurtig proces, der varierer mellem 20 - 55 min. ved levedygtige temperaturer på 30 °C til 21,5 °C i hele embryoner. Explants vil forlænge og segment ~ 30% langsommere end hele embryoner.
   1. Vær opmærksom på at forlade nok forsinkelse mellem sæt af kanal erhvervelser for at undgå mulig fototoksicitet til levende væv. Vævet må ikke udsættes for excitationsstrålen i mere end halvdelen af billedtiden og stråleintensiteten så meget som muligt.
      BEMÆRK: Akkumulering af reaktive iltarter (ROS) er generelt hovedårsagen til fototoksicitet i levende prøver⁴. Ascorbinsyre som ROS-skyllevæske kan suppleres til vækstmedium ved 4 mM koncentration for at buffer ROS-aktivitet og lindre fototoksicitet. Negative virkninger af fototoksicitet kan være svære at bemærke under live billeddannelse. Hale explants er fordelagtige i dette aspekt, da nogle visuelle markører for fototoksicitet såsom mitotisk anholdelse, hæmmet vævsudvikling (dvs. dannelse af somites, haleforlængelse) og opløsende væv er lettere at bemærke. Der henvises til den medfølgende reference⁴ for en detaljeret drøftelse.
4. Brug RNA-injicerede embryoner i enkeltcellestadium til at erhverve 4D-billeder, der er beregnet til at blive segmenteret og analyseret i celleopløsningsniveau.
   1. Brug 300 pg RNA fra in vitro transskriberede membraner og nukleare fluorescerende reporter markør plasmider såsom pCS-membrane-ceruleanFP (Addgene plasmid #53749) eller pCS-memb-mCherry (Addgene plasmid #53750) i kombination med pCS2+ H2B-mTagBFP2 (Addgene plasmid #99267) eller pCS2+ H2B-TagRFP-T (Addgene plasmid #99271) i injektioner. For en prøve film med cellemembran og kerner markører se Video 4.
      BEMÆRK: Den gennemsnitlige cellestørrelse af PSM-væv er ca. ~5 μm i diameter, hvoraf kerner består af ~3 - 4 μm. Der skal registreres en pixelstørrelse på ~0,5 μm og en z-sektion på ~1 μm for korrekt cellesegmentering.

5. Immunostaining af hale explants

BEMÆRK: Væv, der dyrkes efter forskellige dissektionsscenarier (aflange, ikke-aflange, haleknop dissekeret, halvt PSM osv.), da fladmonterede hale explants⁵ kan genvindes fra diaskamre for yderligere immunfarvning af kvantificeringer af proteiner af interesse. Her præsenterer vi den protokol, der anvendes til di-fosforlateret ekstracellulært signal reguleret kinase (ppERK) farvning af explants som FGF signalering gradient udlæsning.

1. Efter dannelse af somitter indtil den ønskede fase, forsigtigt flytte coverslip halvvejs til hjørnet af diaskammeret uden at løfte.
2. Ved hjælp af ~ 100 μL supplerende dissektion medium i et glas Pasteur pipette, inddrive explants fra diaset og overføre til en 64-brønd cellekultur plade.
   BEMÆRK: Fra og med dette trin kan alle opløsningsudskiftninger udføres under et dissektionsområde med en separat glaspipette til faste prøver. Dette vil sikre, at du ikke mister explantvæv i brønde eller overfører dem derimellem.
3. Efter overførsel af alle explants suges det overdrevne medium ud af brøndene en efter en og sættes 100 μL af 4% paraformaldehyd i PBS (PFA) i hver brønd.
   ADVARSEL: PFA er en giftig opløsning med kræftfremkaldende virkninger. Korrekt PV bør anvendes under håndtering.
4. Fastgør explants i en 64-brønds plade ved stuetemperatur i 1 time på en shaker.
   1. Vævs explants er mere følsomme over for deformationer end hele embryoner. Juster rystehastigheden i overensstemmelse hermed.
5. Det fikseringsmiddel vaskes ud med 150 μL PBS-Tw (0,1% Tween20 i PBS) tre gange. Saml den første vask i en bestemt "PFA Waste" container.
6. Dehydrat explants i 4×5 min trin ved at erstatte ~ 40 μL opløsning hver gang med 100% methanol (MeOH).
   ADVARSEL: MeOH er et giftigt kemikalie, som er flygtigt og brandfarligt. Arbejd i et godt ventileret rum og brug korrekt PPE til håndtering.
7. Som det sidste trin i dehydrering fjernes al opløsning fra brønde og erstattes med 100 μL MeOH. Inkuber ved -20 °C i 15 min.
   BEMÆRK: Brug en specifik "MeOH Waste"-beholder til at indsamle opløsningerne indtil trin 5.11.
8. Der tilsættes 50 μL MeOH og rystes ved stuetemperatur i 5 min.
9. Rehydrerings explants i 4×5 min trin ved at erstatte ~ 40 μL opløsning hver gang med PBS-T (0,1% Triton-X 100 i PBS). Brug en specifik "MeOH Waste" container til at indsamle løsningerne.
10. Som det sidste trin i rehydrering fjernes al opløsning fra brønde og erstattes med 100 μL PBS-T.
11. For væv permeabilization behandle explants med 1,5% Triton-X 100 i PBS i 20 min ved stuetemperatur på shaker.
12. Prøver med MAB-D-T (0,1% Triton-X 100 vaskemiddel og 1% dimethylsulfoxid (DMSO) i 150 mM NaCl 100 mM malesyre buffer pH 7,5) 3×5 min.
    ADVARSEL: DMSO er brandfarlig og et giftigt mutagen. Korrekt PV bør anvendes under håndtering.
13. Inkubere explanter i 100 μL/brønd serumblokeringsopløsning (2% føtalt kvægserum i MAB-D-T) i 2 timer ved stuetemperatur.
14. Alle blokeringsopløsninger udskiftes med 50-100 μL/brønds primær antistofopløsning (1:1000 fortynding af monoklonalt museantistof mod ppERK i serumblok). Inkuber prøverne O/N (>16 h) ved 4 °C på shakeren.
15. Den primære antistofopløsning vaskes med MAB-D-T 5×5 min.
16. Inkuber prøver i sekundær antistofopløsning (Alexa Fluor 597 ged anti-mus IgG2b (1:200) og Hoechst 33342 (1:5000) i MAB-D-T) O/N ved 4 °C på en shaker eller i 3 timer ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Fra dette trin skal du dække 64-brøndspladen med aluminiumsfolie for at undgå let eksponering af sekundære antistofbehandlede prøver.
    ADVARSEL: Hoechst 33342 er et potentielt kræftfremkaldende stof. Korrekt PV bør anvendes under håndtering.
17. Den sekundære antistofopløsning vaskes med PBS-Tw 3×5 min.
18. Fastgør prøver med PFA i 15 minutter ved stuetemperatur.
19. Reseativ med PBS-Tw og ekvilibreringsprøver skal vaskes inden for 60% glycerol. Monter explants på mikroskop dias med neglelak og 60% glycerol til billeddannelse. For repræsentative immundæmpende resultater se figur 3.

Representative Results

Denne protokol muliggør flad geometrisk dyrkning af levende zebrafisk hale explants. Vævskultur præsenterer tre store fordele i forhold til hele embryoner: 1) kontrol af akse forlængelse hastighed, 2) kontrol over forskellige signalering (morfogen) kilder ved simpel dissektion, og 3) næsten objektiv, høj forstørrelse og høj NA levende billeddannelse.

Kemisk ubehandlede diaskamre gør det muligt for haleekspeditret at forlænge sin hovedakse (Figur 2A) ved hudens ektodermindpakning omkring vævet nedenunder. Da vi dyrkede explants på kemisk aktiverede diaskamre (med type I-kollagen), strakte hudens ektoderm sig og klæbede til diaskammeret, hvilket stoppede aksens forlængelse af explanten. På trods af dette fortsatte somitterne med at segmentere (Figur 2B, Supplerende film S1 og S2). Som beskrevet i protokollen kan akseforlængelse også stoppes direkte ved at anvende fysisk tryk under monteringsprocessen eller monteringsfrenter i et lavvandet glidekammer. Kvantificering af akseforlængelseshastighed under sådanne fysiske begrænsninger findes i vores tidligere offentliggjorte arbejde⁵.

Figur 2: Kontrol af akseforlængelse i explants. (A) Explants dyrket på en regelmæssig dias kammer (venstre) forlænge aksially som de holder segmentering nye somites. Transmitteret lys (venstre, gråtoner) og transgene nukleare markør (højre, rød) snapshots er vist i 2 timer af kultur varighed. (B) Kemisk aktivering af diaskammeret med type I-kollagen, før det dyrkning går i stå, påvirker den aksiale forlængelse, men påvirker ikke somite segmenteringshastigheden. Skalalinjen er 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

For det andet kan explants dyrkes ved at dissekere kilderne til morfoser for at identificere lærerig information, de giver til udviklingsprocesser. Her præsenterer vi tre eksemplariske billeder, der viser effekten af dissektioner på ppERK-signalniveauer (Figur 3). I PSM-vævet etableres en FGF-signalgradient fra bageste til forreste (læst op af ppERK-niveauer). Kun haleknoppervævet transskriberer aktivt fgf8⁶ og danner en kilde til denne gradient ved hjælp af FGF ligand diffusitet⁵. Haleeksplanter, der mangler haleknoppedelen af vævet efter dissektion (Figur 3C), resulterer i en kortere ppERK-gradient (Figur 3B, 3D). Modsat, en retinosyre gradient er etableret fra den forreste til den bageste i både PSM og dorsale neurale væv. Nyligt dannede somites og den forreste ende af PSM express retinosyre (RA) syntetisere enzymer og fungere som en kilde til RA gradient⁷. Når vi dissekeret ud den forreste PSM væv i explants (Figur 3E), vi stadig observeret et normalt omfang af ppERK gradient(Figur 3F) som visualiseret ved immunostaining. En detaljeret udnyttelse af denne styrke af explant metode kan findes i vores seneste undersøgelse⁵.

For det tredje er fladmonterede zebrafisk explants optimale til høj opløsning levende observation af væv morfogenese. Her præsenterer vi en film (Video 4) taget med en transgen explant udtrykke EGFP som en celle membran markør (falsk farvet med rød) og farves med en langt rød celle nuklei markør (falsk farvet med cyan). Uden yderligere kvantificering kan mange processer som indtrængen af neuromesodermale forfædre i haleknoppen, højere motilitet af bageste PSM-celler sammenlignet med forreste og epitelisering af somitiske grænseceller direkte observeres i filmen.

Figur 3: Immunostaining af tail explants. (A) Fuld PSM explants med intakte signalering gradienter langs PSM som en kontrol. (B) Regelmæssig ppERK-gradient observeres i fuld PSM-explants med immunostaining. (C) Hale knop dissekeret explants mangler en stor del af bageste FGF signalering kilde. (D) Der observeres et meget bageste begrænset ppERK-signal i haleknopper dissekeret explants. (E) Forreste PSM og somitisk væv kan dissekeres ud for at fjerne kilderne til mulige forreste PSM-signalfaktorer såsom RA-signalering. (F) En forreste fjernelse af PSM ændrer ikke det normale omfang af ppERK-gradienten. Væv blev fastsat 2 timer efter explanting for immunostaining protokol. Skalalinjen er 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Film 1: Akseforlængelse og somite segmentering i 3D-explants. Widefield transmitteret lys (top) og nukleare lokaliseret GFP (falsk farvet rød) epifluorescens (nederst) tid bortfalder billeder af en almindelig dias kammer fladmonteret explant. Halevæv blev udplantet fra fosteret på 13 somitter fase. Billedopsamling udføres på et omvendt mikroskop med 3 min. rammeintervaller. Skala bar er 100 μm. Klik her for at downloade denne film.

Film 2: Gået i stå akse forlængelse på kemisk aktiveret Slide Afdeling. Widefield transmitteret lys (top) og nukleare lokaliseret GFP (falsk farvet rød) epifluorescens (nederst) tid bortfalder billeder af en fladmonteret explant. En 11 somites fase embryo explant blev monteret på et dias kammer belagt med rotte hale kollagen løsning i 30 min før montering. Billedopsamling udføres på et omvendt mikroskop med 3 min. rammeintervaller. Skala bar er 100 μm. Klik her for at downloade denne film.

Film 3: Lateral Montering af Late-Stage Embryo Explants. Widefield transmitteret lys (venstre) og nukleare lokaliseret GFP (falsk farvet rød) epifluorescens (højre) tid bortfalder billeder af en almindelig dias kammer lateral monteret explant. Halevæv blev udplantet fra fosteret på 15 somites fase og tricaine opløsning blev brugt som bedøvelsesmidler. Billedopsamling udføres på et omvendt mikroskop med 3 min. rammeintervaller. Skala bar er 100 μm. Klik her for at downloade denne film.

Film 4: Enkelt celleopløsning Billedbehandling af tail explants. Time-lapse konfokal billeddannelse af en explant udtrykke EGFP som membran markør (falsk farvet rød) og langt rød farves for kerner i live (falsk farvet cyan). Gennemsnitlig intensitetsfremskrivning fra 5 z-lag (10 μm) vises i filmen over 1 time. Image erhvervelse udføres på en GaAsP detektor omvendt konfokale mikroskop med en 40× apochromatic λS DIC-vand nedsænkning 1,15 NA mållinse, med 4 min ramme intervaller. Skala bar er 100 μm. Klik her for at downloade denne film.

Discussion

Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol over en vævskultur explant teknik, vi udviklede og brugte for nylig⁵ til zebrafisk embryoner. Vores teknik bygger på de tidligere explant metoder i chick⁸ og zebrafish^9,10,11 model organismer. Hale explants udarbejdet med denne protokol kan overleve, så længe > 12 timer i en simpel dias kammer, fortsætter med at forlænge sin store krop akse og segmentere somites, indtil udgangen af somitogenesis.

Der bør udvises forsigtighed for at holde det eksplante væv sundt og med succes forlænget i længere tid. For det første skal vævsudsenderen dissekeres uden at beskadige intaktheden af de bageste væv. Vi observerede, at hudcellerne giver en pose til neuromesodermale stamceller, der indtrængende ind i den bageste haleløg. Hvis explants hud bliver skrællet af disse meget bevægelige celler, skal du forlade tailbudvævet og migrere posteriorly over coverlipet ud over vævsgrænserne. For det andet kan middelmådig ubalanceret spænding i hudvævet resultere i divergerende akseforlængelse, som kan bøje PSM's akse og notochord. En kort slids skåret til flankerende hudceller på begge sider af explant hjælper med at afhjælpe denne bekymring. Ud over de hudrelevante bekymringer bør der lægges ekstra vægt på at opretholde steriliteten af vækstmedierne og dissektionsværktøjerne i længerevarende kulturer.

Med passende pleje opsummerer den explantkultur den sunde vækst af hele embryoner. Vi observerede muskuløse ryk i explants begynder fra 20 somites fase som i hele embryoner¹². Selv om vi fokuserede på PSM-væv til undersøgelse af somite segmentering, tilstødende væv såsom hud ectoderm, neurale køl (senere neurale stang og neuralrør), notochord, mellemliggende og lateral plade mesoderm også forblive intakt under de beskrevne dyrkning betingelser (Figur 1B). Dette er især fordelagtigt for væv, der er skjult af æggeblommen, og som kan afbildes i høj opløsning ved ventrally monterede explants, såsom notochord, Kupffers vesikel og andet væv, der udvikler sig ved segmenteringsfase¹². Det skal understreges, at det eksplante system ikke vokser så hurtigt som hele embryoner og ikke segmenterer somites i samme tempo som hele embryoner. Denne begrænsning for det eksplante system kan også ændre tidsdynamikken i andre begivenheder ubemærket her.

Her præsenterede vi repræsentative resultater, der fremhæver tre store fordele ved hale explant-systemet i forhold til hele embryoeksperimenter. Vi har for nylig brugt denne metode til at rede ud lærerigt roller akse forlængelse fra morfogen gradienter for somite segmentering⁵. Sene fremskridt inden for lysplademikroskopi har gjort hele embryon levende billeddannelse mulig¹³ for flere modelorganismer. Men de fleste af disse metoder mangler stadig korrekt subcellulær opløsning og er næppe tilgængelige for det bredere forskningsmiljø. Halen explant model beskrevet her gør subcellulær opløsning væv-niveau levende billeddannelse tilgængelig med enkle inverterede eller konfokale mikroskoper. Bortset fra metodologiske fordele, kan en sådan levende billeddannelse give indsigt i segmentering af den bageste hvirveldyr kropsakse. Ved at holde protokollen så direkte og tilgængelig som muligt kan det eksplante system også gavne det bredere område for zebrafiskudviklingsbiologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle	Becton, Dickinson and Co.	REF 309597	for dechorionating embryos and manipulations
200 Proof Ethanol, Anhydrous	Decon Labs	2701	for immunostaining
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955	for tissue dissection media
Calcium Chloride Anhydrous, Powder	Sigma-Aldrich	499609	for tissue dissection media
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	for immunostaining
Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel	Integra-Miltex	MIL4-411	for preparing tape slide wells
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	886-86-2	(optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	A3160601	additional for tissue culture media
Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594	Invitrogen	Cat#A-21145; RRID: AB_2535781	secondary antibody for immunostaining
L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red	GIBCO	21083-027	for tissue dissection media
Methanol	Sigma-Aldrich	179337	for immunostaining
Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade	Surgical Specialties	72-2863	for tissue dissection
Mouse monoclonal anti-ppERK	Sigma-Aldrich	Cat#M8159; RRID:AB_477245	for ppERK immunostaining
NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent	Invitrogen	R37106	(optional) for live staining of cell nuclei
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127	for fixation of samples for immunostaining
Rat Tail Collagen Coating Solution	Sigma-Aldrich	122-20	(optional) for chemically activating slide chambers
Stage Top Incubator	Tokai Hit	tokai-hit-stxg	(optional) for temperature control during live imaging
Transparent Tape 3/4''	Scotch	S-9782	for preparing tape slide wells
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	for immunostaining
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	for immunostaining
Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP)	Campbell et al., 2015	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4	transgenic fish with nuclear localized EGFP
Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)	Cooper et al., 2005	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75	transgenic fish with cell membrane localized EGFP