Summary
क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी में बड़े पैमाने पर डेटा संग्रह की बढ़ती मांग के लिए उच्च-थ्रूपुट छवि अधिग्रहण दिनचर्या की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित एक प्रोटोकॉल है जो उन्नत अधिग्रहण रणनीतियों के हालिया घटनाक्रमों को लागू करता है जिसका उद्देश्य समय-दक्षता और टोमोग्राफिक डेटा संग्रह के थ्रूपुट को अधिकतम करना है।
Abstract
क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायोएट) एक करीबी से मूल राज्य में जैविक नमूनों की 3 डी संरचना का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। वर्तमान अत्याधुनिक क्रायोएट उप-अत्याधुनिक विश्लेषण के साथ संयुक्त रूप से मैक्रोमॉलिकुलर परिसरों के उच्च-संकल्प संरचनात्मक निर्धारण को सक्षम बनाता है जो टोमोग्राफिक पुनर्निर्माण के भीतर कई प्रतियों में मौजूद हैं। टोमोग्राफिक प्रयोगों के लिए आमतौर पर महत्वपूर्ण परिचालन रनिंग-लागत के साथ उच्च अंत ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के माध्यम से अधिग्रहीत की जाने वाली झुकाव श्रृंखला की एक विशाल मात्रा की आवश्यकता होती है। हालांकि हाल के वर्षों में स्वचालित डेटा अधिग्रहण दिनचर्या की थ्रूपुट और विश्वसनीयता में लगातार सुधार हुआ है, ब्याज के उन क्षेत्रों का चयन करने की प्रक्रिया जिस पर एक झुकाव श्रृंखला का अधिग्रहण किया जाएगा, आसानी से स्वचालित नहीं किया जा सकता है और यह अभी भी उपयोगकर्ता के मैनुअल इनपुट पर निर्भर करता है। इसलिए, बड़े पैमाने पर डेटा संग्रह सत्र का सेट-अप एक समय लेने वाली प्रक्रिया है जो झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण के लिए उपलब्ध शेष माइक्रोस्कोप समय को काफी कम कर सकती है। यहां, प्रोटोकॉल सीरियलईएम पैकेज और पाइईएम सॉफ्टवेयर के आधार पर हाल ही में विकसित कार्यान्वयन का वर्णन करता है जो ग्रिड स्क्रीनिंग और बड़े पैमाने पर झुकाव श्रृंखला डेटा संग्रह की समय-दक्षता में काफी सुधार करता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल दिखाता है कि ग्रिड मैपिंग, ग्रिड स्क्वायर मैपिंग और झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण को पूरी तरह से स्वचालित करने के लिए सीरियलेम स्क्रिप्टिंग कार्यक्षमताओं का उपयोग कैसे किया जाए। इसके अलावा, प्रोटोकॉल बताता है कि स्वचालित डेटा संग्रह शुरू होने के बाद ऑफ-लाइन मोड में अतिरिक्त अधिग्रहण लक्ष्यों का चयन करने के लिए PyEM का उपयोग कैसे किया जाए। इस प्रोटोकॉल को समझाने के लिए, सार्स-कॉव-2 झुकाव श्रृंखला के उच्च अंत डेटा संग्रह के संदर्भ में इसके आवेदन का वर्णन किया गया है। प्रस्तुत पाइपलाइन विशेष रूप से टोमोग्राफी प्रयोगों की समय-दक्षता को अधिकतम करने के लिए अनुकूल है जिसके लिए अधिग्रहण लक्ष्यों के सावधानीपूर्वक चयन की आवश्यकता होती है और साथ ही बड़ी मात्रा में झुकाव श्रृंखला एकत्र की जाती है।
Introduction
क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) विधियां उनके तेजी से विट्रीफिकेशन के बाद ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) के माध्यम से जैविक नमूनों की इमेजिंग पर आधारित होती हैं, एक नमूना तैयारी प्रक्रिया जो नमूनों की आणविक और सेलुलर संरचनाओं को करीब-करीब देशी और हाइड्रेटेड राज्य1,2में संरक्षित करती है। क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायोएट) में विट्रीफाइड नमूने का एक 3डी मॉडल विभिन्न झुकाव, तथाकथित झुकाव श्रृंखला से ब्याज के एक ही क्षेत्र की कई छवियों को प्राप्त करके प्राप्त किया जाता है, जिसके बाद टोमोग्राफिक वॉल्यूम 3 का कम्प्यूटेशनल पुनर्निर्माणहोताहै। यह उन्नत इमेजिंग तकनीक जैविक प्रक्रियाओं की संरचनात्मक जांच के लिए उनके मूल सेलुलर वातावरण 4,5 ,6के संदर्भ में एक शक्तिशाली विधि के रूप में परिपक्व हो गई है ।
विट्रीफाइड नमूने के अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण के अलावा, टोमोग्राफिक वॉल्यूम के भीतर कई प्रतियों में मौजूद मैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स के उच्च-संकल्प पुनर्निर्माण5औसत उपटोमोग्राम लागू करके प्राप्त किए जा सकते हैं। यह पुनर्निर्माण दृष्टिकोण ब्याज की संरचना वाले उप-खंडों के पुनरावर्तन संरेखण और औसत पर आधारित है और इसका उद्देश्य सिग्नल-टू-शोर अनुपात और अंतिम पुनर्निर्माण7,8के संकल्प को बढ़ाना है। उपतोमोग्राम औसत बड़ी मात्रा में डेटा के संग्रह और प्रसंस्करण पर निर्भर करता है जो अक्सर भारी परिचालन रनिंग-लागत के साथ उच्च अंत TEMs के माध्यम से सैकड़ों झुकाव श्रृंखला के अधिग्रहण की मांग करता है।
वर्तमान में इस तरह के स्वचालित क्रायोएट सत्रों का सेटअप एक समय लेने वाली प्रक्रिया है जो आमतौर पर उपयोगकर्ता के मैनुअल इनपुट9, 10,11पर निर्भर करती है। आमतौर पर, लक्ष्यों की पहचान मैप किए गए ग्रिड के दृश्य निरीक्षण द्वारा की जाती है और बाद में स्वचालित डेटा संग्रह के लिए स्थापित की जाती है। अधिग्रहण बिंदुओं की पहचान करने में उपयोगकर्ता की दक्षता अक्सर नमूने की प्रकृति से प्रभावित होती है, जो विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण होती है जब उप-विशिष्ट एकाग्रता के साथ शुद्ध मैक्रोमॉलिक्यूल्स का विश्लेषण करते समय या भीड़ भाड़ वाले सेलुलर वातावरण के भीतर दुर्लभ घटनाओं के मामले में, सहसंबद्ध दृष्टिकोण12का उपयोग होता है। इसके अलावा, वर्तमान कार्यप्रवाहों को विभिन्न आवर्धनों पर सेट-अप के दौरान छवियों के अधिग्रहण की आवश्यकता होती है, जिनका उपयोग बाद में सटीक स्थानीयकरण और स्वचालित अधिग्रहण11, 13,14केदौरानलक्ष्य को केंद्रित करने के लिए किया जाएगा। ये उच्च सटीक पुनः संरेखण कदम उच्च-रिज़ॉल्यूशन अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो इमेजिंग को उच्च आवर्धन पर किए जाने की मांग करते हैं और परिणामस्वरूप छोटे क्षेत्र के भीतर ब्याज के क्षेत्र को बनाए रखने के लिए सटीक केंद्रित कदमों की आवश्यकता होती है। कुल मिलाकर, प्रत्येक डेटा संग्रह सत्र के कई घंटे इस समय लेने वाली प्रक्रिया के लिए प्रतिबद्ध हैं जिसके दौरान टीई टम झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण में नहीं लगे हुए हैं। इसलिए, आवश्यक झुकाव श्रृंखला की मात्रा के आधार पर, अधिग्रहण बिंदुओं की पहचान और सेट-अप का क्रायोईटी सत्र के दौरान डेटा संग्रह के लिए उपलब्ध माइक्रोस्कोप समय पर काफी प्रभाव पड़ सकता है।
यहां वर्णित एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है जो सीरियलेम सॉफ्टवेयर पैकेज15 और नवीनतम संस्करण PyEM सॉफ्टवेयर16 पर आधारित है ताकि ग्रिड, मैप ग्रिड वर्ग, लक्ष्यों का चयन किया जा सके और बड़े पैमाने पर झुकाव श्रृंखला संग्रह के लिए स्वचालित डेटा अधिग्रहण स्थापित किया जा सके। इस दृष्टिकोण की प्रमुख अवधारणा सटीक स्थानीयकरण और लक्ष्य के केंद्र के लिए, आभासी नक्शे कहा जाता है, प्रत्येक अधिग्रहण आइटम के लिए PyEM द्वारा गणना रूप से उत्पन्न छवियों के साथ सीरियलईएम प्रदान करना है। वास्तविक अधिग्रहण समय हासिल करने के लिए, लक्ष्यों के चयन के साथ-साथ आभासी मानचित्रों के निर्माण को क्रमईएम के दूसरे डमी उदाहरण का उपयोग करके ऑफ-लाइन किया जाता है, जो TEM संचालन से अधिग्रहण लक्ष्यों की चयन प्रक्रिया को अलग करता है। डेटागुणवत्ता13, 17या झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण 18,19 की गति को बढ़ाने के तरीके को संबोधित नहीं करतेहुए,यह प्रोटोकॉल मुख्य रूप से बड़े पैमाने पर स्वचालित क्रायोएट सत्र सेटअप की समय-दक्षता को अनुकूलित करने के लिए रणनीतियों पर केंद्रित है। इसलिए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल का कार्यान्वयन उन वैज्ञानिकों के लिए है जो क्रायोट डेटा संग्रह वर्कफ्लो स्थापित करते हैं जो झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण के लिए उपलब्ध माइक्रोस्कोप समय को बढ़ाकर स्वचालित डेटा अधिग्रहण की उपज को अधिकतम करने की इच्छा रखते हैं।
Protocol
यहां वर्णित प्रोटोकॉल ईएमबीएल क्रायोईएम सेवा मंच द्वारा उत्पादित एक अधिक व्यापक दस्तावेज का हिस्सा है जिसमें नमूना लोडिंग, ग्रिड मैपिंग, माइक्रोस्कोप ट्यूनिंग, अधिग्रहण बिंदुओं की स्थापना और स्वचालित डेटा संग्रह सहित एक विशिष्ट क्रायोएट सत्र की पूरी प्रक्रिया को दर्शाते हुए पूरी तरह से कदम-दर-कदम निर्देश और स्क्रीनशॉट शामिल हैं। पूर्ण प्रोटोकॉल निम्नलिखित लिंक पर डाउनलोड किया जा सकता है: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download
1. आवश्यकताएं
- सीरियलईएम संस्करण 3.8 स्थापित करें और माइक्रोस्कोप और डिटेक्टर (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm) को नियंत्रित करने के लिए स्थापित करें।
- सीरियलमेवर्सेंस 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html) का एक डमी उदाहरण स्थापित करें।
- PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem) स्थापित करें।
2. ग्रिड मैपिंग
- माइक्रोस्कोप ऑटोलोडर में ग्रिड के साथ एक कैसेट लोड करें।
- पूरे ग्रिड की मैपिंग के लिए उपयुक्त इमेजिंग शर्तों को सेट करें। इस्तेमाल किए गए डिटेक्टर (ईएफटेम एसए 2250x) पर देखने के क्षेत्र को ध्यान में रखते हुए सबसे कम आवर्धन संभव है। बाद में उपयोग के लिए चीजों को सुविधाजनक बनाने के लिए एक सीरियलईएम इमेजिंग राज्य के रूप में इमेजिंग शर्तों को सहेजें।
- पूर्ण असेंबल सेट करें
- सीरियलम नेविगेटर मेनू खोलें।
- मोंटेजिंग एंड ग्रिड काचयन करें ।
- पूर्ण असेंबल सेट काचयन करें ।
- स्क्रिप्ट Grid_Mappingशुरू करें । स्क्रिप्ट को ठंडा करने के लिए ऑटोलोडर की प्रतीक्षा करने की अनुमति दें; एक इन्वेंट्री करें और फिर प्रत्येक ग्रिड को मैप करें जो इन्वेंट्री प्रक्रिया को मिला। टिल्ट सीरीज मेनू के माध्यम से एक ईमेल इनपुट करें ताकि स्क्रिप्ट को आसानी से ईमेल भेजने की अनुमति दी जा सके।
- नेविगेटरबचाओ ।
- सीरियलईएम नेविगेटर से सभी ग्रिड मानचित्रों का निरीक्षण करें और उच्च आवर्धन पर आगे नक्शा बनाने के लिए कौन सा ग्रिड चुनें।
नोट: एक ऑटोलोडर सिस्टम से लैस कई टेम रीलोडेड होने पर ग्रिड का रोटेशन दिखाएंगे। इसे फिर से लोड करने के बाद किसी भी ग्रिड को फिर से ओवरलैप करना सबसे अच्छा है। वैकल्पिक प्रणालियों को आमतौर पर केवल कुछ बदलाव भुगतने पड़ते हैं, जिन्हें क्रमईएम में मार्कर प्रक्रिया में बदलाव के साथ ठीक किया जा सकता है।
3. सीरियलम कम खुराक सेट करें
- सीरियलईएम कम खुराक दृश्य और पूर्वावलोकन मोड का आवर्धन सेट करें (यह चरण 6 के लिए आवश्यक है)।
- व्यू इमेज हासिल करें और इसे नेविगेटर में नक्शे के रूप में सहेजें।
- एक पूर्वावलोकन छवि प्राप्त करें, और इसे नेविगेटर में मानचित्र के रूप में सहेजें।
- दोनों मोड को एक ही बिनिंग (बिनिंग 4 का सुझाव दिया गया है) में सेट करें। यह एक छवि ढेर में दो नक्शे को बचाने की अनुमति देता है।
- सीरियलईएम नेविगेटर विंडो में व्यू मैप के लेबल को देखने के लिए और पूर्वावलोकन मानचित्र के लेबल को पूर्वावलोकन में बदलें।
- नेविगेटर फ़ाइल को सहेजें और बंद करें।
नोट: प्रारंभिक दृश्य और पूर्वावलोकन छवियों के लिए किसी लक्ष्य की आवश्यकता नहीं है, PyEM केवल उनकी इमेजिंग सेटिंग्स का उपयोग करेगा।
4. ग्रिड स्क्वायर मैपिंग
- ग्रिड वर्गों को मैप करने के लिए इमेजिंग शर्तों को सेट करें। ब्याज का नमूना और प्रत्ययी मनका वितरण को देखने में सक्षम होना बहुत महत्व का है। ग्रिड स्क्वायर मानचित्रों के लिए इष्टतम विपरीत सुनिश्चित करने के लिए, निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें।
- एक उद्देश्य एपर्चर डालें।
- यदि लागू हो, तो ऊर्जा फ़िल्टर भट्ठा डालें।
- -100 माइक्रोन का डेफोकस का उपयोग करें।
- आगे की मैपिंग के लिए उपयुक्त अच्छे ग्रिड वर्गों के लिए स्क्रीन। ग्रिड मानचित्र से वर्गों के दृश्य निरीक्षण के बाद, ग्रिड स्क्वायर मानचित्रों के लिए उपयोग की जाने वाली इमेजिंग शर्तों के साथ वर्ग की परीक्षण छवियां लें।
- जब एक अच्छे वर्ग की पहचान की जाती है, तो सीरियलईएम नेविगेटर के ऐड पॉइंट्स फीचर का उपयोग करके ग्रिड मैप इमेज में अपने केंद्र को चिह्नित करें।
- एक बार सभी बिंदुओं को जोड़ दिया जाता है, तो सीरियलम नेविगेटर प्रेस शिफ्ट + ए में पहले बिंदु पर, फिर अंतिम बिंदु पर शिफ्ट + ए दबाएं।
नोट: सभी जोड़े गए बिंदुओं को अब ए द्वारा चिह्नित किया गया है, जिसका अर्थ है कि वे सभी अधिग्रहण बिंदु हैं। - प्रेस शिफ्ट + एन (आइटम पर एक नई फाइल बनाएं) पहले बिंदु पर और फिर अंतिम बिंदु पर। संवाद में है कि ऊपर आता है, Montaged छवियोंका चयन करें ।
- जब असेंबल संवाद चबूतरे, एक असेंबल आकार है कि एक ग्रिड वर्ग को शामिल किया गया स्थापित करें । यह आवर्धन और उपयोग किए जाने वाले ग्रिडों के जाल आकार पर निर्भर करता है और आमतौर पर 2 x 2 से 4 x 4 असेंबल की आवश्यकता होती है। इसे एक नंबर (जैसे, squaremap_01.mrc) के साथ एक नाम दें ताकि सीरियलईएम को प्रति ग्रिड स्क्वायर सभी फाइलों को आसानी से ऑटो-नंबर करने की अनुमति दी जा सके।
- सीरियलईएम नेविगेटर मेनू खोलकर ग्रिड-मैपिंग शुरू करें और अधिग्रहण एट आइटम्सपर क्लिक करें।
- पॉप-अप मेनू में, निम्नलिखित विकल्पों का चयन करें।
- किसी न किसी यूसेंट्रिसिटीका चयन करें ।
- अधिग्रहण मानचित्र छविका चयन करें ।
- अंत में बंद कॉलम वाल्व काचयन करें ।
- अंत में ईमेल भेजेंचुनें ।
5. लक्ष्यों का चयन
- एक डमी सीरियलेम उदाहरण खोलें। यह सीरियलईएम पीसी पर स्थापित किया जा सकता है जो माइक्रोस्कोप को नियंत्रित करता है या एक अलग (समर्थन) पीसी पर यदि दोनों कंप्यूटर नेटवर्क कनेक्शन साझा करते हैं।
- एक बार पहला ग्रिड स्क्वायर मैप करने के बाद, डमी सीरियलेम उदाहरण में असेंबल देखने के लिए सीरियलम नेविगेटर मेनू विकल्प मर्ज का उपयोग करें।
- ग्रिड स्क्वायर मैप खोलने के लिए नेविगेटर विंडो पर डबल क्लिक करें।
- मानचित्र खोजें और रुचि के लक्ष्य पर छवि अधिग्रहण अंक जोड़ने के लिए डमी सीरियलेम नेविगेटर विकल्प ऐड पॉइंट्स का उपयोग करें।
- जब किया जाता है और नए वर्गों का मानचित्रण करने के बाद, नेविगेटर फ़ाइल को सहेजें और नेविगेटर को फिर से मर्ज करें; जब तक सभी ग्रिड वर्ग मैप नहीं किए जाते तब तक जारी रखें।
6. वर्चुअल मैप्स जेनरेट करें
- एक बार फिर, डमी सीरियलईएम उदाहरण के साथ नेविगेटर फ़ाइल को मर्ज करें।
- डमी सीरियलेम मेनू, टूल्स से PyEM वर्चुअल मैप्स स्क्रिप्ट चलाएं और वर्चुअल एंकर मैप्सका चयन करें। ग्रिड स्क्वायर मानचित्रों के आकार और मात्रा और व्यू और पूर्वावलोकन मानचित्रों के बिनिंग के आधार पर इसमें कुछ समय लग सकता है।
नोट: PyEM एक कमांड विंडो शुरू करता है जो किए जाने पर स्वचालित रूप से बंद हो जाता है, फिर नई नेविगेटर फ़ाइल खोली जा सकती है। चयनित बिंदुओं वाले मोंटागेड मानचित्र के अनुसार, PyEM एक एकल विलय मानचित्र और इसके सभी दृश्य और पूर्वावलोकन मानचित्र लिखता है। अंत में, यह एक नई नेविगेटर फ़ाइल लिखता है जिसेनेविगेटर फाइल नाम< >_automaps.navकहा जाता है।
7. माइक्रोस्कोप ट्यूनिंग
- माइक्रोस्कोप ट्यूनिंग की जांच करें। उचित माइक्रोस्कोप प्रदर्शन को आश्वस्त करने के लिए, निम्नलिखित क्रम में डेटा अधिग्रहण के लिए एक ही आवर्धन और बीम आकार सेटअप का उपयोग करें।
- सीटीएफ (ज़ेमलिन झांकी) द्वारा सेरेलेम कोमा मुक्त संरेखण चलाएं।
- डालें और एक उद्देश्य एपर्चर केंद्र।
- सीटीएफ (ऑटो-कलंक) द्वारा सीरियलेम सही Astigmatism चलाएं।
- जीआईएफ क्विक ट्यून (यानी, केवल भट्ठा फोकस) चलाएं।
नोट: चरण 7.1.1, 7.1.3, और 7.1.4 के रूप में अधिक खुराक दर की आवश्यकता हो सकती है, केवल स्पॉट आकार को बदला जाना चाहिए; बीम का आकार नहीं बदला जाना चाहिए क्योंकि यह बीम झुकाव का कारण बनता है, जो ट्यूनिंग को गलत बनाता है। इस सार्वजनिक रूप से उपलब्ध स्क्रिप्ट (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47) में चरण 7.1.1, 7.1.2, और 7.1.3 अर्ध-स्वचालित हैं।
8. नेविगेटर सेट अप
- सीरियलईएम में, <विवेदर फाइलनाम>_automaps.एनएवीनाम से नई नेविगेटर फ़ाइल खोलें।
नोट: V_yyyy व्यू मैप हैं और P_yyyy पूर्वावलोकन मानचित्र हैं। पूर्वावलोकन नक्शे अधिग्रहण अंक के रूप में सेट कर रहे हैं । - सीरियलईएम नेविगेटर विंडो में, सभी ए पॉइंट्स को डिमोलेक्ट करें, पहले V_yyyy मैप का चयन करें, पतनका चयन करें, दो बार क्लिक करें, और पतनका चयन करें।
- पहले V_yyyy पोजीशन का चयन करें, शिफ्ट + टी दबाएं,फिर अंतिम V_yyyy स्थिति का चयन करें, और शिफ्ट + टी को फिर से दबाएं।
- संवाद खोलने के लिए फ़ाइल के गुणों में सिंगल फ्रेम इमेज चुनें।
- अगले फ़ाइल गुण संवाद में, इमेजिंग आवश्यकताओं और साधन सेटअप के अनुसार वांछित मापदंडों का चयन करें।
- जब प्रेरित किया, एक नंबर के साथ एक नाम दे (जैसे, TS_001.mrc) और Saveपर क्लिक करें ।
नोट: सीरियलईएम सभी झुकाव श्रृंखला के लिए फाइलनाम को ऑटो-नंबर करेगा। - पहले टीएस स्थिति के लिए झुकाव श्रृंखला नियंत्रक की स्थापना की। जब किया जाता है, तो इस अधिग्रहण आइटम के बाद सभी झुकाव श्रृंखला के लिए इन मापदंडों को सेट करने के लिए ओके पर क्लिक करें। सभी पूर्वावलोकन नक्शे अब टीएस (झुकाव श्रृंखला) के रूप में गिने फ़ाइल नाम TS_xxx.mrc केरूप में चुना जाता है ।
नोट: नेविगेटर टीएसपैर्म सुविधा का उपयोग करके कोई भी बाद में मैन्युअल रूप से मापदंडों को बदल सकता है; सूची में नीचे की ओर सभी मदों के लिए परिवर्तन लागू किए जाएंगे । यूजर के पास टिल्ट सीरीज की जगह कस्टम स्क्रिप्ट चलाने का ऑप्शन है।
9. फोकस/ट्रैक पोजिशन सेट करें
- यदि आवश्यक हो तो प्रत्येक लक्ष्य के लिए फोकस/ट्रैक दूरी निर्धारित करें (सुनिश्चित करें कि सीरियलेम कम खुराक चालू है)।
- इसे लोड करने के लिए व्यू मैप पर डबल क्लिक करें।
- नेविगेटर सूची में पूर्वावलोकन मानचित्र का चयन करें।
- नेविगेटर विंडो में एडिट फोकस चुनें।
- लो डोज कंट्रोल पैनल में, स्टेज टिल्ट एक्सिस के साथ ट्रायल और फोकस की स्थिति के लिए रोटेट इंटर-एरिया एक्सिस को डिसेलेक्ट करें।
- इस झुकाव श्रृंखला के लिए फोकस/परीक्षण की स्थिति निर्धारित करने के लिए लोडेड व्यू मैप में वांछित क्षेत्र पर क्लिक करें ।
- सुनिश्चित करें कि नेविगेटर आइटम में अब टीएसपी सेट है; सभी मदों के लिए प्रक्रिया दोहराएं।
नोट: फोकस/ट्रैक पदों स्वचालित रूप से नेविगेटर में नीचे की ओर नकल कर रहे हैं । इसलिए, यदि पिछले आइटमों के लिए फोकस/ट्रैक स्थिति सही पक्ष और सही दूरी पर है, तो वर्तमान आइटम के लिए इसे बदलने की कोई आवश्यकता नहीं है ।
10. अतिरिक्त स्क्रिप्ट सेट करें
- दो स्क्रिप्ट फोकस रेंज संभाल: प्रीटोमो और दौरानटोमो। प्रीटोमो स्क्रिप्ट प्रत्येक झुकाव श्रृंखला और प्रत्येक झुकाव के दौरान दौरान स्क्रिप्ट से पहले चलाता है।
- स्क्रिप्ट प्रीटोमोमें फोकस रेंज को संपादित करें।
- सीरियलम टिल्ट सीरीज मेन्यू में टीएस में रन स्क्रिप्ट चेक करें और दौरान की स्क्रिप्ट की स्क्रिप्ट नंबर चुनें ।
11. भागो
- नाइट्रोजन टैंक के स्तर की जांच करें।
- चेक करें कि ऑटोलोडर टर्बो ऑफ का चयन किया गया है या नहीं।
- डेटा स्टोरेज फ्री स्पेस की जांच करें।
- सीरियलईएम फ़ाइल मेनू में, लॉग फ़ाइल के लिए निरंतर बचत को छोड़ दें और वर्तमान में खुली लॉगफाइल को बंद करें। प्रत्येक झुकाव श्रृंखला अपनी लॉग फ़ाइल मिल जाएगा।
- नेविगेटर मेनू में, आइटम पर अधिग्रहण परक्लिक करें ।
- स्क्रिप्ट PreTomo चलाएं।
- प्राथमिक कार्य अधिग्रहण झुकाव श्रृंखला काचयन करें ।
- PostTomo के बाद रन स्क्रिप्टका चयन करें ।
- अंत में बंद कॉलम वाल्व काचयन करें ।
- अंत में ईमेल भेजेंचुनें ।
- जाओपर क्लिक करें ।
नोट: सीरियलईएम प्रति झुकाव श्रृंखला एक ईमेल भेजेगा, या तो सफल या त्रुटि; त्रुटि, हालांकि, यह भी मतलब कर सकते है पूर्ण झुकाव रेंज तक नहीं पहुंचा था ।
Representative Results
इस प्रक्रिया का उपयोग ट्यूरोनोवा एट अल में वर्णित सार्स-कॉव-2 झुकाव श्रृंखला के अधिग्रहण के लिए किया गयाथा। पूरे डेटासेट का उत्पादन ईएमबीएल हीडलबर्ग में तीन माइक्रोस्कोपी सत्रों में तीन अलग ग्रिड का उपयोग करके किया गया था। वर्तमान अध्ययन पर ध्यान केंद्रित करने और पहले 3 दिन (~ ७२ एच) सत्र पहले ग्रिड के साथ चलाने का वर्णन करेंगे ।
पूरे ग्रिड को कम आवर्धन (~ 10 मिनट, चरण 2 देखें) पर मैप किए जाने के बाद, ग्रिड मानचित्र पर 71 उपयुक्त वर्गों का चयन किया गया था, और मध्यम आवर्धन मानचित्र(वर्ग मानचित्र)सेटिंग्स (आवर्धन, एक्सपोजर, डेफोकस) के साथ प्राप्त किए गए थे जो इस मामले में कोरोनावायरस (चरण 4 देखें)(चित्रा 1A)के नमूने की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। अधिग्रहण का समय ~ 3 मिनट प्रति वर्ग, कुल 3 घंटे 45 मिनट था।
जैसे ही पहला स्क्वायर मैप बनाया गया, स्क्वायर मैप की कल्पना करने और टिल्ट श्रृंखला अधिग्रहण के लिए उपयुक्त लक्ष्यों पर अंक जोड़ने के लिए एक अलग कंप्यूटर पर एक डमी सीरियलेम उदाहरण (कैमरा या माइक्रोस्कोप पर किसी भी नियंत्रण के बिना) खोला गया (चरण 5 देखें)(चित्रा 1B)। नए अधिग्रहीत वर्ग नक्शे प्राप्त करने वाले सीरियलेम उदाहरण से नेविगेटर के साथ वर्तमान डमी सीरियलम नेविगेटर को मिलाकर प्राप्त किए गए थे। ग्रिड स्क्वायर अधिग्रहण और चयन के ~ 2 एच के बाद, 50 प्रारंभिक लक्ष्यों की पहचान की जा सकती है।
स्क्वायर मैप अधिग्रहण समाप्त होने के बाद, सीरियलेम कम खुराक स्थापित की गई थी और संदर्भ दृश्य और पूर्वावलोकन छवियों को नक्शे के रूप में लिया गया और सहेजा गया (चरण 3 देखें)। बाद के नक्शे तो डमी क्रमईएम उदाहरण पर तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है उत्पन्न करने के लिए, इसी वर्ग नक्शा छवियों से, आभासी दृश्य (चित्रा 1C)और आभासी पूर्वावलोकन (चित्रा 1D)PyEM सॉफ्टवेयर सुइट के साथ ५० चयनित लक्ष्यों के नक्शे, ~30 मिनट के प्रसंस्करण समय के लिए (चरण 6 देखें) । डमी सीरियलईएम सत्र पर इस प्रसंस्करण समय का उपयोग अधिग्रहण के लिए माइक्रोस्कोप की अंतिम तैयारी करने के लिए किया गया था: ऊर्जा फ़िल्टर ट्यूनिंग, नया कैमरा गेन संदर्भ छवि अधिग्रहण, एस्टिमेटिज्म- और उद्देश्य लेंस का कोमा-मुक्त संरेखण।
एक बार माइक्रोस्कोप ट्यूनिंग पूरा हो गया था और ५० प्रारंभिक उत्पन्न लक्ष्यों से आभासी नक्शे, वास्तविक सीरियलईएम नेविगेटर अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए स्थापित किया गया था (चरण 8 देखें), ध्यान और ट्रैक पदों सेट (चरण 9), और झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण शुरू किया जा सकता है (कदम 10 और 11 देखें) । वर्चुअल व्यू मैप्स(चित्रा 1C)का उपयोग लक्ष्य के प्रारंभिक केंद्र(चित्रा 1E)के लिए किया गया था जिसके बाद वर्चुअल पूर्वावलोकन मानचित्र(चित्रा 1D)का उपयोग करके वास्तविक झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण आवर्धन(चित्रा 1F)पर अंतिम केंद्र का प्रदर्शन किया गया था।
सुबह 9:30 पर ग्रिड मैपिंग के साथ शुरू, ५० प्रारंभिक लक्ष्यों के लिए झुकाव श्रृंखला का अधिग्रहण लगभग 15:00पर शुरू हुआ । टोमोग्राफिक अधिग्रहण के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स (विवरण के लिए संदर्भ देखें), एक झुकाव श्रृंखला को प्राप्त करने के लिए ~ 20 मिनट का समय लगा, पर्याप्त लक्ष्य के साथ, पूरी रात के माध्यम से चलाने के लिए। जबकि अधिग्रहण चल रहा था, वर्ग नक्शे के बाकी का निरीक्षण किया जा सकता है और अधिक लक्ष्य जोड़ा, अभी भी डमी SerialEM उदाहरण के माध्यम से ऑफ लाइन । शेष वर्ग मानचित्रों में 121 और लक्ष्यों का चयन किया गया था और इन नए लक्ष्यों के लिए वर्चुअल मैप्स बनाए जाने के बाद अधिग्रहण सीरियलईएम नेविगेटर में जोड़ा गया था, जो 72 एच सत्र के पूरा होने तक चलने के लिए पर्याप्त था।
इस प्रक्रिया (चित्रा 2में संक्षेप) की अनुमति दी, एक ही कार्य दिवस में, एक 72 घंटे (3 दिन) माइक्रोस्कोप सत्र के लिए स्वचालित टोमोग्राफिक अधिग्रहण के लिए 171 लक्ष्यों की स्थापना।
चित्रा 1:प्रतिनिधि आभासी नक्शे और केंद्रित करने के बाद इसी अधिग्रहण के साथ वर्ग नक्शे का उदाहरण ।(A)एक सार्स-Cov-2 क्रायोम ग्रिड के प्रतिनिधि वर्ग नक्शा Turonova एट अल अल में इस्तेमाल किया। ब्याज के चार क्षेत्रों को रेडक्रॉस के साथ चिह्नित किया गया है । माइक्रोस्कोप आवर्धन 2,250x है। (ख)चयनित लक्ष्य (रेड क्रॉस)(C)वर्चुअल व्यू मानचित्र के लिए वर्चुअल व्यू (नारंगी) और वर्चुअल प्रीव्यू (पीला) नक्शे उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले क्षेत्रों को उजागर करने वाले वर्ग मानचित्र से बाहर की फसल । (घ)वर्चुअल प्रीव्यू मैप । (ई)एक संदर्भ के रूप में वर्चुअल व्यू मानचित्र का उपयोग करने के बाद वास्तविक दृश्य अधिग्रहण। माइक्रोस्कोप आवर्धन 11,500x है। (एफ)0 ° एक संदर्भ के रूप में वर्चुअल पूर्वावलोकन मानचित्र का उपयोग करने के बाद झुकाव श्रृंखला से झुकाव अधिग्रहण। माइक्रोस्कोप आवर्धन 64,000x है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:क्रायोएट सत्र वर्कफ़्लो PyEM टूल के साथ सीरियलईएम का उपयोग करके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
एक आला तकनीक से, क्रायोएट अब अभूतपूर्व पहुंच योग्य संकल्प21, 22के साथ सेलुलर और आणविक स्तर पर संरचनात्मक अध्ययन करने के लिए एक व्यापक विधि में परिपक्व हो गयाहै। क्रायोईएम इमेजिंग की लगातार बढ़ती मांग ने इस तकनीक तक पहुंचने के लिए उपलब्ध सीमित संसाधनों पर दबाव डाला है । कई राष्ट्रीय क्रायोईएम सुविधाओं के उद्घाटन और दुनिया भर में समुदाय की जरूरतों का समर्थन करने के लिए अपनी TEM क्षमता बढ़ाने के लिए वैज्ञानिक संस्थानों के प्रयासों के बावजूद, क्रायोईएम उपकरणों तक पहुंच अभी भी सीमित है और डेटा संग्रह के लिए उपलब्ध समय इसलिए उपयोगकर्ताओं द्वारा प्रत्येक माइक्रोस्कोपी सत्र की उपज को अधिकतम करने के लिए कुशलतापूर्वक उपयोग किया जाना चाहिए । डेटा संग्रह के लिए उपलब्ध सीमित समय के साथ संयुक्त झुकाव श्रृंखला के सैकड़ों प्राप्त करने की आवश्यकता है जो डेटा गुणवत्ता से समझौता किए बिना बेहतर थ्रूपुट प्राप्त करने के लिए उपन्यास छवि अधिग्रहण दिनचर्या के लिए कहा जाता है। हार्डवेयर और इमेजिंग वर्कफ्लो में हाल की घटनाओं ने झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण18, 19की गति में काफी वृद्धि की है, जिसके परिणामस्वरूप वास्तविक झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण के लिए आवश्यक अधिग्रहण बिंदु और समयस्थापितकरने के लिए खर्च किए गए समय के बीच अनुपात का नाटकीय बदलाव हुआ है। कुल मिलाकर, अधिग्रहण बिंदुओं को स्थापित करने की प्रक्रिया क्रायोईटी सत्रों के प्राप्त थ्रूपुट के लिए प्रमुख बाधाओं में से एक होती जा रही है ।
यहां प्रस्तुत अनुकूलित प्रोटोकॉल ने हमें ऑफ-लाइन मोड में, क्रायोएट सत्र के पहले दिन के भीतर स्वचालित टोमोग्राफिक अधिग्रहण के लिए 171 पदों को स्थापित करने में सक्षम बनाया, जबकि माइक्रोस्कोप सक्रिय रूप से अन्य कार्यों (जैसे, स्क्वायर मैपिंग, ट्यूनिंग और स्वचालित झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण) में लगाया गया था, इस प्रकार डेटा संग्रह के लिए उपलब्ध माइक्रोस्कोप समय को प्रभावित किए बिना। क्रायोईटी सत्र के थ्रूपुट को अधिकतम करने के अलावा, यह पाइपलाइन स्वचालित डेटा संग्रह सत्र के प्रारंभिक चरण में उपयोगकर्ता द्वारा निवेश किए गए समय की मात्रा को काफी कम कर देती है। वर्णित प्रोटोकॉल में, उपयोगकर्ता को ब्याज के उपयुक्त क्षेत्रों की पहचान करने और उन्हें अधिग्रहण बिंदुओं के रूप में धारावाहिक ईएम नेविगेटर में जोड़ने के लिए मैप किए गए ग्रिड वर्गों को ब्राउज़ करने के लिए कहा जाता है। इसके बाद वर्चुअल मैप्स16के उत्पादन के लिए PyEM टूल द्वारा सीरियलईएम के भीतर सभी लक्ष्यों को स्वचालित रूप से बैच में संसाधित किया जाएगा । प्रस्तुत कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण इसलिए मंच आंदोलन, छवि अधिग्रहण, दृश्य और पूर्वावलोकन के बीच इमेजिंग शर्तों के परिवर्तन, और उच्च आवर्धन पर केंद्रित करते हुए इन चरणों के अंतिम पुनरावृत्ति से जुड़े प्रतीक्षा अवधि को नष्ट करके वास्तविक प्रस्तोता नक्शे प्राप्त करने की तुलना में काफी तेज है। इसके अतिरिक्त, जैसा कि प्रत्येक अधिग्रहीत छवि ब्याज23की वस्तु पर इलेक्ट्रॉन खुराक का संचय करती है, लक्ष्यों के सटीक पुनर्संरेखण के लिए आभासी मानचित्रों का उपयोग वास्तविक झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण से पहले क्रायोएट सत्र के प्रारंभिक चरण में शुरू किए गए विकिरण क्षति को कम कर देता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण से पहले लक्ष्य के पुनर्संरेखण के लिए मध्यवर्ती और उच्च आवर्धन आभासी नक्शे (क्रमशः पूर्वावलोकन और दृश्य) दोनों का उपयोग करता है । इस प्रक्रिया को आसानी से केवल मध्यवर्ती आवर्धन दृश्य छवि का उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है जब संरेखण सटीकता कम महत्व की है, उदाहरण के लिए, बड़ी संरचनाओं के मामले में जहां अंतिम लक्ष्य सटीकता कम चिंता का विषय है10 या एकल कण विश्लेषण नमूनों के लिए जो क्रायो-ग्रिड पर खराब प्रसारित होते हैं, प्रत्येक अधिग्रहण बिंदु24के उपयोगकर्ता के मैनुअल चयन की आवश्यकता होतीहै, 25. अंत में, एक डमी सीरियलम उदाहरण के ऑफ-लाइन उपयोग पर आधारित एक दृष्टिकोण माइक्रोस्कोप में उपयोगकर्ता की भौतिक उपस्थिति की आवश्यकता को कम करके रिमोट कनेक्शन के माध्यम से अधिग्रहण बिंदुओं के सेटअप की सुविधा भी प्रदान करता है, इस प्रकार सुविधा के परिचालन संगठन के मामले में अधिक लचीलापन सक्षम करता है।
क्रायोएट के लिए प्रौद्योगिकी और तरीकों में हालिया प्रगति ने स्वचालित डेटा संग्रह सत्रों की गति और विश्वसनीयता में काफी सुधार किया है। हालांकि, इस विधि के शेष दर-सीमित कदमों को संबोधित करने के लिए आगे के घटनाक्रमों की आवश्यकता है। सबसे विशेष रूप से, ग्रिड और स्क्वायर मैपिंग का प्रारंभिक कदम अब सत्र सेटअप की प्रमुख बाधाओं में से एक होता जा रहा है, इस प्रकार सीधे इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों द्वारा माइक्रोस्कोप चरण आंदोलनों और छवि अधिग्रहण की गति बढ़ाने के उद्देश्य से हार्डवेयर सुधारों की आवश्यकता पैदा हो रही है। इसके अतिरिक्त, लक्ष्य पहचान की प्रक्रिया को पूरी तरह से स्वचालित करने के लिए मशीन लर्निंग दृष्टिकोण का विकास रुचि के क्षेत्रों का चयन करने के लिए उपयोगकर्ताओं के दृश्य निरीक्षण की आवश्यकता को खत्म करने के लिए महत्वपूर्ण होगा, एक समय लेने वाली प्रक्रिया जो उपयोगकर्ताओं की विशेषज्ञता पर निर्भर करती है।
Disclosures
लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।
Acknowledgments
हम जर्मनी के हीडलबर्ग में यूरोपियन मॉलिक्यूलर बायोलॉजी लेबोरेटरी में स्ट्रक्चरल एंड कम्प्यूटेशनल बायोलॉजी यूनिट और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोर फैसिलिटी और iNEXT-डिस्कवरी (प्रोजेक्ट नंबर 871037) से समर्थन स्वीकार करते हैं । हम सीरियलेम सॉफ्टवेयर पैकेज के लेखक, प्रोफेसर डेविड मास्ट्रोनार्ड से उत्कृष्ट समर्थन के लिए बेहद आभारी हैं। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए हरमन फंग को भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
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