Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Strategier for optimalisering av kryogene elektrontomografidatainnhenting

Published: March 19, 2021 doi: 10.3791/62383
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Structural and Computational Biology Unit, European Molecular Biology Laboratory, 2Electron Microscopy Core Facility, European Molecular Biology Laboratory, 3Imaging Centre, European Molecular Biology Laboratory

Summary

Den økende etterspørselen etter storskala datainnsamling i kryogen elektrontomografi krever høy gjennomstrømningsrutiner for bildeinnhenting. Beskrevet her er en protokoll som implementerer den nylige utviklingen av avanserte anskaffelsesstrategier med sikte på å maksimere tidseffektiviteten og gjennomstrømningen av tomografisk datainnsamling.

Abstract

Kryogene elektrontomografi (cryoET) er en kraftig metode for å studere 3D-strukturen til biologiske prøver i nær-til-innfødt tilstand. Dagens toppmoderne kryoET kombinert med subtomogramgjennomsnittsanalyse muliggjør strukturell bestemmelse av makromolekylære komplekser med høy oppløsning som finnes i flere kopier innen tomografiske rekonstruksjoner. Tomografiske eksperimenter krever vanligvis at en stor mengde vippeserier anskaffes ved hjelp av avanserte transmisjonselektronmikroskoper med viktige driftskostnader. Selv om gjennomstrømningen og påliteligheten til automatiserte datainnsamlingsrutiner har blitt stadig bedre de siste årene, kan prosessen med å velge interesseområder der en tilt-serie skal anskaffes, enkelt automatiseres, og den er fortsatt avhengig av brukerens manuelle innspill. Derfor er oppsettet av en storskala datainnsamlingsøkt en tidkrevende prosedyre som kan redusere gjenværende mikroskoptid betydelig tilgjengelig for oppkjøp av vippeserier. Her beskriver protokollen de nylig utviklede implementeringene basert på SerialEM-pakken og PyEM-programvaren som forbedrer tidseffektiviteten til rutenettscreening og datainnsamling i stor skala tilt-serien betydelig. Den presenterte protokollen illustrerer hvordan du bruker SerialEM-skriptfunksjoner til å automatisere rutenetttilordning, grid square mapping og tilt-serieanskaffelse fullt ut. Videre beskriver protokollen hvordan du bruker PyEM til å velge flere anskaffelsesmål i frakoblet modus etter at automatisert datainnsamling er startet. For å illustrere denne protokollen beskrives programmet i sammenheng med avansert datainnsamling av Sars-Cov-2 tilt-serien. Den presenterte rørledningen er spesielt egnet til å maksimere tidseffektiviteten til tomografieksperimenter som krever et nøye utvalg av oppkjøpsmål og samtidig en stor mengde vippeserier som skal samles inn.

Introduction

Kryogene elektronmikroskopimetoder (cryoEM) er basert på avbildning av biologiske prøver ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop (TEM) etter deres raske vitrifisering, en prøveforberedelsesprosess som bevarer molekylære og cellulære strukturer av prøver i nær-til-innfødt og hydrert tilstand1,2. I kryogene elektrontomografi (cryoET) oppnås en 3D-modell av den vitrifiserte prøven ved å skaffe seg en rekke bilder av samme interesseområde fra forskjellige orienteringer, den såkalte tilt-serien, etterfulgt av beregningsrekonstruksjonen av det tomografiske volumet3. Denne avanserte bildeteknikken har modnet til en kraftig metode for strukturell undersøkelse av biologiske prosesser i sammenheng med deres opprinnelige cellemiljøer4,5,6.

I tillegg til den ultrastrukturelle analysen av den vitrifiserte prøven, kan høyoppløselige rekonstruksjoner av makromolekylære komplekser som er til stede i flere kopier i det tomografiske volumet oppnås ved å bruke subtomogramgjennomsnitt5. Denne rekonstruksjonsmetoden er basert på iterativ justering og gjennomsnitt av undervolumer som inneholder strukturen av interesse, og den er rettet mot å øke signal-til-støy-forholdet og oppløsningen av den endelige rekonstruksjonen7,8. Subtomogramgjennomsnitt er avhengig av innsamling og behandling av en stor mengde data som ofte krever innsamling av hundrevis av vippeserier ved hjelp av avanserte TEMer med onerøse driftskostnader.

For tiden er oppsettet av slike automatiserte cryoET-økter en tidkrevende prosess som vanligvis er avhengig av brukerens manuelle inngang9,10,11. Mål identifiseres vanligvis ved visuell inspeksjon av det tilordnede rutenettet og deretter settes opp for automatisert datainnsamling. Brukerens effektivitet i å identifisere oppkjøpspunkter påvirkes ofte av arten av prøven, og blir spesielt utfordrende når man analyserer rensede makromolekyler med suboptimal konsentrasjon eller i tilfelle sjeldne hendelser i overfylte cellulære miljøer, noe som innebærer bruk av korrelative tilnærminger12. Gjeldende arbeidsflyter krever dessuten anskaffelse av bilder under oppsett ved ulike forstørrelser som senere vil bli brukt til nøyaktig lokalisering og sentrering av målet under automatisert anskaffelse11,13,14. Disse trinnene for omjustering med høy presisjon er avgjørende for programmer med høy oppløsning, som krever at avbildningen utføres med høy forstørrelse og krever nøyaktige sentreringstrinn for å beholde interesseområdet innenfor det resulterende lille synsfeltet. Til sammen er flere timer av hver datainnsamlingsøkt forpliktet for denne tidkrevende prosedyren der TEM ikke er engasjert i tilt-serieanskaffelse. Derfor, avhengig av hvor mye vippeserie som kreves, kan identifisering og oppsett av anskaffelsespunkter ha en betydelig innvirkning på mikroskoptiden som er tilgjengelig for datainnsamling under en cryoET-økt.

Beskrevet her er en optimalisert protokoll basert på SerialEM programvarepakke15 og den nyeste versjonen PyEM programvare16 for å kartlegge rutenett, kartlegge rutenett firkanter, velge mål, og sette opp automatisert datainnsamling for storskala tilt serien samling. Hovedbegrepet for denne tilnærmingen er å gi SerialEM beregningsgenererte bilder av PyEM for hvert anskaffelseselement, kalt virtuelle kart, for nøyaktig lokalisering og sentrering av målet. For å få faktisk anskaffelsestid utføres valget av målene samt opprettelsen av de virtuelle kartene frakoblet ved hjelp av en annen dummy forekomst av SerialEM, og frakobling av utvelgelsesprosessen for anskaffelsesmål fra TEM-operasjoner. Selv om denne protokollen ikke adresserer hvordan du øker datakvaliteten13,17 eller hastigheten på tilt-seriens oppkjøp18,19, er denne protokollen først og fremst fokusert på strategier for å optimalisere tidseffektiviteten til oppsettet av automatiserte cryoET-økter i stor skala. Derfor er implementeringen av den presenterte protokollen ment for de forskerne som etablerer cryoET-datainnsamlingsarbeidsflyter som ønsker å maksimere utbyttet av automatisert datainnsamling ved å øke mikroskoptiden som er tilgjengelig for oppkjøp av tilt-serier.

Protocol

Protokollen som er beskrevet her, er en del av et mer omfattende dokument produsert av EMBL CryoEM Service Platform som inkluderer grundige trinnvise instruksjoner og skjermbilder som illustrerer hele prosedyren for en typisk cryoET-økt, inkludert prøvelasting, rutenetttilordning, mikroskopjustering, oppsett av anskaffelsespunkter og automatisert datainnsamling. Den fullstendige protokollen kan lastes ned på følgende kobling: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download

1. Forutsetninger

  1. Installer SerialEM versjon 3.8 og konfigurer for å kontrollere mikroskopet og detektoren (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm).
  2. Installer en dummy forekomst av SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).
  3. Installere PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).

2. Kartlegging av rutenett

  1. Legg en kassett med gitter i mikroskopets autoloader.
  2. Definer bildebetingelser som passer for tilordning av hele rutenettet. Gjør dette med lavest mulig forstørrelse med tanke på synsfeltet på detektoren som brukes (EFTEM SA 2250x). Lagre bildeforholdene som en SerialEM Imaging-tilstand for å gjøre ting praktisk for senere bruk.
  3. Sett opp full montasje
    1. Åpne SerialEM Navigator-menyen.
    2. Velg Montasje og rutenett.
    3. Velg Definer full montasje.
  4. Start skriptet Grid_Mapping. La skriptet vente til autoloaderen er avkjølt. utfør en innholdsliste, og tilordne deretter hvert rutenett som lagerprosedyren fant. Skriv inn en e-post via Tilt Series Menu for å la skriptet enkelt sende en e-post når du er ferdig.
  5. Lagre navigatør.
  6. Undersøk alle rutenettkart fra SerialEM Navigator, og velg hvilket rutenett som skal tilordnes ytterligere ved høyere forstørrelse.
    MERK: Mange TEMer som er utstyrt med et autoloader-system, viser en rotasjon av rutenettet når de lastes inn på nytt. Det er best å tilordne et rutenett på nytt etter at du har lastet det inn på nytt. Alternative systemer lider vanligvis bare noen skift, som kan korrigeres i SerialEM med en Shift To Marker-prosedyre.

3. Sett opp SerialEM lav dose

  1. Angi forstørrelsen av serialem lavdosevisnings- og forhåndsvisningsmodus (dette kreves for trinn 6).
  2. Skaff deg et visningsbilde, og lagre det som et kart i navigatøren.
  3. Skaff deg et forhåndsvisningsbilde, og lagre det som et kart i navigatøren.
    1. Sett begge modiene til samme binning (binning 4 foreslås). Dette gjør det mulig å lagre de to kartene i én bildestakk.
    2. I vinduet SerialEM Navigator endrer du etiketten for Vis-kartet til Vis og etiketten for forhåndsvisningskartet til Forhåndsvisning.
    3. Lagre og lukk navigatørfilen.
      MERK: Ingen mål er nødvendig for de første visnings- og forhåndsvisningsbildene, PyEM vil bare bruke bildeinnstillingene.

4. Rutekartlegging av rutenett

  1. Definer bildeforholdene for å tilordne rutenettsnr firkanter. Det er av stor betydning å kunne se utvalget av interesse og den fiducial perlefordelingen. Hvis du vil sikre optimal kontrast for rutekart for rutenett, utfører du følgende trinn.
    1. Sett inn en objektiv blenderåpning.
    2. Sett eventuelt inn energifilterspalten.
    3. Bruk en defokus på -100 μm.
  2. Skjerm for gode rutenett firkanter egnet for videre kartlegging. Etter visuell inspeksjon av rutene fra rutenettkartet, ta testbilder av torget med bildeforholdene som skal brukes til rutenett firkantede kart.
  3. Når en god firkant identifiseres, markerer du midten i rutenettkartbildet ved hjelp av funksjonen Legg til punkt i SerialEM Navigator.
  4. Når alle punktene er lagt til, trykker du SKIFT + A på det første punktet i SerialEM Navigator, og deretter trykker du SKIFT + A på det siste punktet.
    MERK: Alle poeng som er lagt til, er nå merket med A, noe som betyr at de alle er anskaffelsespoeng.
  5. Trykk SKIFT + N (opprett en ny fil på elementet) på det første punktet og deretter på nytt på det siste punktet. Velg Monterte bilderi dialogboksen som vises.
  6. Når montasjedialogboksen dukker opp, konfigurerer du en montasjestørrelse som dekker ett rutenett. Dette avhenger av forstørrelsen og maskestørrelsen på rutenettene som brukes, og krever vanligvis 2 x 2 til 4 x 4 montasjer. Gi det et navn med et nummer (f.eks. squaremap_01.mrc) slik at SerialEM enkelt kan nummerere alle filene per rutenettstorg automatisk.
  7. Start rutenetttilordningen ved å åpne SerialEM Navigator -menyen og klikk Hent at-elementer.
  8. Velg følgende alternativer på hurtigmenyen.
    1. Velg Grov eusentrisitet.
    2. Velg Hent kartbilde.
    3. Velg Lukk kolonneventiler på slutten.
    4. Velg Send e-post på slutten.

5. Velge målene

  1. Åpne en dummy SerialEM-forekomst. Dette kan konfigureres på SerialEM-PCen som styrer mikroskopet eller på en annen (støtte) PC hvis begge datamaskinene deler en nettverkstilkobling.
  2. Når den første rutenettplassen er tilordnet, bruker du menyalternativet SerialEM Navigator til å se montasjen i den midlertidige SerialEM-forekomsten.
  3. Dobbeltklikk navigatørvinduet for å åpne rutenettets firkantede kart.
  4. Søk på kartet og bruk alternativet dummy SerialEM Navigator Add Points for å legge til bildeanskaffelsespunkter på målet av interesse.
  5. Når du er ferdig og etter tilordning av de nye rutene, lagrer du navigatørfilen og fletter navigatøren på nytt. fortsette til alle rutenettsnredlene er tilordnet.

6. Generer virtuelle kart

  1. Slå igjen sammen navigatørfilen med den midlertidige SerialEM-forekomsten.
  2. Kjør PyEM Virtual Maps-skript fra dummy SerialEM-menyen, Verktøy og velg Virtual Anchor Maps. Dette kan ta litt tid, avhengig av størrelsen og mengden av rutenettets firkantede kart og binning av Vis- og Forhåndsvisning-kartene.
    MERK: PyEM starter et kommandovindu som automatisk lukkes når det er gjort, så kan den nye navigatørfilen åpnes. Per montert kart som inneholder valgte punkter, skriver PyEM ett enkelt sammenslått kart og alle vis- og forhåndsvisningskartene. Til slutt skriver den en ny Navigator-fil kalt <navigatorfilename>_automaps.nav.

7. Mikroskop tuning

  1. Kontroller mikroskopjusteringen. For å sikre riktig mikroskopytelse, bruk samme forstørrelses- og strålestørrelsesoppsett for datainnsamling i følgende rekkefølge.
    1. Kjør SeriaLEM Coma-free justering av CTF (Zemlin tableau).
    2. Sett inn og midtstill en objektiv blenderåpning.
    3. Kjør SerialEM Correct Astigmatism av CTF (auto-stigmate).
    4. Kjør GIF Quick Tune (dvs. bare spaltefokus).
      MERK: Ettersom trinn 7.1.1, 7.1.3 og 7.1.4 kan kreve mer doseringshastighet, bør bare spotstørrelsen endres; bjelkestørrelsen bør ikke endres, da dette fører til strålevinkel, noe som gjør justeringene feil. Trinn 7.1.1, 7.1.2 og 7.1.3 er halvautomatisert i dette offentlig tilgjengelige skriptet (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).

8. Sett opp navigatør

  1. Åpne den nye navigatørfilen med navnet _automaps.navi SerialEM.
    MERK: V_yyyy er vis kartene, og P_yyyy er forhåndsvisningskartene. Forhåndsvisningstilordningene angis som anskaffelsespunkter.
  2. Fjern merket for alle A-punkter i SerialEM Navigator-vinduet, merk det første V_yyyy kartet, velg Skjul, klikk A to ganger, og fjern merket for Skjul.
  3. Merk den første V_yyyy posisjonen, trykk SKIFT + T, velg deretter den aller siste V_yyyy posisjon, og trykk SKIFT + T på nytt.
  4. Velg Enkeltbildebilder i egenskapene til filen som skal åpnes.
  5. I den neste dialogboksen Filegenskaper velger du de ønskede parameterne i henhold til bildebehandlingsbehovene og instrumentoppsettet.
  6. Når du blir bedt om det, gir du et navn med et nummer (f.eks. TS_001.mrc) og klikker Lagre.
    MERK: SerialEM nummererer automatisk filnavnene for alle vippeseriene.
  7. Sett opp vippeseriekontrolleren for den første TS-posisjonen. Når du er ferdig, klikker du ok for å angi disse parameterne for alle vippeserier etter denne anskaffelsesvaren. Alle forhåndsvisningstilordninger er nå valgt som TS (Tilt Series) med nummerert filnavn TS_xxx.mrc.
    MERK: Man kan endre parametrene manuelt senere ved hjelp av Navigator TSparams-funksjonen; Endringer vil bli brukt for alle elementer nedover i listen. Brukeren har muligheten til å kjøre et egendefinert skript i stedet for vippeserien.

9. Still inn fokus/sporposisjoner

  1. Still inn fokus/sporavstand for hvert mål om nødvendig (kontroller at SerialEM Low Dose er slått på).
  2. Dobbeltklikk på Vis kart for å laste det inn.
  3. Velg Forhåndsvis kart i Navigatør -listen.
  4. Velg Rediger fokus i navigatørvinduet.
  5. I kontrollpanelet Med lav dose fjerner du merket for Roter akse mellom områder for å plassere Prøv og fokus langs trinnvinkelaksen.
  6. Klikk på ønsket område i det lastede visningskartet for å angi fokus / prøveposisjon for denne vippeserien.
  7. Kontroller at TSP for navigatørelementet er angitt nå. gjenta prosedyren for alle elementene.
    MERK: Fokus-/sporposisjoner kopieres automatisk nedover i navigatøren. Hvis fokus-/sporposisjonen for forrige element er på riktig side og av riktig avstand, er det derfor ikke nødvendig å endre den for gjeldende element.

10. Sett opp flere skript

  1. To skript håndterer fokusområdet: pretomo og undertomo. Pretomo-skriptet kjøres før hver tilt-serie og undertomo-skriptet under hver tilt.
  2. Rediger fokusområdet i skriptpretomo.
  3. På menyen SerialEM Tilt Series merker du av for Kjør skript i TS og velger skriptnummeret for undertomo-skriptet.

11. Løp

  1. Kontroller nitrogentanknivået.
  2. Kontroller om Autoloader turbo off er valgt.
  3. Kontroller ledig plass for datalagring.
  4. Fjern merket for kontinuerlig lagring for loggfilen på SerialEM-filmenyen, og lukk alle åpne loggfiler. Hver vippeserie får sin egen loggfil.
  5. Klikk Hent på elementerpå Navigator -menyen.
  6. Kjør skriptet PreTomo.
  7. Velg Primær oppgave Hent vippeserie.
  8. Velg Kjør skript etter PostTomo.
  9. Velg Lukk kolonneventiler på slutten.
  10. Velg Send e-post på slutten.
  11. Klikk på GO.
    MERK: SerialEM vil sende en e-post per vippeserie, enten vellykket eller feil; feilen kan imidlertid også bety at hele vippeområdet ikke ble nådd.

Representative Results

Denne prosedyren ble brukt til å skaffe Sars-Cov-2 tilt-serien beskrevet i Turonova et al. 202020; Hele datasettet ble produsert ved hjelp av tre forskjellige rutenett over tre mikroskopiøkter ved EMBL Heidelberg. Den nåværende studien vil fokusere på og beskrive den første 3-dagers (~ 72 h) økten som kjøres med det første rutenettet.

Etter at hele rutenettet ble kartlagt ved lav forstørrelse (~10 min, se trinn 2), ble 71 egnede firkanter valgt på rutenettkartet, og middels forstørrelseskart (firkantede kart) ble anskaffet med innstillinger (forstørrelse, eksponering, defokus) som muliggjør direkte visualisering og identifisering av utvalget av interesse, koronavirus i dette tilfellet (se trinn 4) (Figur 1A). Anskaffelsestiden var ~ 3 min per kvadrat, 3 h 45 min totalt.

Så snart det første firkantede kartet ble opprettet, ble en dummy SerialEM-forekomst (uten kontroll på kamera eller mikroskop) åpnet på en egen datamaskin for å visualisere firkantkartet og legge til punkter på mål som passer for oppkjøp av vippeserier (se trinn 5) (Figur 1B). Nyervervede firkantede kart ble hentet ved å slå sammen den gjeldende dummy SerialEM-navigatøren med navigatøren fra den anskaffende SerialEM-forekomsten. Etter ~2 t med grid square oppkjøp og utvelgelse, kunne 50 opprinnelige mål identifiseres.

Etter at de firkantede kartanskaffelsene var ferdige, ble SerialEM lavdose satt opp og referanse View and Preview-bilder ble tatt og lagret som kart (se trinn 3). De sistnevnte kartene kan deretter brukes umiddelbart på dummy SerialEM-forekomsten for å generere, fra de tilsvarende firkantede kartbildene, Virtual View (Figur 1C) og Virtual Preview (Figur 1D) kart over de 50 valgte målene med PyEM-programvarepakken, for en behandlingstid på ~ 30 min (se trinn 6). Denne behandlingstiden på dummy SerialEM-økten ble brukt til å utføre endelige forberedelser av mikroskopet for oppkjøp: energifilterjustering, ny kameragevinstbildeanskaffelse, astigmatisme- og komafri justering av objektivet.

Når mikroskopjusteringen var fullført og virtuelle kart fra de 50 opprinnelige målene som ble generert, ble den faktiske SerialEM-navigatøren som skulle brukes til anskaffelse, satt opp (se trinn 8), fokus- og sporposisjoner ble angitt (trinn 9), og oppkjøp av vippeserier kunne startes (se trinn 10 og 11). Virtual View-kartene (figur 1C) ble brukt til en innledende sentrering av målet ( Figur1E) etterfulgt av en endelig sentrering utført ved den faktiske tilt-serieanskaffelsesforstørrelsen (Figur 1F) ved hjelp av virtual preview-kartet (figur 1D).

Fra og med rutenettkartlegging klokken 9:30 om morgenen startet oppkjøpet av tilt-serien for de 50 opprinnelige målene omtrent klokken 15:00. Med innstillingene som brukes for tomografisk oppkjøp (se referanse for detaljer), tok en tilt-serie ~ 20 min å skaffe seg, med nok mål til å løpe gjennom hele natten. Mens oppkjøpet kjørte, kunne resten av de firkantede kartene inspiseres og flere mål legges til, fortsatt frakoblet via dummy SerialEM-forekomsten. 121 flere mål ble valgt blant de gjenværende firkantede kartene og lagt til oppkjøpet SerialEM navigator etter at virtuelle kart var opprettet for disse nye målene, nok til å kjøre til ferdigstillelse av 72 h-økten.

Denne prosedyren (oppsummert i figur 2) tillot, i en enkelt arbeidsdag, oppsettet av 171 mål for automatiserte tomografiske oppkjøp for en 72 timers (3 dager) mikroskopøkt.

Figure 1
Figur 1: Eksempel på firkantet kart med representative virtuelle kart og tilsvarende oppkjøp etter sentrering. (A) Representativt firkantet kart over et Sars-Cov-2 cryoEM-rutenett som brukes i Turonova et al.20. Fire interesseområder er merket med et rødt kors. Mikroskopforstørrelse er 2250x. (B) Beskjær ut av det firkantede kartet som uthever områdene som ble brukt til å generere virtual view-kart (oransje) og virtuell forhåndsvisning (gul) for det valgte målet (Røde kors) (C) Virtual View-kartet. (D) Virtuelt forhåndsvisningskart. (E) Faktisk visning etter sentrering ved hjelp av Virtual View-kartet som referanse. Mikroskopforstørrelse er 11.500x. (F) 0° tilt oppkjøpet fra vippeserien etter sentrering ved hjelp av Virtual Preview-kartet som referanse. Mikroskopforstørrelse er 64 000x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyt forCryoET-økt ved hjelp av SerialEM med PyEM-verktøy. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Fra en nisjeteknikk har cryoET nå modnet til en utbredt metode for å utføre strukturelle studier på cellulært og molekylært nivå med enestående nåbar oppløsning21,22. Den stadig økende etterspørselen etter cryoEM-avbildning har lagt en belastning på de begrensede ressursene som er tilgjengelige for å få tilgang til denne teknologien. Til tross for åpningen av en rekke nasjonale cryoEM-anlegg og vitenskapelige institutters innsats for å øke TEM-kapasiteten for å støtte samfunnets behov over hele verden, er tilgangen til cryoEM-instrumenter fortsatt begrenset, og tiden som er tilgjengelig for datainnsamling, må derfor effektivt brukes av brukerne for å maksimere utbyttet av hver mikroskopiøkt. Behovet for å skaffe hundrevis av vippeserier kombinert med den begrensede tiden som er tilgjengelig for datainnsamling, krevde nye bildeinnsamlingsrutiner for å oppnå bedre gjennomstrømning uten at det gikk ut over datakvaliteten. Den siste utviklingen i maskinvare- og bildearbeidsflyter har økt hastigheten på oppkjøpet av tilt-serienbetydelig 18,19, noe som resulterer i et dramatisk skifte av forholdet mellom tid brukt til å sette opp et anskaffelsespunkt og tid som trengs for selve tiltserieanskaffelsen. Til sammen blir prosedyren for å sette opp oppkjøpspunkter en av de store flaskehalsene for oppnåelig gjennomstrømning av cryoET-økter.

Den optimaliserte protokollen som presenteres her, gjorde det mulig for oss å sette opp, i off-line-modus, 171 posisjoner for automatisert tomografisk oppkjøp i løpet av den første dagen av en cryoET-økt mens mikroskopet var aktivt engasjert i andre operasjoner (f.eks. firkantet kartlegging, tuning og automatisert tiltserieinnhenting), og dermed uten å påvirke mikroskoptiden som er tilgjengelig for datainnsamling. I tillegg til å maksimere gjennomstrømningen til en cryoET-økt, reduserer denne rørledningen drastisk tiden brukeren investerer i den forberedende fasen av en automatisert datainnsamlingsøkt. I den beskrevne protokollen blir brukeren bedt om å bla gjennom de tilordnede rutenettplassene for å identifisere passende interesseområder og legge dem til i Serial EM Navigator som anskaffelsespunkter. Alle mål behandles deretter automatisk satsvis i SerialEM av PyEM -verktøyet for produksjon av de virtuelle kartene16. Den presenterte beregningsmetoden er derfor betydelig raskere enn å anskaffe reelle forankringskart ved å eliminere ventetidene knyttet til scenebevegelse, bildeanskaffelse, endring av bildeforhold mellom View og Preview, og ved den endelige gjentakelsen av disse trinnene mens du sentrerer deg ved høy forstørrelse. I tillegg, som hvert ervervet bilde fører til akkumulering av elektrondose på gjenstand for interesse23, reduserer bruken av virtuelle kart for nøyaktig omstilling av målene strålingsskaden som ble introdusert i den forberedende fasen av en cryoET-økt før selve tiltserieanskaffelsen. Protokollen som er beskrevet her, bruker både mellomliggende og høye forstørrelses virtuelle kart (henholdsvis Forhåndsvisning og Visning) for omjustering av målet før tilt-serieanskaffelse. Denne prosedyren kan enkelt endres for å bare bruke mellomliggende forstørrelse Vis bilde når justeringsnøyaktighet er av mindre betydning, for eksempel når det gjelder store strukturer der endelig målnøyaktighet er mindrebekymringsfullt 10 eller for enkeltpartikkelanalyseprøver som er dårlig spredt på kryo-rutenettet som krever brukerens manuelle valg av hvert anskaffelsespunkt24, 25. Til slutt, en tilnærming basert på off-line bruk av en dummy SerialEM forekomst letter også oppsett av oppkjøpspunkter gjennom ekstern tilkobling ved å minimere behovet for fysisk tilstedeværelse av brukeren på mikroskopet, og dermed muliggjør mer fleksibilitet når det gjelder operasjonell organisering av anlegget.

De siste fremskrittene innen teknologi og metoder for cryoET har forbedret hastigheten og påliteligheten til automatiserte datainnsamlingsøkter drastisk. Videre utvikling er imidlertid nødvendig for å håndtere de gjenværende rentebegrensende trinnene i denne metoden. Spesielt er det første trinnet i rutenett og firkantet kartlegging nå blitt en av de store flaskehalsene i øktoppsettet, og genererer dermed behovet for maskinvareforbedringer med sikte på å øke hastigheten på mikroskopstadiumbevegelser og bildeanskaffelse av de direkte elektrondetektorene. I tillegg vil utviklingen av maskinlæringsmetoder for å automatisere prosessen med målidentifikasjon være avgjørende for å eliminere behovet for brukernes visuelle inspeksjon for å velge regionene av interesse, en tidkrevende prosedyre som er avhengig av brukernes ekspertise.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi anerkjenner støtte fra structural and computational Biology Unit og Electron Microscopy Core Facility ved European Molecular Biology Laboratory i Heidelberg, Tyskland og fra iNEXT-Discovery (prosjektnummer 871037). Vi er ekstremt takknemlige for den utmerkede støtten fra forfatteren av SerialEM-programvarepakken, professor David Mastronarde. Vi takker også Herman Fung for den kritiske lesningen av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission Electron Microscope Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
  2. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  3. Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).
  4. Pfeffer, S., Mahamid, J. Unravelling molecular complexity in structural cell biology. Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).
  5. Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
  6. Bohning, J., Bharat, T. A. M. Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).
  7. Briggs, J. A. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  8. Wan, W., Briggs, J. A. G. Methods in Enzymology. 579, Elsevier. NY. 329-367 (2016).
  9. Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. Automated data collection in single particle electron microscopy. Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).
  10. Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).
  11. Resch, G. P. Methods in Cell Biology. 152, Elseiver. NY. 135-178 (2019).
  12. Bharat, T. A., Kukulski, W. Correlative Imaging: Focusing on the Future. , John Wiley & Sons. NY. 137-153 (2019).
  13. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  14. O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , Springer, Cham. 95-116 (2018).
  15. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  16. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16, 471-477 (2019).
  17. Turonova, B., et al. Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology. Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).
  18. Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography. Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).
  19. Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition. Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).
  20. Turonova, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
  21. O'Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369 (6503), 554-557 (2020).
  22. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å inside cells. Nature Methods. 18, 186-193 (2020).
  23. Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate. Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).
  24. Liberta, F., et al. Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids. Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).
  25. Radamaker, L., et al. Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis. Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).

Tags

Biologi Utgave 169 kryogen elektrontomografi automatisering høy gjennomstrømning PyEM SerialEM
Strategier for optimalisering av kryogene elektrontomografidatainnhenting
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb,… More

Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition. J. Vis. Exp. (169), e62383, doi:10.3791/62383 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter