Summary
Kriyojenik elektron tomografisinde büyük ölçekli veri toplama için artan talep, yüksek verimli görüntü alma rutinleri gerektirir. Burada açıklanan, tomografik veri toplamanın zaman verimliliğini ve verimini en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan gelişmiş satın alma stratejilerinin son gelişmelerini uygulayan bir protokoldür.
Abstract
Kriyojenik elektron tomografisi (cryoET), biyolojik örneklerin 3D yapısını yerliye yakın bir durumda incelemek için güçlü bir yöntemdir. Mevcut son teknoloji cryoET, subtomogram ortalama analizi ile birlikte tomografik rekonstrüksiyonlarda birden fazla kopyada bulunan makromoleküler komplekslerin yüksek çözünürlüklü yapısal belirlenmesini sağlar. Tomografik deneyler genellikle önemli operasyonel çalışma maliyetlerine sahip üst düzey iletim elektron mikroskopları ile çok miktarda eğim serisinin elde edilmesini gerektirir. Otomatik veri toplama rutinlerinin aktarım hızı ve güvenilirliği son yıllarda sürekli olarak iyileşse de, bir eğim serisinin edinileceği ilgi alanlarını seçme süreci kolayca otomatikleşemez ve yine de kullanıcının manuel girişine dayanır. Bu nedenle, büyük ölçekli bir veri toplama oturumunun kurulumu, eğim serisi alımı için mevcut kalan mikroskop süresini önemli ölçüde azaltabilen zaman alıcı bir yordamdır. Burada protokol, SerialEM paketine ve pyem yazılımına dayalı olarak geliştirilen ve ızgara taraması ve büyük ölçekli eğim serisi veri toplamanın zaman verimliliğini önemli ölçüde artıran uygulamaları açıklar. Sunulan protokol, kılavuz eşleme, ızgara kare eşleme ve eğim serisi alımını tam olarak otomatikleştirmek için SerialEM komut dosyası işlevlerinin nasıl kullanılacağını gösterir. Ayrıca, protokol, otomatik veri toplama başlatıldıktan sonra devre dışı modda ek alım hedefleri seçmek için PyEM'in nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokolü göstermek için, Sars-Cov-2 tilt serisinin üst düzey veri toplama bağlamındaki uygulaması açıklanmıştır. Sunulan boru hattı, özellikle satın alma hedeflerinin dikkatli bir şekilde seçilmesini ve aynı zamanda çok miktarda eğim serisinin toplanmasını gerektiren tomografi deneylerinin zaman verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için uygundur.
Introduction
Kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) yöntemleri, örneklerin moleküler ve hücresel yapılarını yerliye yakın ve hidratlı durumda koruyan bir numune hazırlama işlemi olan hızlı vitrifikasyonlarından sonra bir iletim elektron mikroskobu (TEM) ile biyolojik örneklerin görüntülenmesine dayanmaktadır1,2. Kriyojenik elektron tomografisinde (cryoET) vitrifiye numunenin 3D modeli, farklı yönelimlerden aynı ilgi bölgesinin bir dizi görüntüsü elde ederek elde edilir, eğim serisi olarak adlandırılır, ardından tomografik hacmin hesaplamalı rekonstrüksiyonu3. Bu gelişmiş görüntüleme tekniği, biyolojik süreçlerin yerel hücresel ortamları bağlamında yapısal olarak araştırılması için güçlü bir yönteme dönüştü4,5,6.
Vitrifiye numunenin ultrayapısal analizine ek olarak, tomografik hacim içinde birden fazla kopyada bulunan makromoleküler komplekslerin yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonları, ortalama5subtomogram uygulanarak elde edilebilir. Bu yeniden yapılandırma yaklaşımı, ilgi yapısını içeren alt hacimlerin yinelemeli hizalanmasına ve ortalamasına dayanır ve sinyal-gürültü oranını ve nihai yeniden yapılandırmanın çözünürlüğünü artırmayı amaçlamaktadır7,8. Subtomogram ortalaması, genellikle üst düzey TEM'ler ve çok sayıda operasyonel çalışma maliyeti ile yüzlerce eğim serisinin alınmasını gerektiren büyük miktarda verinin toplanmasına ve işlenmesine dayanır.
Şu anda bu tür otomatik cryoET oturumlarının kurulumu, genellikle kullanıcının manuel girişi9, 10,11'edayanan zaman alıcı bir işlemdir. Genellikle, hedefler eşlenen kılavuzun görsel incelemesiyle tanımlanır ve daha sonra otomatik veri toplama için ayarlanır. Kullanıcının alım noktalarını belirlemedeki verimliliği genellikle numunenin doğasından etkilenir, özellikle saflaştırılmış makromolekülleri yetersiz konsantrasyonla analiz ederken veya kalabalık hücresel ortamlarda nadir olaylar olduğunda, korelatif yaklaşımların kullanıldığını ima ederken zorlayıcı hale gelir12. Ayrıca, mevcut iş akışları, daha sonra otomatik edinme sırasında hedefin hassas yerelleştirilmesi ve merkezlenmesi için kullanılacak çeşitli büyütmelerde kurulum sırasında görüntülerin alınmasını gerektirir11,13,14. Bu yüksek hassasiyetli yeniden hizalama adımları, görüntülemenin yüksek büyütmede gerçekleştirilmesini gerektiren ve ortaya çıkan küçük görüş alanında ilgi alanını korumak için doğru merkezleme adımları gerektiren yüksek çözünürlüklü uygulamalar için çok önemlidir. Tem'in eğim serisi alımıyla meşgul olmadığı bu zaman alıcı prosedür için her veri toplama seansının birkaç saati taahhüt edilir. Bu nedenle, gereken eğim serisinin miktarına bağlı olarak, alım noktalarının tanımlanması ve kurulması, bir cryoET oturumu sırasında veri toplama için mevcut mikroskop süresi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir.
Burada açıklanan, gridleri haritalamak, ızgara karelerini eşlemek, hedefleri seçmek ve büyük ölçekli eğim serisi koleksiyonu için otomatik veri toplamayı ayarlamak için SerialEM yazılım paketi15 ve pyem yazılım16'nın en son sürümüne dayalı optimize edilmiş bir protokoldür. Bu yaklaşımın temel konsepti, Hedefin doğru yerelleştirilmesi ve ortalanması için sanal haritalar olarak adlandırdığı her edinme öğesi için PyEM tarafından hesaplamalı olarak oluşturulan görüntüler sağlamaktır. Gerçek satın alma süresi kazanmak için, hedeflerin seçimi ve sanal haritaların oluşturulması, SerialEM'in ikinci bir kukla örneği kullanılarak devre dışı gerçekleştirilir ve TEM operasyonlarından satın alma hedeflerinin seçim süreci ayrılırken. Veri kalitesinin nasıl artırılacağı ele alınmamakla birlikte13,17 veya eğim serisi edinme hızı18,19, bu protokol öncelikle büyük ölçekli otomatik cryoET oturumları kurulumunun zaman verimliliğini optimize etmek için stratejilere odaklanmıştır. Bu nedenle, sunulan protokolün uygulanması, tilt serisi alımı için mevcut mikroskop süresini artırarak otomatik veri toplama verimini en üst düzeye çıkarmak isteyen cryoET veri toplama iş akışları kuran bilim adamları içindir.
Protocol
Burada açıklanan protokol, EMBL CryoEM Hizmet Platformu tarafından üretilen ve örnek yükleme, ızgara haritalama, mikroskop ayarlama, alım noktalarının kurulumu ve otomatik veri toplama dahil olmak üzere tipik bir cryoET oturumunun tüm prosedürünü gösteren kapsamlı adım adım talimatlar ve ekran görüntüleri içeren daha kapsamlı bir belgenin parçasıdır. Protokolün tamamı aşağıdaki bağlantıdan indirilebilir: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download
1. Önkoşullar
- SerialEM sürüm 3.8'i yükleyin ve mikroskobu ve dedektörü (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm) kontrol etmek için ayarlayın.
- SerialEMversion 3.8'in (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html) sahte bir örneğini yükleyin.
- PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem) yükleyin.
2. Izgara eşleme
- Mikroskop otomatik yükleyicisine ızgaralı bir kaset yükleyin.
- Tüm ızgarayı eşlemek için uygun görüntüleme koşullarını ayarlayın. Bunu, kullanılan dedektördeki görüş alanını (EFTEM SA 2250x) dikkate alarak mümkün olan en düşük büyütmede yapın. İşleri daha sonra kullanmak üzere uygun hale getirmek için görüntüleme koşullarını SerialEM Görüntüleme Durumu olarak kaydedin.
- Tam montaj ayarlama
- SerialEM Gezgini menüsünü açın.
- Montaj ve Izgaralar 'ıseçin.
- Tam Montajı Ayarla 'yıseçin.
- Komut dosyasını Grid_Mappingbaşlatın. Komut dosyasının otomatik yükleyicinin soğumasını beklemesine izin ver; bir stok yapın ve ardından stok yordamın bulduğu her ızgarayı eşleyin. Komut dosyasının bittiğinde kolayca bir e-posta göndermesine izin vermek için Tilt Serisi Menüsü aracılığıyla bir e-posta girin.
- Gezgin'ikurtarın.
- SerialEM Gezgini'ndeki tüm ızgara haritalarını inceleyin ve daha yüksek büyütmede hangi ızgaranın daha fazla eşleneceğini seçin.
NOT: Otomatik doldurucu sistemiyle donatılmış birçok TEM, yeniden yüklendiğinde ızgaranın dönüşünü gösterir. Yeniden yükledikten sonra herhangi bir ızgarayı yeniden eşlemek en iyisidir. Alternatif sistemler genellikle SerialEM'de İşaretleyiciye Kaydırma prosedürü ile düzeltilebilen bazı kaymalara maruz kalır.
3. SerialEM düşük dozunu ayarlayın
- SerialEM düşük doz Görünüm ve Önizleme modlarının büyütmesini ayarlayın (bu adım 6 için gereklidir).
- Bir Görünüm görüntüsü alın ve gezginde harita olarak kaydedin.
- Önizleme görüntüsü alın ve Gezgin'de harita olarak kaydedin.
- Her iki modu da aynı binning'e ayarlayın (binning 4 önerilir). Bu, iki haritayı tek bir görüntü yığınına kaydetmenizi sağlar.
- SerialEM Gezgini penceresinde, Görünüm eşlemesinin etiketini Görünüm olarak ve Önizleme eşlemesinin etiketini Önizlemeolarak değiştirin.
- Gezgin dosyasını kaydedin ve kapatın.
NOT: İlk Görüntüleme ve Önizleme görüntüleri için hedefe gerek yoktur, PyEM yalnızca görüntüleme ayarlarını kullanır.
4. Izgara kare haritalama
- Izgara karelerini eşlemek için görüntüleme koşullarını ayarlayın. İlgi örneğini ve fidüyal boncuk dağılımını görebilmek büyük önem taşımaktadır. Izgara kare haritaları için en iyi karşıtlığı sağlamak için aşağıdaki adımları uygulayın.
- Objektif bir diyafram takın.
- Varsa, enerji filtresi yarık yerleştirin.
- -100 μm'lik bir defocus kullanın.
- Daha fazla haritalama için uygun iyi ızgara kareleri için ekran. Izgara haritasından karelerin görsel incelemesinin ardından ızgara kare haritaları için kullanılacak görüntüleme koşulları ile karenin test görüntülerini alın.
- İyi bir kare tanımlandığında, SerialEM Gezgini'nin Puan Ekle özelliğini kullanarak ızgara haritası görüntüsünde merkezini işaretleyin.
- Tüm noktalar eklendikten sonra, SerialEM Gezgini'nde ilk noktada Shift + A tuşlarına basın, ardından son noktada Shift + A tuşlarına basın.
NOT: Eklenen tüm noktalar artık A ile işaretlenmiştir, yani hepsi Edinme Puanıdır. - İlk noktada Shift + N (öğede yeni bir dosya oluştur) tuşuna basın ve sonra son noktada tekrar basın. Gelen iletişim kutusunda Montajlı Görüntüler 'iseçin.
- Montaj iletişim kutusu açılırken, bir ızgara karesini kapsayan bir montaj boyutu ayarlayın. Bu, kullanılan ızgaraların büyütmesine ve ağ boyutuna bağlıdır ve genellikle 2 x 2 ila 4 x 4 montaj gerektirir. SerialEM'in ızgara karesi başına tüm dosyaları kolayca otomatik olarak numaralandırmasına izin vermek için bir numara (örneğin, squaremap_01.mrc) içeren bir ad verin.
- SerialEM Gezgini menüsünü açarak kılavuz eşlemesini başlatın ve Öğeleri Al 'ıtıklatın.
- Açılır menüde aşağıdaki seçenekleri belirleyin.
- Kaba Ötemerkez 'iseçin.
- Harita Görüntüsünü Al 'ıseçin.
- Sütun Vanalarını Sonda Kapat 'ıseçin.
- Sonunda E-posta Gönder 'iseçin.
5. Hedeflerin seçilmesi
- Sahte bir SerialEM örneği açın. Bu, mikroskobu denetleyen SerialEM PC'de veya her iki bilgisayar da bir ağ bağlantısı paylaşıyorsa farklı bir (destek) bilgisayarda ayarlanabilir.
- İlk kılavuz karesi eşlendikten sonra, sahte SerialEM örneğindeki montajı görmek için SerialEM Gezgini menü seçeneğini birleştir seçeneğini kullanın.
- Kılavuz kare haritasını açmak için Gezgin penceresine çift tıklayın.
- Haritada arama yap ve ilgi alanı hedefine görüntü alma noktaları eklemek için Sahte SerialEM Gezgini Ekle seçeneğini kullanın.
- Bittiğinde ve yeni kareleri eşledikten sonra, Gezgin dosyasını kaydedin ve Gezgin'i yeniden birleştirin; tüm ızgara kareleri eşlenene kadar devam edin.
6. Sanal haritalar oluşturun
- Bir kez daha, gezgin dosyasını sahte SerialEM örneğiyle birleştirin.
- PyEM Virtual maps komut dosyasını sahte SerialEM menüsünden, Araçlar'dan çalıştırın ve Sanal Bağlantı Haritaları 'nıseçin. Bu, ızgara kare haritalarının boyutuna ve miktarına ve Görünüm ve Önizleme haritalarının binning'ine bağlı olarak biraz zaman alabilir.
NOT: PYEM, bittiğinde otomatik olarak kapanan bir komut penceresi başlatır, ardından yeni gezgin dosyası açılabilir. PyEM, seçilen noktaları içeren montajlı harita başına tek bir birleştirilmiş harita ve tüm Görünüm ve Önizleme haritalarını yazar. Son olarak, <navigatorfilename>_automaps.navadlı yeni bir Gezgin dosyası yazar.
7. Mikroskop ayarı
- Mikroskop ayarlamasını kontrol et. Uygun mikroskop performansını sağlamak için, veri toplama için aşağıdaki sırayla aynı büyütme ve ışın boyutu kurulumunu kullanın.
- CTF (Zemlin tableau) tarafından SeriaLEM Coma-free hizalamasını çalıştırın.
- Objektif bir diyafram ekleyin ve ortalanın.
- CTF (otomatik damgalama) tarafından SerialEM Doğru Astigmatizma çalıştırın.
- GIF Quick Tune'ı çalıştırın (yani, yalnızca yarık odağı).
NOT: 7.1.1, 7.1.3 ve 7.1.4 adımları daha fazla doz oranı gerektirebileceğinden, yalnızca spot boyutu değiştirilmelidir; kiriş eğime neden olduğu için kiriş boyutu değiştirilmemelidir, bu da ayarlamaları yanlış yapar. 7.1.1, 7.1.2 ve 7.1.3 adımları, genel kullanıma açık bu komut dosyasında yarı otomatiktir (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).
8. Gezgini Ayarlama
- SerialEM'de,
_automaps.nav adlı yeni gezgin dosyasını açın.
NOT: V_yyyy Haritaları görüntüle ve önizleme haritalarını P_yyyy. Önizleme eşlemeleri Edinme Puanları olarak ayarlanır. - SerialEM Gezgini penceresinde, tüm A noktalarının seçimini kaldırın, ilk V_yyyy eşlemesini seçin, Daralt 'ıseçin, A'yı iki kez tıklatın ve Daralt 'ınseçimini kaldırın.
- İlk V_yyyy konumunu seçin, Shift + Ttuşlarına basın, sonra son V_yyyy konumunu seçin ve Shift + T tuşlarına tekrar basın.
- İletişim kutusunu açmak için dosyanın özelliklerinde Tek Kare Görüntüler'i seçin.
- Bir sonraki Dosya Özellikleri iletişim kutusunda, görüntüleme gereksinimlerine ve cihaz kurulumuna göre istediğiniz parametreleri seçin.
- İstendiğinde, numarası olan bir ad verin (örneğin, TS_001.mrc) ve Kaydet 'itıklatın.
NOT: SerialEM, tüm eğim serileri için dosya adlarını otomatik olarak numaralandırmayacaktır. - Eğim serisi denetleyicisini ilk TS konumu için ayarlayın. Bittiğinde, bu satın alma öğesinden sonraki tüm eğim serileri için bu parametreleri ayarlamak üzere Tamam'ı tıklatın. Tüm Önizleme eşlemeleri artık TS_xxx.mrcnumaralı dosya adıyla TS (Tilt Serisi) olarak seçilidir.
NOT: Navigator TSparams özelliğini kullanarak parametreleri daha sonra manuel olarak değiştirebilirsiniz; değişiklikler listedeki tüm öğeler için aşağı doğru uygulanır. Kullanıcı, eğim serisi yerine özel bir komut dosyası çalıştırma seçeneğine sahiptir.
9. Odak/parça konumlarını ayarlama
- Gerekirse her hedef için odak/iz mesafesini ayarlayın (SerialEM Düşük Doz'un açık olduğundan emin olun).
- Yüklemek için Haritayı Görüntüle'ye çift tıklayın.
- Gezgin listesinde Önizleme Eşlemini seçin.
- Gezgin penceresinde Odağı Düzenle'yi seçin.
- Düşük Doz Kontrol panelinde, Deneme ve Odak'ı sahne eğim ekseni boyunca konumlandırmak için Alanlar arası ekseni döndür seçimini kaldırın.
- Bu eğim serisinin odak/deneme konumunu ayarlamak için yüklü görünüm haritasında istediğiniz bölgeye tıklayın.
- Gezgin öğesinin şimdi TSP ayarlı olduğundan emin olun; tüm öğeler için yordamı yineleyin.
NOT: Odak/izleme konumları Gezgin'de otomatik olarak aşağı doğru kopyalanır. Bu nedenle, önceki öğe için odak/izleme konumu doğru tarafta ve doğru mesafedeyse, geçerli öğe için değiştirmeye gerek yoktur.
10. Ek komut dosyaları ayarlama
- İki komut dosyası Odak aralığını işler: pretomo ve duringtomo. Pretomo komut dosyası, her eğim serisinden ve her eğim sırasında duringtomo komut dosyasından önce çalışır.
- Komut dosyası pretomo'sundaodak aralığını düzenleyin.
- SerialEM Tilt Serisi menüsünde, TS'de Komut Dosyasını Çalıştır'ı kontrol edin ve duringtomo komut dosyasının komut dosyası numarasını seçin.
11. Çalıştır
- Nitrojen tankı seviyesini kontrol et.
- Otomatik yükleyici turbosuzun seçili olup olmadığını kontrol edin.
- Veri depolama alanı boş alanını denetleyin.
- SerialEM dosya menüsünde, günlük dosyası için sürekli kaydetme seçimini kaldırın ve açık olan tüm günlük dosyalarını kapatın. Her eğim serisi kendi günlük dosyasına sahip olacaktır.
- Gezgin menüsünde Öğeler 'de Al 'ıtıklatın.
- PreTomokomut dosyasını çalıştırın.
- Birincil görev Eğim serisini al 'ıseçin.
- PostTomo'dan sonra komut dosyasını çalıştır 'ıseçin.
- Sütun vanalarını sonunda kapat 'ıseçin.
- Sonunda e-posta gönder 'iseçin.
- GO 'yatıklayın.
NOT: SerialEM, eğim serisi başına başarılı veya hatalı bir e-posta gönderir; hata, ancak, aynı zamanda tam eğim aralığına ulaşılamadı anlamına da gelebilir.
Representative Results
Bu prosedür, Turonova ve ark. 2020 20'de açıklanan Sars-Cov-2 tilt serisini elde etmek için kullanıldı; tüm veri kümesi, EMBL Heidelberg'de üç mikroskopi seansı boyunca üç ayrı ızgara kullanılarak üretildi. Mevcut çalışma, ilk ızgara ile ilk 3 günlük (~72 h) oturum çalışmasına odaklanacak ve tanımlayacaktır.
Tüm ızgara düşük büyütmede eşlendikten sonra (~10 dk, bkz. adım 2), ızgara haritasında 71 uygun kare seçildi ve ilgi örneğinin, bu durumda koronavirüslerin doğrudan görselleştirilmesine ve tanımlanmasına izin veren ayarlarla (büyütme, pozlama, defokus) orta büyütmeharitaları (kare haritalar)elde edildi (bkz. adım 4) (Şekil 1A). Alım süresi kare başına ~ 3 dakika, toplamda 3 h 45 dakika idi.
İlk kare harita oluşturulur oluşturulmaz, kare haritayı görselleştirmek ve eğim serisi alımına uygun hedeflere puan eklemek için ayrı bir bilgisayarda sahte bir SerialEM örneği (kamera veya mikroskop üzerinde herhangi bir kontrol olmadan) açıldı (bkz. adım 5) (Şekil 1B). Yeni alınan kare haritalar, geçerli kukla SerialEM gezgini, satın alınan SerialEM örneğinden gezginle birleştirilerek alındı. ~2 h ızgara kare alma ve seçiminden sonra, 50 ilk hedef tanımlanabilir.
Kare harita alımları bittikten sonra, SerialEM düşük doz kuruldu ve referans Görünüm ve Önizleme görüntüleri alındı ve harita olarak kaydedildi (bkz. adım 3). İkinci haritalar, ilgili kare harita görüntülerinden, PyEM yazılım paketiyle seçilen 50 hedefin Sanal Görünüm (Şekil 1C) ve Sanal Önizleme (Şekil 1D) haritalarından ~ 30 dakikalık bir işlem süresi için oluşturmak için kukla SerialEM örneğinde hemen kullanılabilir (bkz. adım 6). Sahte SerialEM oturumundaki bu işlem süresi, mikroskobun edinim için son hazırlıklarını gerçekleştirmek için kullanıldı: enerji filtresi ayarı, yeni kamera kazanım referans görüntü alımı, astigmatizma ve objektif lensin komasız hizalanması.
Mikroskop ayarı tamamlandıktan ve oluşturulan 50 ilk hedeften sanal haritalar oluşturulduktan sonra, edinme için kullanılacak gerçek SerialEM gezgini kuruldu (bkz. adım 8), odak ve izleme konumları ayarlandı (adım 9) ve eğim serisi alımı başlatılabilir (bkz. adımlar 10 ve 11). Sanal Görünüm haritaları ( Şekil1C) hedefin ilk ortalama için kullanılmıştır (Şekil 1E) ve ardından Sanal Önizleme haritası kullanılarak gerçek eğim serisi alım büyütmesinde gerçekleştirilen son bir merkezleme (Şekil1D).
Sabah 9:30'da ızgara haritalama ile başlayarak, 50 ilk hedef için eğim serisinin alımı kabaca 15:00'tebaşladı. Tomografik alım için kullanılan ayarlarla (ayrıntılar için referansa bakın), bir eğim serisinin elde etmesi ~ 20 dakika sürdü ve tüm gece boyunca yeterli hedef elde etti. Satın alma işlemi devam ederken, kare haritaların geri kalanı incelenebilir ve sahte SerialEM örneği aracılığıyla hala devre dışı olan daha fazla hedef eklenebilir. Kalan kare haritalar arasından 121 hedef daha seçildi ve bu yeni hedefler için sanal haritalar oluşturulduktan sonra 72 h oturumu tamamlanana kadar çalışacak kadar serialem navigasyoncu alımına eklendi.
Bu yordam (Şekil 2'deözetlenmiştir), tek bir iş gününde, 72 saat (3 gün) mikroskop oturumu için otomatik tomografik alımlar için 171 hedefin kurulumuna izin verdi.
Şekil 1: Temsili sanal haritalar ve merkezlemeden sonra ilgili kazanımlar ile kare harita örneği. (A) Turonova ve ark.20'dekullanılan bir Sars-Cov-2 cryoEM ızgarasının temsili kare haritası . Dört ilgi alanı kırmızı haç ile işaretlenmiştir. Mikroskop büyütme 2.250x'tir. (B) Seçili hedef (kırmızı haç) (C) Sanal Görünüm haritası için Sanal Görünüm (turuncu) ve Sanal Önizleme (sarı) haritalarını oluşturmak için kullanılan alanları vurgulayarak kare haritadan kırpın. (D) Sanal Önizleme haritası. (E) Sanal Görünüm eşlemesini referans olarak kullanarak ortalamadan sonra gerçek görünüm alımı. Mikroskop büyütme 11.500x'tir. (F) Sanal Önizleme haritasını referans olarak kullanarak ortalama yaptıktan sonra eğim serisinden 0° eğim alımı. Mikroskop büyütme 64.000x'tir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PyEM araçlarıyla SerialEM kullanarak CryoET oturum iş akışı.
Discussion
Niş bir teknikten, cryoET artık hücresel ve moleküler düzeyde yapısal çalışmalar yapmak için yaygın bir yönteme dönüştü ve benzeri görülmemiş ulaşılabilir çözünürlük21,22. CryoEM görüntülemeye olan sürekli artan talep, bu teknolojiye erişmek için mevcut sınırlı kaynaklara baskı yaptı. Bir dizi ulusal kriyoEM tesisinin açılmasına ve bilim enstitülerinin dünya çapında toplumun ihtiyaçlarını desteklemek için TEM kapasitelerini artırma çabalarına rağmen, cryoEM araçlarına erişim hala sınırlıdır ve bu nedenle veri toplama için mevcut süre, kullanıcılar tarafından her mikroskopi seansının verimini en üst düzeye çıkarmak için verimli bir şekilde kullanılmalıdır. Veri toplama için mevcut sınırlı süre ile birlikte yüzlerce eğim serisi edinme ihtiyacı, veri kalitesinden ödün vermeden daha iyi verim elde etmek için yeni görüntü toplama rutinleri çağrısında bulundu. Donanım ve görüntüleme iş akışlarındaki son gelişmeler, eğim serisi edinme hızını önemli ölçüde artırdı18,19, böylece bir alım noktası kurmak için harcanan zaman ile gerçek eğim serisi alımı için gereken zaman arasındaki oranın dramatik bir şekilde değişmesine neden oldu. Tamamen, satın alma noktaları kurma prosedürü, cryoET oturumlarının ulaşılabilir verimi için en büyük darboğazlardan biri haline geliyor.
Burada sunulan optimize edilmiş protokol, mikroskop diğer işlemlerde (ör. kare haritalama, ayarlama ve otomatik eğim serisi alımı) aktif olarak çalışırken, bir cryoET oturumunun ilk günü içinde otomatik tomografik alım için çevrimdışı modda 171 pozisyon kurmamızı sağladı, böylece veri toplama için mevcut mikroskop süresini etkilemeden. Bir cryoET oturumunun aktarım hızını en üst düzeye çıkarmanın yanı sıra, bu işlem hattı, kullanıcı tarafından otomatik veri toplama oturumunun hazırlık aşamasında harcanan süreyi önemli ölçüde azaltır. Açıklanan protokolde, kullanıcıdan uygun ilgi alanlarını belirlemek ve bunları seri em gezginine alım noktaları olarak eklemek için eşlenen ızgara karelerine göz atmaları istenir. Daha sonra tüm hedefler, sanal haritaların üretimi için PyEM aracı tarafından SerialEM içinde toplu olarak otomatik olarak işlenir16. Bu nedenle, sunulan hesaplama yaklaşımı, sahne hareketi, görüntü alma, Görüntüleme ve Önizleme arasındaki görüntüleme koşullarının değiştirilmesi ve yüksek büyütmeyi merkezlerken bu adımların nihai tekrarlanmasıyla ilişkili bekleme sürelerini ortadan kaldırarak gerçek bağlantı haritalarını almaktan önemli ölçüde daha hızlıdır. Ek olarak, edinilen her görüntü ilgi çekici nesne üzerinde elektron dozu birikmesine yol açtığından23, hedeflerin hassas yeniden düzenlenmesi için sanal haritaların kullanılması, gerçek eğim serisi alımından önce bir cryoET seansının hazırlık aşamasında ortaya konan radyasyon hasarını azaltır. Burada açıklanan protokol, eğim serisi alımından önce hedefin yeniden hizalanması için hem orta hem de yüksek büyütme sanal haritalarını (sırasıyla Önizleme ve Görünüm) kullanır. Bu yordam kolayca sadece ara büyütme görüntüyü kullanmak için değiştirilebilir Hizalama doğruluğu daha az önemli olduğunda, örneğin, nihai hedef doğruluğunun daha az endişe verici olduğu büyük yapılar söz konusu olduğunda10 veya her alım noktasının kullanıcının manuel seçimini gerektiren kriyo ızgarasına kötü yayılmış tek parçacık analizi örnekleri için24, 25. Son olarak, sahte bir SerialEM örneğinin off-line kullanımına dayanan bir yaklaşım, kullanıcının mikroskoptaki fiziksel varlığı ihtiyacını en aza indirerek uzaktan bağlantı yoluyla alım noktalarının kurulumunu kolaylaştırır ve böylece tesisin operasyonel organizasyonu açısından daha fazla esneklik sağlar.
CryoET için teknoloji ve yöntemlerdeki son gelişmeler, otomatik veri toplama oturumlarının hızını ve güvenilirliğini büyük ölçüde artırdı. Ancak, bu yöntemin kalan hız sınırlayıcı adımlarını ele almak için daha fazla gelişme gerekir. En önemlisi, ızgara ve kare haritalamanın ilk adımı artık oturum kurulumunun en büyük darboğazlarından biri haline geliyor ve böylece mikroskop aşaması hareketlerinin hızını ve doğrudan elektron dedektörleri tarafından görüntü alımını artırmayı amaçlayan donanım iyileştirmelerine ihtiyaç duyuyor. Ayrıca, hedef tanımlama sürecini tamamen otomatikleştirmek için makine öğrenimi yaklaşımlarının geliştirilmesi, kullanıcıların uzmanlığına dayanan zaman alıcı bir prosedür olan ilgi alanlarını seçmek için kullanıcıların görsel inceleme ihtiyacını ortadan kaldırmak için çok önemli olacaktır.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Heidelberg, Almanya'daki Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı'ndaki Yapısal ve Hesaplamalı Biyoloji Birimi ve Elektron Mikroskopi Çekirdek Tesisi'nden ve iNEXT-Discovery'den (proje numarası 871037) destek kabul ediyoruz. SerialEM yazılım paketinin yazarı Profesör David Mastronarde'nin mükemmel desteği için son derece minnettarız. Ayrıca herman Fung'a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
References
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).
- Pfeffer, S., Mahamid, J. Unravelling molecular complexity in structural cell biology. Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).
- Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
- Bohning, J., Bharat, T. A. M. Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Wan, W., Briggs, J. A. G. Methods in Enzymology. 579, Elsevier. NY. 329-367 (2016).
- Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. Automated data collection in single particle electron microscopy. Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).
- Resch, G. P. Methods in Cell Biology. 152, Elseiver. NY. 135-178 (2019).
- Bharat, T. A., Kukulski, W. Correlative Imaging: Focusing on the Future. , John Wiley & Sons. NY. 137-153 (2019).
- Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
- O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , Springer, Cham. 95-116 (2018).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16, 471-477 (2019).
- Turonova, B., et al. Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology. Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).
- Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography. Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).
- Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition. Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).
- Turonova, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
- O'Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369 (6503), 554-557 (2020).
- Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å inside cells. Nature Methods. 18, 186-193 (2020).
- Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate. Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).
- Liberta, F., et al. Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids. Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).
- Radamaker, L., et al. Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis. Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).
