Summary
Растущий спрос на крупномасштабный сбор данных в криогенной электронной томографии требует высокопроизводительных процедур получения изображений. Здесь описан протокол, который реализует последние разработки передовых стратегий сбора, направленных на максимизацию эффективности времени и пропускной способности сбора томографических данных.
Abstract
Криогенная электронная томография (криоЭТ) является мощным методом изучения 3D-структуры биологических образцов в близком к родному состоянию. Современное состояние криоЭТ в сочетании с анализом усреднения субтомограмм позволяет определять структуры макромолекулярных комплексов с высоким разрешением, которые присутствуют в нескольких копиях в томографических реконструкциях. Томографические эксперименты обычно требуют получения огромного количества наклонных рядов с помощью высококачественных просвечивающих электронных микроскопов с важными эксплуатационными расходами. Хотя пропускная способность и надежность автоматизированных процедур сбора данных постоянно улучшались в последние годы, процесс выбора интересующих регионов, в которых будет получен ряд наклонов, не может быть легко автоматизирован, и он по-прежнему зависит от ручного ввода пользователя. Таким образом, настройка крупномасштабного сеанса сбора данных является трудоемкой процедурой, которая может значительно сократить оставшееся время микроскопа, доступное для получения серии наклона. Здесь протокол описывает недавно разработанные реализации, основанные на пакете SerialEM и программном обеспечении PyEM, которые значительно повышают временную эффективность скрининга сетки и крупномасштабного сбора данных о сериях наклона. Представленный протокол иллюстрирует, как использовать функциональные возможности сценариев SerialEM для полной автоматизации сопоставления сетки, сопоставления квадратов сетки и получения рядов наклона. Кроме того, протокол описывает, как использовать PyEM для выбора дополнительных целей сбора в режиме off-line после начала автоматического сбора данных. Чтобы проиллюстрировать этот протокол, описано его применение в контексте сбора высококачественных данных серии наклона Sars-Cov-2. Представленный конвейер особенно подходит для максимизации временной эффективности томографических экспериментов, которые требуют тщательного выбора целей сбора и в то же время большого количества наклонных рядов, которые необходимо собрать.
Introduction
Методы криогенной электронной микроскопии (криоЭМ) основаны на визуализации биологических образцов с помощью просвечивающих электронных микроскопов (ТЭМ) после их быстрой витрификации, процесса пробоподготовки, который сохраняет молекулярные и клеточные структуры образцов в близком к нативном и гидратированном состоянии1,2. В криогенной электронной томографии (криоЭТ) 3D-модель остеклованного образца достигается путем получения ряда изображений одной и той же интересующей области из разных ориентаций, так называемого наклонного ряда, с последующей вычислительной реконструкцией томографического тома3. Этот передовой метод визуализации превратился в мощный метод структурного исследования биологических процессов в контексте их нативных клеточных сред4,5,6.
Помимо ультраструктурного анализа остеклованного образца, реконструкции высокоместных макромолекулярных комплексов, присутствующих в нескольких копиях в пределах томографического объема, могут быть получены путем применения субтомограммы в среднем5. Этот подход к реконструкции основан на итеративном выравнивании и усреднении подтомов, содержащих интересующую структуру, и направлен на увеличение отношения сигнал/шум и разрешения окончательной реконструкции7,8. Усреднение субтомограммы зависит от сбора и обработки большого объема данных, что часто требует получения сотен наклонных рядов с помощью высококачественных ТЭМ с обременительными эксплуатационными расходами.
В настоящее время настройка таких автоматизированных сеансов криоЭТ является трудоемким процессом, который обычно опирается на ручной ввод пользователя9,10,11. Как правило, цели идентифицируются путем визуального осмотра картографированной сетки и впоследствии настраиваются для автоматизированного сбора данных. На эффективность пользователя в выявлении точек сбора часто влияет характер образца, что становится особенно сложным при анализе очищенных макромолекул с неоптимальной концентрацией или в случае редких событий в переполненных клеточных средах, подразумевая использование коррелятивных подходов12. Кроме того, текущие рабочие процессы требуют получения изображений во время настройки при различных увеличениях, которые впоследствии будут использоваться для точной локализации и центрирования цели при автоматизированном сборе11,13,14. Эти высокоточные шаги повторного выравнивания имеют решающее значение для приложений с высоким разрешением, которые требуют, чтобы изображение выполнялось при высоком увеличении и требуют точных шагов центрирования для удержания интересующей области в результирующем небольшом поле зрения. В общей сложности для этой трудоемкой процедуры, в течение которой ТЕА не занимается сбором рядов наклона, отводится несколько часов каждого сеанса сбора данных. Поэтому, в зависимости от количества требуемых серий наклона, идентификация и настройка точек сбора может оказать значительное влияние на время микроскопа, доступное для сбора данных во время сеанса криоЭТ.
Здесь описан оптимизированный протокол, основанный на программном пакете SerialEM15 и последней версии программного обеспечения PyEM16 для отображения сеток, отображения квадратов сетки, выбора целей и настройки автоматического сбора данных для крупномасштабного сбора серий наклона. Ключевая концепция этого подхода заключается в предоставлении SerialEM вычислительно сгенерированных изображений PyEM для каждого элемента сбора, так и называется виртуальными картами, для точной локализации и центрирования цели. Чтобы получить фактическое время сбора, выбор целей, а также создание виртуальных карт выполняются в режиме off-line с использованием второго фиктивного экземпляра SerialEM, отделяя процесс выбора целей сбора от операций TEM. Хотя этот протокол не рассматривает способ повышения качества данных13,17 или скорость получения18,19серийнаклона,этот протокол в первую очередь ориентирован на стратегии оптимизации временной эффективности крупномасштабной автоматизированной настройки сеансов криоЭТ. Таким образом, реализация представленного протокола предназначена для тех ученых, которые создают рабочие процессы сбора данных cryoET, которые хотят максимизировать выход автоматизированного сбора данных за счет увеличения времени микроскопа, доступного для сбора клоновых рядов.
Protocol
Протокол, описанный здесь, является частью более полного документа, подготовленного сервисной платформой EMBL CryoEM, который включает в себя подробные пошаговые инструкции и скриншоты, иллюстрирующие всю процедуру типичного сеанса cryoET, включая загрузку образцов, картографирование сетки, настройку микроскопа, настройку точек сбора и автоматизированный сбор данных. Полный протокол можно скачать по следующей ссылке: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download
1. Необходимые условия
- Установите SerialEM версии 3.8 и настройтесь на управление микроскопом и детектором (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm).
- Установите фиктивный экземпляр SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).
- Установите PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).
2. Сопоставление сетки
- Загрузите кассету с сетками в автозагрузчик микроскопа.
- Настройте условия визуализации, подходящие для отображения всей сетки. Делайте это при минимально возможном увеличении с учетом поля зрения на используемом детекторе (EFTEM SA 2250x). Сохраните условия обработки изображений как состояние serialEM Imaging, чтобы сделать вещи удобными для последующего использования.
- Настройка полного монтажа
- Откройте меню Навигатор SerialEM.
- Выберите Монтаж и сетки.
- Выберите Настроить полный монтаж.
- Запустите сценарий Grid_Mapping. Позвольте скрипту подождать, пока автозагрузчик остынет; проведите инвентаризацию, а затем отнесите на карту каждую сетку, найденную процедурой инвентаризации. Введите электронное письмо через меню Tilt Series, чтобы сценарий удобно отправлял электронное письмо по завершении.
- Сохранить навигатор.
- Проверьте все карты сетки из навигатора SerialEM и выберите, какую сетку отображать дальше при большем увеличении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Многие ТЭМ, оснащенные системой автозагрузки, будут показывать вращение сетки при перезагрузке. Лучше всего переназначить любую сетку после ее перезагрузки. Альтернативные системы обычно страдают только от некоторых сдвигов, которые могут быть исправлены в SerialEM с помощью процедуры Shift To Marker.
3. Настройте низкую дозу SerialEM
- Установите увеличение режимов просмотра и предварительного просмотра низких доз SerialEM (это требуется для шага 6).
- Получите изображение View и сохраните его как карту в навигаторе.
- Получите изображение предварительного просмотра и сохраните его как карту в навигаторе.
- Установите оба режима на одно и то же биннинг (предлагается биннинг 4). Это позволяет сохранить две карты в один стек изображений.
- В окне Навигатор SerialEM измените метку карты Просмотр на Вид и метку предварительного просмотра карты на Предварительный просмотр.
- Сохраните и закройте файл навигатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для начальных изображений View и Preview не требуется цель, PyEM будет просто использовать свои настройки изображения.
4. Сопоставление квадратов сетки
- Настройте условия визуализации для отображения квадратов сетки. Очень важно иметь возможность видеть интересующий образец и распределение фидуциальных шариков. Чтобы обеспечить оптимальную контрастность для квадратов сетки, выполните следующие действия.
- Вставьте объективную диафрагму.
- Если применимо, вставьте щель энергетического фильтра.
- Используйте расфокусию -100 мкм.
- Экран для хороших квадратов сетки подходит для дальнейшего картографирования. После визуального осмотра квадратов с карты сетки сделайте тестовые изображения квадрата с условиями изображения, которые будут использоваться для карт квадратов сетки.
- Когда хороший квадрат определен, отметьте его центр на изображении карты сетки с помощью функции добавления точек навигатора SerialEM.
- После того, как все точки добавлены, в навигаторе SerialEM нажмите Shift + A на первой точке, затем нажмите Shift + A на последней точке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все добавленные баллы теперь помечены буквой А, что означает, что все они являются точками приобретения. - Нажмите клавиши SHIFT+N (создайте новый файл в элементе) в первой точке, а затем снова в последней точке. В диалоговом окне выберите Монтаж изображений.
- Когда появится диалоговое окно монтажа, настройте размер монтажа, который охватывает один квадрат сетки. Это зависит от увеличения и размера сетки используемых сеток и обычно требует монтажей от 2 x 2 до 4 x 4. Присвойте ему имя с номером (например, squaremap_01.mrc), чтобы SerialEM удобно автоматически нумеровать все файлы на квадрат сетки.
- Запустите сопоставление сетки, открыв меню SerialEM Navigator и нажав на Получить у элементов.
- Во всплывающем меню выберите следующие параметры.
- Выберите грубый эвцентриситет.
- Выберите Получить изображение карты.
- Выберите Закрыть клапаны столбцов в конце.
- Выберите Отправить сообщение электронной почты в конце.
5. Выбор целей
- Откройте фиктивный экземпляр SerialEM. Это можно настроить на ПК SerialEM, который управляет микроскопом, или на другом (вспомогательном) ПК, если оба компьютера имеют общее сетевое подключение.
- После того, как первый квадрат сетки сопоставлен, используйте пункт меню SerialEM Navigator Объединить, чтобы увидеть монтаж в фиктивном экземпляре SerialEM.
- Дважды щелкните по окну Навигатор, чтобы открыть квадратную сетку карты.
- Выполните поиск по карте и используйте фиктивную опцию SerialEM Navigator Add Points (Добавить точки сбора изображений) на интересуемую цель.
- Когда это будет сделано и после сопоставления новых квадратов, сохраните файл Navigator и снова объедините Navigator; продолжайте до тех пор, пока не будут сопоставлены все квадраты сетки.
6. Создание виртуальных карт
- Еще раз объедините файл навигатора с фиктивным экземпляром SerialEM.
- Запустите скрипт PyEM Virtual maps из фиктивного меню SerialEM, Инструменты и выберите Виртуальные якорные карты. Это может занять некоторое время в зависимости от размера и количества квадратных карт сетки и объединения карт просмотра и предварительного просмотра.
ПРИМЕЧАНИЕ: PyEM запускает командное окно, которое автоматически закрывается, когда это будет сделано, затем можно открыть новый файл навигатора. Для монтажной карты, содержащей выбранные точки, PyEM записывает одну объединенную карту и все ее карты View и Preview. Наконец, он записывает новый файл navigator с именем <navigatorfilename>_automaps.nav.
7. Настройка микроскопа
- Проверьте настройку микроскопа. Чтобы обеспечить надлежащую производительность микроскопа, используйте то же увеличение и размер пучка для сбора данных в следующем порядке.
- Запуск Выравнивания SeriaLEM без комы с помощью CTF (zemlin tableau).
- Вставьте и центрируйте объективную диафрагму.
- Запустите SerialEM Correct Astigmatism с помощью CTF (auto-stigmate).
- Запустите GIF Quick Tune (т.е. только щелевой фокус).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку этапы 7.1.1, 7.1.3 и 7.1.4 могут потребовать большей мощности дозы, следует изменять только размер пятна; размер луча не следует изменять, так как это вызывает наклон луча, что делает настройку неправильной. Этапы 7.1.1, 7.1.2 и 7.1.3 являются полуавтоматическими в этом общедоступном сценарии (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).
8. Настройка навигатора
- В SerialEM откройте новый файл навигации с именем <навигатор имя_файла>_automaps.nav.
ПРИМЕЧАНИЕ: V_yyyy - это карты Просмотра, а P_yyyy - карты предварительного просмотра. Карты предварительного просмотра устанавливаются как точки приобретения. - В окне SerialEM Navigator снимите флажок со всех точек A, выберите первую V_yyyy карте, выберите Свернуть,дважды щелкните A и снимите флажок Свернуть.
- Выберите первую позицию V_yyyy, нажмите Shift + T,затем выберите самую последнюю позицию V_yyyy и нажмите Shift + T еще раз.
- Выберите «Однорамочные изображения» в свойствах файла для открытия диалогового окна.
- В следующем диалоговом окне «Свойства файла» выберите нужные параметры в соответствии с потребностями в создании образов и настройкой прибора.
- При появлении запроса присвойте имя с номером (например, TS_001.mrc) и нажмите «Сохранить».
ПРИМЕЧАНИЕ: SerialEM автоматически нумерует имена файлов для всех серий наклона. - Настройте контроллер серии наклона для первого положения TS. Когда все будет готово, нажмите OK, чтобы установить эти параметры для всех серий наклона после этого элемента сбора. Все карты предварительного просмотра теперь выбраны как TS (Tilt Series) с пронумерованным именем файла TS_xxx.mrc.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позже можно изменить параметры вручную с помощью функции Navigator TSparams; изменения будут применяться ко всем пунктам списка вниз. Пользователь имеет возможность запустить пользовательский сценарий вместо ряда наклона.
9. Установите фокус/позиции трека
- При необходимости установите расстояние фокусировки/трека для каждой цели (убедитесь, что включена функция SerialEM Low Dose).
- Дважды щелкните на карте просмотра, чтобы загрузить ее.
- Выберите Предварительный просмотр карты в списке Навигатор.
- Выберите «Редактировать фокус» в окне «Навигатор».
- На панели управления низкой дозой снимите флажок Поворачивать межосевую ось, чтобы расположить пробную версию и фокусировку вдоль оси наклона сцены.
- Нажмите на нужную область на загруженной карте просмотра, чтобы установить фокус/пробное положение для этой серии наклонов.
- Убедитесь, что в элементе Navigator теперь установлен TSP; повторите процедуру для всех элементов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позиции фокусировки/трека автоматически копируются вниз в навигаторе. Поэтому, если положение фокуса/трека для предыдущего элемента находится на правильной стороне и на правильном расстоянии, нет необходимости изменять его для текущего элемента.
10. Настройка дополнительных скриптов
- Два сценария обрабатывают диапазон Focus: pretomo и duringtomo. Сценарий pretomo выполняется перед каждой серией наклона, а сценарий duringtomo — перед каждым наклоном.
- Отредактируйте диапазон фокусировки в скрипте pretomo.
- В меню SerialEM Tilt Series установите флажок Выполнить сценарий в TS и выберите номер сценария duringtomo.
11. Беги
- Проверьте уровень азота в резервуаре.
- Проверьте, выбран ли параметр Автозагрузчик турбо выключен.
- Проверьте свободное место в хранилище данных.
- В меню Файл SerialEM снимите флажок Непрерывное сохранение файла журнала и закройте все открытые в данный момент файлы журнала. Каждая серия наклонов получит свой собственный файл журнала.
- В меню Навигатор выберите Получить в Элементах.
- Запустите скрипт PreTomo.
- Выберите Основная задача Получить серию наклонов.
- Выберите Запустить сценарий после PostTomo.
- Выберите Закрыть клапаны колонны в конце.
- Выберите Отправить сообщение электронной почты в конце.
- Нажмите на GO.
ПРИМЕЧАНИЕ: SerialEM отправит электронное письмо для каждой серии наклона, либо успешное, либо ошибочное; ошибка, однако, может также означать, что полный диапазон наклона не был достигнут.
Representative Results
Эта процедура была использована для получения серии наклона Sars-Cov-2, описанной в Turonova et al. 202020; весь набор данных был получен с использованием трех различных сеток в течение трех сеансов микроскопии в EMBL Heidelberg. Текущее исследование будет сосредоточено на первом 3-дневном (~ 72 ч) сеансе с первой сеткой и описано.
После того, как вся сетка была нанесена на карту с низким увеличением (~10 мин, см. шаг 2), на карте сетки был выбран 71 подходящий квадрат, а также получены карты среднего увеличения(квадратные карты)с настройками (увеличение, экспозиция, расфокусировка), которые позволяют напрямую визуализировать и идентифицировать интересующий образец, коронавирусы в данном случае (см. шаг 4)(рисунок 1А). Время приобретения составило ~3 мин на квадрат, всего 3 ч 45 мин.
Как только была создана первая квадратная карта, на отдельном компьютере был открыт фиктивный экземпляр SerialEM (без какого-либо управления на камере или микроскопе) для визуализации квадратной карты и добавления точек на цели, подходящие для получения серии наклона (см. шаг 5)(рисунок 1B). Вновь полученные квадратные карты были получены путем слияния текущего фиктивного навигатора SerialEM с навигатором из приобретающего экземпляра SerialEM. После ~2 ч сбора и выбора квадрата сетки можно было определить 50 первоначальных целей.
После завершения сбора квадратной карты была настроена низкая доза SerialEM, а эталонные изображения View и Preview были взяты и сохранены в виде карт (см. шаг 3). Последние карты затем могут быть немедленно использованы на фиктивном экземпляре SerialEM для создания из соответствующих квадратных изображений карт карты Virtual View (рисунок 1C)и Virtual Preview (Рисунок 1D)50 выбранных целей с помощью пакета программного обеспечения PyEM для времени обработки ~ 30 минут (см. шаг 6). Это время обработки на сеансе SerialEM было использовано для выполнения окончательной подготовки микроскопа к получению: настройки энергетического фильтра, получения эталонного изображения новой камерой, выравнивания объектива без астигматизма и комы.
После завершения настройки микроскопа и создания виртуальных карт из 50 начальных целей был настроен фактический навигатор SerialEM, который будет использоваться для сбора (см. шаг 8), были установлены позиции фокусировки и трека (шаг 9), и можно было начать сбор серии наклона (см. шаги 10 и 11). Карты Virtual View (рисунок 1C)использовались для начального центрирования цели(рисунок 1E),за которым последовало окончательное центрирование, выполненное при фактическом увеличении захвата серии наклона(рисунок 1F)с использованием карты виртуального предварительного просмотра (рисунок 1D).
Начиная с картографирования сетки в 9:30 утра, приобретение серии наклона для 50 первоначальных целей началось примерно в 15:00. С настройками, используемыми для томографического сбора (см. ссылку для деталей), серия наклона заняла ~ 20 минут, чтобы получить, с достаточным количеством целей, чтобы затем пробежать всю ночь. Пока происходило приобретение, остальные квадратные карты можно было проверить и добавить больше целей, все еще отключенных через фиктивный экземпляр SerialEM. Еще 121 цель была выбрана среди оставшихся квадратных карт и добавлена в навигатор сбора SerialEM после создания виртуальных карт для этих новых целей, достаточно для работы до завершения 72-х сессии.
Эта процедура (обобщенная на рисунке 2)позволила за один рабочий день установить 171 мишень для автоматизированных томографических сборов за 72-ч (3 дня) сеанса микроскопа.
Рисунок 1:Пример квадратной карты с репрезентативными виртуальными картами и соответствующими приобретениями после центрирования. (A) Репрезентативная квадратная карта криоЭМ-сетки Sars-Cov-2, использованная в Turonova et al.20. Четыре области, представляющие интерес, отмечены красным крестом. Увеличение микроскопа составляет 2 250x. (B) Обрезать квадратную карту, выделив области, которые использовались для создания карт виртуального представления (оранжевый) и виртуального предварительного просмотра (желтый) для выбранной целевой карты (красный крест)(C)виртуальный вид. (D) Карта виртуального предварительного просмотра. (E) Получение фактического представления после центрирования с использованием карты виртуального представления в качестве ссылки. Увеличение микроскопа составляет 11 500x. (F) Получение наклона на 0° из серии наклона после центрирования с использованием карты виртуального предварительного просмотра в качестве эталона. Увеличение микроскопа составляет 64 000x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Рабочий процесс сеанса CryoET с использованием SerialEM с инструментами PyEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Из нишевой техники криоЭТ в настоящее время превратился в широко распространенный метод для выполнения структурных исследований на клеточном и молекулярном уровне с беспрецедентным достижимым разрешением21,22. Постоянно растущий спрос на криоЭМ-визуализацию создает нагрузку на ограниченные ресурсы, доступные для доступа к этой технологии. Несмотря на открытие ряда национальных установок криоЭМ и усилия научных институтов по наращиванию своего потенциала в области ТЕА для удовлетворения потребностей сообщества во всем мире, доступ к криоЭМ-приборам по-прежнему ограничен, и поэтому пользователи должны эффективно использовать время, имеемое для сбора данных, для максимального увеличения отдачи от каждого сеанса микроскопии. Необходимость получения сотен наклонных рядов в сочетании с ограниченным временем, доступным для сбора данных, потребовала новых процедур сбора изображений для достижения лучшей пропускной способности без ущерба для качества данных. Последние разработки в области аппаратного обеспечения и рабочих процессов обработки изображений значительно увеличили скорость захвата серий tilt18,19,что привело к резкому смещению соотношения между временем, затраченным на установку точки сбора, и временем, необходимым для фактического приобретения серии tilt. В целом, процедура создания точек сбора становится одним из основных узких мест для достижимой пропускной способности сеансов cryoET.
Оптимизированный протокол, представленный здесь, позволил нам настроить в режиме off-line 171 позицию для автоматического томографического сбора в течение первого дня сеанса криоЭТ, в то время как микроскоп активно участвовал в других операциях (например, квадратное картирование, настройка и автоматическое получение рядов наклона), таким образом, не влияя на время микроскопа, доступное для сбора данных. В дополнение к максимизации пропускной способности сеанса cryoET, этот конвейер значительно сокращает время, затрачиваемое пользователем на подготовительный этап сеанса автоматизированного сбора данных. В описанном протоколе пользователю предлагается просмотреть сопоставленные квадраты сетки, чтобы определить подходящие области, представляющие интерес, и добавить их в Serial EM Navigator в качестве точек сбора. Затем все цели будут автоматически обработаны пакетно в SerialEM инструментом PyEM для производства виртуальных карт16. Таким образом, представленный вычислительный подход значительно быстрее, чем получение реальных карт привязки, за счет устранения периодов ожидания, связанных с движением стадии, получением изображения, изменением условий изображения между просмотром и предварительным просмотром, а также путем возможного повторения этих шагов при центрировании при высоком увеличении. Кроме того, поскольку каждое полученное изображение приводит к накоплению электронной дозы на интересуемом объекте23,использование виртуальных карт для точной перестройки целей уменьшает радиационный ущерб, наносимый на подготовительном этапе сеанса криоЭТ перед фактическим получением серии наклона. Протокол, описанный здесь, использует виртуальные карты как промежуточного, так и высокого увеличения (Preview и View, соответственно) для перестройки цели перед получением серии наклона. Эта процедура может быть легко изменена для использования только промежуточного увеличения View image, когда точность выравнивания имеет меньшее значение, например, в случае крупных структур, где конечная точность цели имеет меньшее значение10, или для образцов анализа одиночных частиц, которые плохо распределены по криотрешетке, требуя ручного выбора пользователем каждой точки сбора24, 25 г. Наконец, подход, основанный на использовании в режиме онлайн фиктивного экземпляра SerialEM, также облегчает настройку точек сбора через удаленное соединение, сводя к минимуму необходимость физического присутствия пользователя у микроскопа, что обеспечивает большую гибкость с точки зрения оперативной организации объекта.
Последние достижения в области технологий и методов криоЭТ значительно повысили скорость и надежность автоматизированных сеансов сбора данных. Однако для решения остальных этапов ограничения скорости этого метода необходимы дальнейшие разработки. В частности, начальный этап картографирования сетки и квадратов в настоящее время становится одним из основных узких мест в настройке сеанса, что создает необходимость в аппаратных улучшениях, направленных на увеличение скорости движений ступени микроскопа и получения изображения прямыми электронными детекторами. Кроме того, разработка подходов машинного обучения для полной автоматизации процесса идентификации целей будет иметь решающее значение для устранения необходимости визуального осмотра пользователей для выбора интересующих регионов, что является трудоемкой процедурой, которая опирается на опыт пользователей.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы признаем поддержку со стороны Отдела структурной и вычислительной биологии и Центра электронной микроскопии в Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гейдельберге, Германия, и iNEXT-Discovery (номер проекта 871037). Мы чрезвычайно благодарны за отличную поддержку автору программного пакета SerialEM, профессору Дэвиду Мастронарде. Мы также благодарим Германа Фунга за критическое прочтение рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
References
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).
- Pfeffer, S., Mahamid, J. Unravelling molecular complexity in structural cell biology. Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).
- Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
- Bohning, J., Bharat, T. A. M. Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Wan, W., Briggs, J. A. G. Methods in Enzymology. 579, Elsevier. NY. 329-367 (2016).
- Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. Automated data collection in single particle electron microscopy. Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).
- Resch, G. P. Methods in Cell Biology. 152, Elseiver. NY. 135-178 (2019).
- Bharat, T. A., Kukulski, W. Correlative Imaging: Focusing on the Future. , John Wiley & Sons. NY. 137-153 (2019).
- Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
- O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , Springer, Cham. 95-116 (2018).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16, 471-477 (2019).
- Turonova, B., et al. Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology. Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).
- Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography. Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).
- Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition. Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).
- Turonova, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
- O'Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369 (6503), 554-557 (2020).
- Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å inside cells. Nature Methods. 18, 186-193 (2020).
- Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate. Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).
- Liberta, F., et al. Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids. Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).
- Radamaker, L., et al. Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis. Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).
