Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Strategier for optimering af kryogene Electron Tomography Data Acquisition

Published: March 19, 2021 doi: 10.3791/62383
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Structural and Computational Biology Unit, European Molecular Biology Laboratory, 2Electron Microscopy Core Facility, European Molecular Biology Laboratory, 3Imaging Centre, European Molecular Biology Laboratory

Summary

Den stigende efterspørgsel efter storstilet dataindsamling i kryogene elektrontomografi kræver høj-throughput billedopsamling rutiner. Beskrevet her er en protokol, der gennemfører den seneste udvikling af avancerede erhvervelsesstrategier, der sigter mod at maksimere tidseffektiviteten og gennemløbet af tomografisk dataindsamling.

Abstract

Kryogen elektrontomografi (cryoET) er en kraftfuld metode til at studere 3D-strukturen af biologiske prøver i en nær-til-indfødt tilstand. Nuværende state-of-the-art cryoET kombineret med subtomogram gennemsnit analyse gør det muligt for høj opløsning strukturel bestemmelse af makromolekylære komplekser, der er til stede i flere kopier inden for tomografiske rekonstruktioner. Tomografiske eksperimenter kræver normalt, at en stor mængde tilt-serier erhverves ved hjælp af avancerede transmissionselektronmikroskoper med vigtige driftsomkostninger. Selv om gennemstrømningen og pålideligheden af automatiserede dataindsamlingsrutiner konstant er blevet forbedret i de senere år, kan processen med at vælge interesseregioner, hvor der vil blive erhvervet en tilt-serie, ikke let automatiseres, og den er stadig afhængig af brugerens manuelle input. Derfor er opsætningen af en storstilet dataindsamlingssession en tidskrævende procedure, der kan reducere den resterende mikroskoptid, der er tilgængelig til tilt-serieerhvervelse, betydeligt. Her beskriver protokollen de nyligt udviklede implementeringer baseret på SerialEM-pakken og PyEM-softwaren, der forbedrer tidseffektiviteten af netscreening og dataindsamling af store hældningsserier betydeligt. Den præsenterede protokol illustrerer, hvordan serialem-scriptfunktioner bruges til fuldt ud at automatisere gittertilknytning, grid square-tilknytning og hentning af tilt-serier. Desuden beskriver protokollen, hvordan man bruger PyEM til at vælge yderligere anskaffelsesmål i offlinetilstand, når automatiseret dataindsamling er startet. For at illustrere denne protokol beskrives dens anvendelse i forbindelse med high-end dataindsamling af Sars-Cov-2 tilt-serien. Den præsenterede rørledning er især velegnet til at maksimere tidseffektiviteten af tomografieksperimenter, der kræver en omhyggelig udvælgelse af anskaffelsesmål og samtidig en stor mængde vippeserier, der skal indsamles.

Introduction

Kryogene elektronmikroskopimetoder (kryoEM) er baseret på billeddannelse af biologiske prøver ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop (TEM) efter deres hurtige vitrifikation, en prøveforberedelsesproces, der bevarer de molekylære og cellulære strukturer af prøver i tæt på indfødte og hydrerede tilstand1,2. I kryogen elektrontomografi (cryoET) opnås en 3D-model af den forglassede prøve ved at erhverve en række billeder af samme interesseregion fra forskellige retninger, den såkaldte tilt-serie, efterfulgt af den beregningsmæssige rekonstruktion af det tomografiske bind3. Denne avancerede billeddannelsesteknik er modnet til en kraftfuld metode til strukturel undersøgelse af biologiske processer i forbindelse med deres oprindelige cellulære miljøer4,5,6.

Ud over den ultrastrukturelle analyse af den forglassede prøve kan der opnås højopløsningsrekonstruktioner af makromolekylære komplekser, der er til stede i flere kopier inden for det tomografiske volumen, ved at anvende subtomogram i gennemsnit5. Denne rekonstruktionsmetode er baseret på den iterative tilpasning og gennemsnit af undermængder , der indeholder interessestrukturen , og den har til formål at øge signal-til-støj-forholdet og løsningen af den endelige genopbygning7,8. Subtomogram gennemsnit er afhængig af indsamling og behandling af en stor mængde data, der ofte kræver erhvervelse af hundredvis af tilt-serien ved hjælp af high-end TEMs med belastende driftsomkostninger.

I øjeblikket er opsætningen af sådanne automatiserede cryoET-sessioner en tidskrævende proces, der normalt er afhængig af brugerens manuelle input9,10,11. Typisk identificeres mål ved visuel inspektion af det tilknyttede gitter og derefter konfigureres til automatiseret dataindsamling. Brugerens effektivitet med hensyn til at identificere anskaffelsespunkter påvirkes ofte af prøvens art og bliver særlig udfordrende, når der analyseres rensede makromolekyler med suboptimal koncentration eller i tilfælde af sjældne hændelser i overfyldte cellemiljøer, hvilket indebærer brug af korrelative tilgange12. Desuden kræver aktuelle arbejdsgange erhvervelse af billeder under opsætning ved forskellige forstørrelser , der senere vil blive brugt til præcis lokalisering og centrering af målet under automatiseret erhvervelse11,13,14. Disse trin til justering af høj præcision er afgørende for programmer med høj opløsning, som kræver, at afbildningen udføres ved høj forstørrelse og kræver nøjagtige centreringstrin for at bevare interesseområdet inden for det resulterende lille synsfelt. I alt er flere timer af hver dataindsamlingssession forpligtet til denne tidskrævende procedure, hvor TEM ikke er involveret i tilt-serieerhvervelse. Afhængigt af den mængde tilt-serier, der kræves, kan identifikation og opsætning af anskaffelsessteder derfor have en betydelig indvirkning på den mikroskoptid, der er til rådighed til dataindsamling under en cryoET-session.

Beskrevet her er en optimeret protokol baseret på SerialEM softwarepakke15 og den nyeste version af PyEM software16 til at kortlægge gitre, kort gitter firkanter, vælge mål, og oprette automatiserede dataindsamling for store tilt serie samling. Det centrale koncept for denne tilgang er at give SerialEM med beregningsmæssigt genererede billeder af PyEM for hver erhvervelse element, præget virtuelle kort, for nøjagtig lokalisering og centrering af målet. For at opnå faktisk anskaffelsestid udføres udvælgelsen af målene samt oprettelsen af de virtuelle kort offline ved hjælp af en anden dummy-forekomst af SerialEM, der afkobler udvælgelsesprocessen for erhvervelsesmål fra TEM-operationer. Selvom det ikke adresserer, hvordan man øger datakvaliteten13,17 eller hastigheden af tilt-seriens erhvervelse18,19, er denne protokol primært fokuseret på strategier til at optimere tidseffektiviteten af opsætningen af store automatiserede cryoET-sessioner. Derfor er implementeringen af den præsenterede protokol beregnet til de forskere, der etablerer cryoET-dataindsamlingsarbejdsgange, der ønsker at maksimere udbyttet af automatiseret dataindsamling ved at øge den mikroskoptid, der er tilgængelig til tilt-serieerhvervelse.

Protocol

Den protokol, der er beskrevet her, er en del af et mere omfattende dokument, der er produceret af EMBL CryoEM Service Platform, der indeholder grundige trinvise instruktioner og skærmbilleder, der illustrerer hele proceduren for en typisk cryoET-session, herunder prøveindlæsning, gitterkortlægning, mikroskopjustering, opsætning af erhvervelsespunkter og automatiseret dataindsamling. Den fulde protokol kan downloades på følgende link: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download

1. Forudsætninger

  1. Installer SerialEM version 3.8, og konfigurer den til at styre mikroskopet og detektoren (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm).
  2. Installer en dummy-forekomst af SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).
  3. Installer PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).

2. Tilknytning af gitter

  1. Læg en kassette med gitre i mikroskopets autoloader.
  2. Konfigurer billedbehandlingsforhold, der er egnede til tilknytning af hele gitteret. Gør dette ved den lavest mulige forstørrelse under hensyntagen til synsfeltet på den anvendte detektor (EFTEM SA 2250x). Gem billedtilstandene som en SerialEM Imaging-tilstand for at gøre tingene praktiske til senere brug.
  3. Opsætning af fuld montage
    1. Åbn menuen SerialEM Navigator.
    2. Vælg Montaging &grids.
    3. Vælg Konfigurer fuld montage.
  4. Start scriptet Grid_Mapping. Lad scriptet vente på, at autoloaderen køler af. gøre en opgørelse og derefter kortlægge hvert gitter, at lagerproceduren fundet. Indtast en e-mail via Menuen Tilt-serien, så scriptet nemt kan sende en e-mail, når det er gjort.
  5. Gem Navigator.
  6. Undersøg alle gittertilknytninger fra SerialEM Navigator, og vælg, hvilket gitter der skal tilknyttes yderligere ved højere forstørrelse.
    BEMÆRK: Mange TEMs udstyret med en autoloader system vil vise en rotation af nettet, når genindlæses. Det er bedst at kortlægge ethvert gitter igen efter at have genindlæst det. Alternative systemer lider normalt kun under nogle skift, som kan korrigeres i SerialEM med en Skift til markør-procedure.

3. Opsætning af SerialEM lav dosis

  1. Indstil forstørrelsen af tilstandene Vis og vis for seriel for lavt dosis (dette kræves til trin 6).
  2. Hent et View-billede, og gem det som et kort i Navigator.
  3. Hent et eksempelbillede, og gem det som et kort i Navigator.
    1. Indstil begge tilstande til samme placering (placering 4 foreslås). Dette gør det muligt at gemme de to kort i en billedstak.
    2. I vinduet SerialEM Navigator skal du ændre etiketten for visningsoversigten til Vis og etiketten for eksempeloversigten til Eksempel.
    3. Gem og luk navigatorfilen.
      BEMÆRK: Der kræves ikke noget mål for de første View- og Preview-billeder, PyEM bruger blot deres billedindstillinger.

4. Grid firkantet kortlægning

  1. Konfigurer billedbetingelserne til at tilknytte gitterkvadrer. Det er af stor betydning at kunne se stikprøven af interesse og den finansielle perledistribution. Udfør følgende trin for at sikre optimal kontrast for gitterkvadrerede kort.
    1. Indsæt en målåbning.
    2. Hvis det er relevant, skal du indsætte energifilteret slids.
    3. Brug en defokus på -100 μm.
  2. Skærm til gode gitter firkanter egnet til yderligere kortlægning. Efter visuel inspektion af kvadraterne fra gitterkortet, tag testbilleder af pladsen med de billedbetingelser, der skal bruges til gitter firkantede kort.
  3. Når der identificeres en god firkant, skal du markere dens midte i gittertilknytningsbilledet ved hjælp af funktionen Tilføj punkter i SerialEM Navigator.
  4. Når alle punkterne er tilføjet, skal du trykke på Skift + A på det første punkt i SerialEM Navigator og derefter trykke på Skift + A på det sidste punkt.
    BEMÆRK: Alle tilføjede punkter er nu markeret med et A, hvilket betyder, at de alle er erhvervelsespoint.
  5. Tryk på Skift + N (opret en ny fil ved elementet) på det første punkt og derefter igen på det sidste punkt. Vælg Montaged Imagesi den dialogboks, der kommer op.
  6. Når montagedialogboksen vises, skal du oprette en montagestørrelse, der dækker et gitterfelt. Dette afhænger af forstørrelsen og maskestørrelsen af de anvendte gitre og kræver typisk 2 x 2 til 4 x 4 montager. Giv det et navn med et nummer (f.eks. squaremap_01.mrc), så SerialEM nemt kan nummerere alle filerne pr. gitterfelt.
  7. Start gittertilknytningen ved at åbne menuen SerialEM Navigator , og klik på Hent ved elementer.
  8. Vælg følgende indstillinger i pop op-menuen.
    1. Vælg Grov eucentricitet.
    2. Vælg Hent kortbillede.
    3. Vælg Luk kolonneventiler i slutningen.
    4. Vælg Send mail i slutningen.

5. Valg af mål

  1. Åbn en dummy SerialEM-forekomst. Dette kan konfigureres på den SerialEM-pc, der styrer mikroskopet eller på en anden (understøttende) pc, hvis begge computere deler en netværksforbindelse.
  2. Når det første gitterfelt er tilknyttet, skal du bruge menuindstillingen SerialEM Navigator Flet for at få vist montagen i SerialEM-forekomsten.
  3. Dobbeltklik på vinduet Navigator for at åbne gittertorvkortet.
  4. Søg på kortet, og brug indstillingen dummy SerialEM Navigator Tilføj point for at tilføje billederhvervelsespunkter på målet for interesse.
  5. Når du er færdig og efter tilknytning af de nye firkanter, skal du gemme Navigator-filen og flette Navigator igen. fortsætte, indtil alle gitterkvadrer er tilknyttet.

6. Generer virtuelle kort

  1. Du kan endnu en gang flette navigatorfilen med SerialEM-forekomsten, der er dummy.
  2. Kør Scriptet PyEM Virtual maps fra menuen SerialEM, Tools , og vælg Virtual Anchor Maps. Dette kan tage et stykke tid afhængigt af størrelsen og mængden af gitteret firkantede kort og placering af View og Preview kort.
    BEMÆRK: PyEM starter et kommandovindue, der automatisk lukkes, når det er gjort, og derefter kan den nye navigatorfil åbnes. PyEM skriver et enkelt flettet kort og alle dets View- og Preview-kort pr. montagekort, der indeholder udvalgte punkter. Endelig skriver den en ny Navigator-fil med navnet <navigatorfilnavn>_automaps.nav.

7. Mikroskop tuning

  1. Tjek mikroskopet tuning. For at sikre korrekt mikroskopydelse skal du bruge den samme opsætning af forstørrelse og strålestørrelse til dataopsamling i følgende rækkefølge.
    1. Kør SeriaLEM Coma-fri tilpasning af CTF (Zemlin tableau).
    2. Indsæt og centrer en målåbning.
    3. Kør SerialEM Korrekt astigmatisme af CTF (auto-stigmate).
    4. Kør GIF Quick Tune (dvs. kun spaltefokus).
      BEMÆRK: Da trin 7.1.1, 7.1.3 og 7.1.4 kan kræve mere dosishastighed, bør kun punktstørrelsen ændres; strålestørrelsen bør ikke ændres, da dette forårsager strålehældning, hvilket gør tuningerne forkerte. Trin 7.1.1, 7.1.2 og 7.1.3 er halvautomatiske i dette offentligt tilgængelige script (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).

8. Konfigurer Navigator

  1. Åbn den nye navigatorfil med navnet _automaps.nav i SerialEM.
    BEMÆRK: V_yyyy er View-kortene, og P_yyyy er eksempelkortene. Eksempelkortene er angivet som Anskaffelsespoint.
  2. I vinduet SerialEM Navigator skal du fravælge alle A-punkter, markere den første V_yyyy-tilknytning, vælge Skjul, klikke på A to gange og fravælge Skjul.
  3. Marker den første V_yyyy position, tryk på Skift + T, vælg derefter den allersidste V_yyyy position, og tryk på Skift + T igen.
  4. Vælg Enkeltrammebilleder i egenskaberne for den fil, der skal åbnes.
  5. Vælg de ønskede parametre i den næste dialogboks Filegenskaber i overensstemmelse med billedbehovene og instrumentopsætningen.
  6. Når du bliver bedt om det, skal du give et navn med et nummer (f.eks. TS_001.mrc) og klikke på Gem.
    BEMÆRK: SerialEM nummererer automatisk filnavnene for alle tilt-serier.
  7. Konfigurer vippeseriecontrolleren til den første TS-position. Når du er færdig, skal du klikke på OK for at angive disse parametre for alle tilt-serier efter denne anskaffelsesvare. Alle eksempeltilknytninger er nu valgt som TS (Tilt Series) med nummereret filnavn TS_xxx.mrc.
    BEMÆRK: Man kan ændre parametrene manuelt senere ved hjælp af funktionen Navigator TSparams. ændringer vil blive anvendt for alle poster nedad på listen. Brugeren har mulighed for at køre et brugerdefineret script i stedet for tilt-serien.

9. Indstil fokus/sporpositioner

  1. Indstil fokus/sporafstand for hvert mål, hvis det er nødvendigt (sørg for, at SerialEM-lavdosis er slået til).
  2. Dobbeltklik på visningsoversigten for at indlæse den.
  3. Vælg eksempeloversigten på listen Navigator.
  4. Vælg Rediger fokus i vinduet Navigator.
  5. I panelet Lav dosis skal du fravælge Roter akse mellem områder for at placere Forsøg og Fokus langs trinhældningsaksen.
  6. Klik på det ønskede område i det indlæste visningskort for at indstille fokus/prøveposition for denne hældningsserie.
  7. Kontroller, at TSP er angivet nu for navigatorelementet. gentag proceduren for alle elementerne.
    BEMÆRK: Fokus-/sporpositioner kopieres automatisk nedad i Navigator. Hvis fokus/sporpositionen for det forrige element er på den rigtige side og med den korrekte afstand, er det derfor ikke nødvendigt at ændre den for det aktuelle element.

10. Oprette yderligere scripts

  1. To scripts håndterer Fokusområdet: pretomo og duringtomo. Pretomo-scriptet kører før hver tilt-serie og undertomo-scriptet under hver hældning.
  2. Rediger fokusområdet i scriptfortolkten.
  3. I menuen SerialEM Tilt Series skal du kontrollere Kør script i TS og vælge scriptnummeret på undertomo-scriptet.

11. Kør

  1. Tjek nitrogentankniveauet.
  2. Kontroller, om Autoloader-turboen er valgt.
  3. Kontroller den ledige datalagringsplads.
  4. Fravælg fortløbende lagring af logfilen i serialEM-menuen, og luk alle aktuelt åbne logfiler. Hver tilt-serie får sin egen logfil.
  5. Klik på Hent på Elementer imenuen Navigator .
  6. Kør scriptet PreTomo.
  7. Vælg Primær opgave Hent til-tilt-serie.
  8. Vælg Kør script efter PostTomo.
  9. Vælg Luk kolonneventiler i slutningen.
  10. Vælg Send mail i slutningen.
  11. Klik på START.
    BEMÆRK: SerialEM sender en e-mail pr. tilt-serie, enten vellykket eller fejl; fejl kan dog også betyde, at hele hældningsområdet ikke blev nået.

Representative Results

Denne procedure blev anvendt til at erhverve Sars-Cov-2 tilt-serien, der er beskrevet i Turonova et al. 202020; hele datasættet blev produceret ved hjælp af tre forskellige gitre over tre mikroskopisessioner i EMBL Heidelberg. Den aktuelle undersøgelse vil fokusere på og beskrive de første 3-dages (~ 72 timer) session køre med det første gitter.

Efter at hele gitteret var kortlagt ved lav forstørrelse (~ 10 min., se trin 2), blev der valgt 71 egnede firkanter på gitterkortet, og der blev erhvervet kort med medium forstørrelse (firkantede kort) med indstillinger (forstørrelse, eksponering, defokusering), der giver mulighed for direkte visualisering og identifikation af stikprøven af interesse, coronavirus i dette tilfælde (se trin 4) (Figur 1A). Anskaffelsestiden var ~ 3 min pr. Kvadrat, 3 timer 45 min i alt.

Så snart det første firkantede kort blev oprettet, blev der åbnet en dummy SerialEM-forekomst (uden nogen kontrol på kamera eller mikroskop) på en separat computer for at visualisere det firkantede kort og tilføje punkter på mål, der er egnede til erhvervelse af tilt-serien (se trin 5) (Figur 1B). Nyerhvervede firkantede kort blev hentet ved at flette den aktuelle dummy SerialEM navigator med navigatoren fra den overtagende SerialEM-forekomst. Efter ~ 2 timer af nettet firkantede erhvervelse og udvælgelse, 50 oprindelige mål kunne identificeres.

Efter at erhvervelserne af det firkantede kort var afsluttet, blev SerialEM-lavdosis oprettet, og referencebilleder af Visning og Forhåndsvisning blev taget og gemt som kort (se trin 3). Sidstnævnte kort kunne derefter bruges straks på dummy SerialEM instans til at generere, fra de tilsvarende firkantede kort billeder, Virtual View (Figur 1C) og Virtual Preview (Figur 1D)kort over de 50 udvalgte mål med PyEM software suite, for en behandlingstid på ~ 30 min (se trin 6). Denne behandlingstid på dummy SerialEM session blev brugt til at udføre de endelige forberedelser af mikroskopet til erhvervelse: energifilter tuning, nye kamera få reference billede erhvervelse, anstiftelse-og koma-fri tilpasning af den objektive linse.

Når mikroskopjusteringen var afsluttet, og der blev oprettet virtuelle kort fra de 50 oprindelige mål, blev den faktiske SerialEM-navigator, der skulle bruges til anskaffelse, oprettet (se trin 8), fokus- og sporpositioner blev indstillet (trin 9), og tilt-seriens erhvervelse kunne startes (se trin 10 og 11). Virtual View-kortene (Figur 1C) blev brugt til en indledende centrering af målet (Figur 1E) efterfulgt af en endelig centrering udført ved den faktiske forstørrelse af tilt-seriens anskaffelse (Figur 1F) ved hjælp af kortet For virtuel prøveversion (Figur 1D).

Begyndende med gitter kortlægning på 9:30 om morgenen, erhvervelsen af tilt serien for de 50 oprindelige mål begyndte på omkring 15:00. Med de indstillinger, der anvendes til tomografisk erhvervelse (se referencen for detaljer), en tilt serie tog ~ 20 min at erhverve, med nok mål derefter at køre gennem hele natten. Mens overtagelsen kørte, kunne resten af de firkantede kort inspiceres og flere mål tilføjes, stadig offline via dummy SerialEM instans. 121 flere mål blev valgt blandt de resterende firkantede kort og føjet til erhvervelsen SerialEM navigator efter virtuelle kort var blevet oprettet for disse nye mål, nok til at køre indtil afslutningen af 72 timer session.

Denne procedure (sammenfattet i figur 2) gjorde det muligt på en enkelt arbejdsdag at opstille 171 mål for automatiserede tomografiske erhvervelser i en 72 timer (3 dage) mikroskopsession.

Figure 1
Figur 1: Eksempel på firkantet kort med repræsentative virtuelle kort og tilsvarende erhvervelser efter centrering. (A) Repræsentativt kvadratkort over et Sars-Cov-2 kryoEM-gitter, der bruges i Turonova et al.20. Fire interesseregioner er markeret med et rødt kors. Mikroskopforstørrelse er 2.250x. (B) Beskær ud af det firkantede kort, der fremhæver de områder, der blev brugt til at generere virtual view-kort (orange) og gult eksempelkort for det valgte kort over virtuel visning (rødt kryds) (C). (D) Virtual Preview-kort. (E) Erhvervelse af faktisk visning efter centrering ved hjælp af virtual view-kortet som reference. Mikroskopforstørrelse er 11.500x. (F) 0° hældningsanskaffelse fra tilt-serien efter centrering ved hjælp af virtual preview-kortet som reference. Mikroskopforstørrelse er 64.000x. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: CryoET-sessionsarbejdsgang ved hjælp af SerialEM med PyEM-værktøjer. Klik her for at få vist en større version af dette tal.

Discussion

Fra en nicheteknik er cryoET nu modnet til en udbredt metode til at udføre strukturelle undersøgelser på cellulært og molekylært niveau med hidtil uset tilgængelig opløsning21,22. Den stadigt stigende efterspørgsel efter kryoEM-billeddannelse har lagt pres på de begrænsede ressourcer, der er til rådighed for at få adgang til denne teknologi. På trods af åbningen af en række nationale kryoEM-faciliteter og de videnskabelige institutters bestræbelser på at øge deres TEM-kapacitet til at understøtte samfundets behov i hele verden er adgangen til cryoEM-instrumenter stadig begrænset, og den tid, der er til rådighed til dataindsamling, skal derfor anvendes effektivt af brugerne til at maksimere udbyttet af hver mikroskopisession. Behovet for at erhverve hundredvis af tilt-serien kombineret med den begrænsede tid til rådighed for dataindsamling opfordrede til nye billedopsamling rutiner for at opnå bedre gennemløb uden at gå på kompromis med datakvaliteten. Den seneste udvikling inden for hardware- og billedbehandlingsarbejdsgange har øget hastigheden på erhvervelsen af tilt-serienbetydeligt 18,19, hvilket har resulteret i et dramatisk skift i forholdet mellem den tid, der bruges på at oprette et anskaffelsespunkt og den tid, der er nødvendig for den faktiske erhvervelse af tilt-serien. Alt i alt er proceduren for oprettelse af erhvervelsespoint ved at blive en af de største flaskehalse for den opnåelige gennemstrømning af cryoET-sessioner.

Den optimerede protokol, der præsenteres her, gjorde det muligt for os i offline-tilstand at oprette 171 positioner til automatiseret tomografisk erhvervelse inden for den første dag i en cryoET-session, mens mikroskopet var aktivt involveret i andre operationer (f.eks. firkantet kortlægning, tuning og automatiseret tilt-serieerhvervelse), hvilket ikke påvirker den mikroskoptid, der er tilgængelig til dataindsamling. Ud over at maksimere gennemløbet af en cryoET-session reducerer denne pipeline drastisk den tid, brugeren investerer i den forberedende fase af en automatiseret dataindsamlingssession. I den beskrevne protokol bliver brugeren bedt om at gennemse de tilknyttede gitterkvadrer for at identificere egnede interesseområder og føje dem til Serial EM Navigator som anskaffelsespunkter. Alle mål behandles derefter automatisk i batch i SerialEM af PyEM-værktøjet til produktion af de virtuelle kort16. Den præsenterede beregningsmæssige tilgang er derfor betydeligt hurtigere end at erhverve reelle forankring kort ved at fjerne ventetider i forbindelse med fase bevægelse, image erhvervelse, ændring af billeddannelse betingelser mellem View og Preview, og ved den endelige gentagelse af disse trin, mens centrering ved høj forstørrelse. Da hvert erhvervet billede fører til akkumulering af elektrondosis på genstanden for interesse23, reducerer brugen af virtuelle kort til præcis justering af målene de strålingsskader, der blev introduceret i den forberedende fase af en cryoET-session før den faktiske tilt-serieerhvervelse. Den protokol, der er beskrevet her, gør brug af både mellemliggende og høj forstørrelse virtuelle kort (Preview og Vis, henholdsvis) for justering af målet før tilt serien erhvervelse. Denne procedure kan let ændres til kun at bruge det mellemliggende forstørrelsesbillede Se billedet, når justeringsnøjagtigheden er mindre vigtig, for eksempel i tilfælde af store strukturer, hvor den ultimative målnøjagtighed er mindre bekymrende10 eller for enkelt partikelanalyseprøver, der er dårligt spredt på kryogitteret, der kræver brugerens manuelle valg af hvert erhvervelsespunkt24, 25 - 25 - 25, 2 Endelig letter en tilgang baseret på offline brug af en dummy SerialEM-instans også opsætningen af erhvervelsespunkter via fjernforbindelse ved at minimere behovet for brugerens fysiske tilstedeværelse ved mikroskopet, hvilket muliggør mere fleksibilitet med hensyn til anlæggets operationelle organisation.

De seneste teknologiske fremskridt og metoder til cryoET har drastisk forbedret hastigheden og pålideligheden af automatiserede dataindsamlingssessioner. Der er dog behov for yderligere udviklinger for at tage fat på de resterende satsbegrænsende trin i denne metode. Mest bemærkelsesværdigt er det første trin i net- og kvadratkortlægning nu ved at blive en af de største flaskehalse i sessionsopsætningen, hvilket skaber behovet for hardwareforbedringer, der sigter mod at øge hastigheden af mikroskopstadiebevægelser og billederhvervelse af de direkte elektrondetektorer. Derudover vil udviklingen af maskinlæringsmetoder til fuldt ud at automatisere processen med målidentifikation være afgørende for at eliminere behovet for brugernes visuelle inspektion for at vælge de regioner, der er af interesse, en tidskrævende procedure, der er afhængig af brugernes ekspertise.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi anerkender støtte fra den strukturelle og beregningsmæssige biologienhed og Elektronmikroskopikernefaciliteten på Det Europæiske Molekylærbiologiske Laboratorium i Heidelberg, Tyskland og fra iNEXT-Discovery (projektnummer 871037). Vi er meget taknemmelige for den fremragende støtte fra forfatteren af SerialEM-softwarepakken, professor David Mastronarde. Vi takker også Herman Fung for den kritiske læsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission Electron Microscope Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
  2. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  3. Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: From Cells to Molecules. Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 833-865 (2005).
  4. Pfeffer, S., Mahamid, J. Unravelling molecular complexity in structural cell biology. Current Opinion in Structural Biology. 52, 111-118 (2018).
  5. Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 58, 1-9 (2019).
  6. Bohning, J., Bharat, T. A. M. Towards high-throughput in situ structural biology using electron cryotomography. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , (2020).
  7. Briggs, J. A. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging. Current Opinion in Structural Biology. 23 (2), 261-267 (2013).
  8. Wan, W., Briggs, J. A. G. Methods in Enzymology. 579, Elsevier. NY. 329-367 (2016).
  9. Tan, Y. Z., Cheng, A., Potter, C. S., Carragher, B. Automated data collection in single particle electron microscopy. Microscopy. 65 (1), 43-56 (2016).
  10. Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (107), e53608 (2016).
  11. Resch, G. P. Methods in Cell Biology. 152, Elseiver. NY. 135-178 (2019).
  12. Bharat, T. A., Kukulski, W. Correlative Imaging: Focusing on the Future. , John Wiley & Sons. NY. 137-153 (2019).
  13. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  14. O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, R. J., Mastronarde, D. Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , Springer, Cham. 95-116 (2018).
  15. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  16. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16, 471-477 (2019).
  17. Turonova, B., et al. Benchmarking tomographic acquisition schemes for high-resolution structural biology. Nature Communications. 11 (1), 876 (2020).
  18. Chreifi, G., Chen, S., Metskas, L. A., Kaplan, M., Jensen, G. J. Rapid tilt-series acquisition for electron cryotomography. Journal of Structural Biology. 205 (2), 163-169 (2019).
  19. Eisenstein, F., Danev, R., Pilhofer, M. Improved applicability and robustness of fast cryo-electron tomography data acquisition. Journal of Structural Biology. 208 (2), 107-114 (2019).
  20. Turonova, B., et al. In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges. Science. 370 (6513), 203-208 (2020).
  21. O'Reilly, F. J., et al. In-cell architecture of an actively transcribing-translating expressome. Science. 369 (6503), 554-557 (2020).
  22. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.7 Å inside cells. Nature Methods. 18, 186-193 (2020).
  23. Karuppasamy, M., Karimi Nejadasl, F., Vulovic, M., Koster, A. J., Ravelli, R. B. G. Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate. Journal of Synchrotron Radiation. 18 (3), 398-412 (2011).
  24. Liberta, F., et al. Cryo-EM fibril structures from systemic AA amyloidosis reveal the species complementarity of pathological amyloids. Nature Communications. 10 (1), 1104 (2019).
  25. Radamaker, L., et al. Cryo-EM structure of a light chain-derived amyloid fibril from a patient with systemic AL amyloidosis. Nature Communications. 10 (1), 1103 (2019).

Tags

Biologi Problem 169 kryogen elektrontomografi automatisering høj gennemløb PyEM SerialEM
Strategier for optimering af kryogene Electron Tomography Data Acquisition
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb,… More

Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition. J. Vis. Exp. (169), e62383, doi:10.3791/62383 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter