Summary
单颗粒冷冻电子显微镜需要合适的软件包和用户友好的管道来实现高通量自动数据采集。在这里，我们介绍了全自动图像采集软件包Latitude-S的应用，以及用于在低剂量条件下收集玻化生物分子数据的实用管道。
Abstract
近年来，单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）的技术和方法学进步为生物大分子的高分辨率结构测定铺平了新的途径。尽管冷冻电镜取得了显著进展，但在单颗粒分析工作流程的各个方面仍有改进的余地。单颗粒分析需要合适的软件包来实现高通量自动数据采集。在过去八年中，开发了几个自动数据采集软件包，用于单颗粒冷冻电镜的自动成像。本文提出了一种全自动图像采集管线在低剂量条件下用于玻化生物分子的应用。
它演示了一个软件包，可以完全、自动、精确地收集冷冻电镜数据。此外，该软件包可以轻松控制各种微观参数。该协议证明了该软件包在配备直接电子探测器（DED）的200 keV冷冻电子显微镜对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白进行自动成像方面的潜力。在单次（48小时）的数据收集中采集了大约3，000张冷冻电镜电影图像，产生了SARS-CoV-2刺突蛋白的原子分辨率结构。此外，该结构研究表明，刺突蛋白采用两种主要构象，1-RBD（受体结合结构域）向上开放，所有RBD向下闭合构象。
Introduction
单颗粒冷冻电镜已成为生物大分子高分辨率结构测定的主流结构生物学技术1。单颗粒重建依赖于获取大量玻化样品的显微照片来提取二维（2D）颗粒图像，然后用于重建生物大分子的三维（3D）结构2，3。在DED开发之前，单粒子重建获得的分辨率在4到30 Å4，5之间。最近，单颗粒冷冻电镜可实现的分辨率已超过1.8 Å6。DED和自动数据采集软件是这一分辨率革命7的主要贡献者，其中人为数据收集干预最少。通常，冷冻电镜成像以低电子剂量率（20-100 e / Å2）进行，以最大限度地减少电子束引起的生物样品辐射损伤，这有助于图像中的低信噪比（SNR）。这种低SNR阻碍了使用单颗粒分析表征生物大分子的高分辨率结构。
新一代电子探测器是基于CMOS（互补金属氧化物半导体）的探测器，可以克服这些与SNR相关的低障碍。这些直接检测CMOS相机可以快速读出信号，因此相机为生物大分子提供了更好的点扩散功能，合适的SNR和出色的检测量子效率（DQE）。直接检测相机在记录的图像中提供高SNR8 和低噪声，从而定量提高检测量子效率（DQE） - 测量探测器向图像增加的噪声量。这些相机还以每秒数百帧的速度录制短片，从而实现快速数据采集9，10。所有这些特性使得快速直接检测相机适用于低剂量应用。
运动校正堆栈图像用于数据处理，以计算2D分类，并使用各种软件包（如RELINE11，FREALIGN12，cryoSPARC13，cisTEM14和EMAN215）重建大分子的3D密度图。然而，对于单粒子分析，需要一个巨大的数据集来实现高分辨率结构。因此，自动数据采集收费对于数据收集至关重要。为了记录大型冷冻电镜数据集，在过去十年中已经使用了几个软件包。专用软件包，如AutoEM16，AutoEMation17，Leginon18，SerialEM19，UCSF-Image420，TOM221，SAM22，JAMES23，JADAS24，EM-TOOLS和EPU，已经开发用于自动数据采集。
这些软件包使用常规任务，通过将低倍率图像与高倍率图像相关联来自动查找孔位置，这有助于识别具有专有冰厚的玻璃体冰的孔，以便在低剂量条件下进行图像采集。这些软件包通过连续几天获取大量高质量数据，减少了重复性任务的数量，并提高了冷冻电镜数据收集的吞吐量，没有任何中断和操作员的物理存在。Latitude-S是一个类似的软件包，用于单颗粒分析的自动数据采集。但是，该软件包仅适用于K2 / K3 DED，并随这些探测器一起提供。
该协议证明了Latitude-S在使用配备200 keV冷冻电镜的直接电子探测器自动图像采集SARS-CoV-2刺突蛋白方面的潜力（见 材料表）。利用该数据采集工具，自动采集3000个SARS-CoV-2刺突蛋白电影文件，并进行进一步的数据处理，得到分辨率为3.9-4.4Å的刺突蛋白结构。
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Protocol
注：冷冻电镜数据收集需要三个重要步骤：1.冷冻电镜网格制备，2.显微镜的校准和对准，3.自动数据收集（图1）。此外，自动数据收集细分为a.合适区域选择，b.Latitude-S优化，c.启动自动孔选择和d.启动自动数据采集（图1）。
1. 用于自动数据采集的冷冻电镜网格制备和样品加载
- 使用辉光放电器清洁网格，并根据实验要求改变辉光放电参数（此处，20 mA时为60 s）。
- 将新鲜制备的蛋白质样品（3μL）加入辉光放电网格中并孵育10 s。
- 在100%湿度下将网格吸干3-5秒，并使用冷冻柱塞将其快速浸入液体乙烷中。
- 使用灵活的C形夹环手动将网格夹入夹环中以形成墨盒。
- 将冷冻的墨盒安装网格加载到自动加载器盒中，并通过纳米盖将盒传输到显微镜的预冷自动加载器以进行数据收集。
2. 自动数据采集前的显微镜调谐和基本对准
- 光束偏移
- 单击"直接对齐"选项卡中的"光束偏移"。
- 减小放大倍率，并使用 多功能 X 和 Y 旋钮将光束居中到光轴。
- 枢轴点对齐
- 单击"直接对齐"选项卡中的"直接对齐 pp X"中的"光束倾斜"选项。
- 通过使用 多功能 X 和 Y 旋钮将光束压缩到一个点并最小化运动。
- C2 孔径定心
- 从" 对齐 "选项卡中选择聚光镜孔径。
- 将光束凝聚到一个点上，将光束居中到光轴上，然后扩大光束以均匀地覆盖圆圈。
- 重复这些步骤，直到调整了聚光镜2光圈。
- 无昏迷对齐
- 单击"直接对齐"选项卡中的"无昏迷对齐 X"，将光束与光轴对齐。
- 使用 多功能 旋钮将FFT的形状和运动最小化（确保其稳定）。
- 对昏迷重复相同的过程 - 自由对齐Y。
- 由于C双透镜，在冷冻电镜中收集数据之前设置平行照明。
- 在衍射模式下插入物镜孔径（70 μm）。
- 通过控制散焦强度旋钮（物镜和C2透镜电流），将物镜孔径聚焦在衍射镜的前焦平面上。
- 确保在正确散焦后可以看到物镜光圈的清晰边缘。
- 插入光束塞并扩散强度，直到金粉衍射环最小化。
注：如果光束正确展开，则屏幕上可以看到金粉的透明衍射环，这表明光束是平行的。 - 设置平行照明后，收回光束塞，并将显微镜模式更改为 纳米探头。
注：在开始数据收集之前，请检查显微镜调谐，以确保显微镜的最佳性能。所有这些设置都将在显微镜 直接对准GUI 选项卡中执行。在数据收集之前，所有显微镜调整都使用测试网格执行。
3. 使用Latitude-S进行数据采集
- 启动Latitude-S自动数据采集软件。
注意：Latitude-S 安装还需要显微镜校准，这将在数据收集之前执行，并且设置将被永久存储。使用四种不同的放大倍率校准五种不同的数据收集状态（图1 和 图2）。在 LM 模式下，Atlas 状态和格网状态处于两种不同的放大倍率（低放大倍率范围）。孔状态为 SA 模式（高放大倍率范围），但放大倍率适中。焦点和数据状态使用高放大倍率SA模式。- 从"开始"菜单中单击"数字显微图"，或双击桌面上的"数字显微图"图标。
- 从数字显微图中选择技术管理器图标。
注：此系统将显示 TEM 和 Latitude-S 图标（图2 和 补充图S1）。 - 选择 Latitude-S 图标以进行单粒子自动数据收集。
注：K2相机在三种模式下工作：线性/积分、计数和超分辨率。用户可以在 DigitalMicrograph的界面中选择任何模式。数据图像可以保存为剂量分段图像堆栈，也可以保存为具有不同位深度的MRC，TIF或.dm4文件中的求和图像。此外，数据可以保存为K3相机的运动校正图像。在K2相机上，未处理的图像堆栈可以保存为4位MRC，8位TIF或8位.dm4文件。
- 根据上一个会话中的设置创建新会话。
- 选中调色板中的 基于先前的会话 复选框。
- 选择" 新建 "按钮。
- 选择包含新会话设置所基于的会话的文件夹。转到上一个会话目录以创建新会话。选择要保存新会话和关联数据的文件夹。
- 选择并选择将保存新会话和关联数据的文件夹。
注：每个状态及其基础设置（放大倍率、照明条件、图像或投影仪）以及光束偏移和相机参数（总曝光、单帧曝光和合并）将从现有会话导出到新会话。文件夹的路径在选项板底部显示为文本字符串。每个状态和配置调色板的标题后面都附加了一个星号 （*），以表明它已设置并可供使用。
- 继续现有会话。
- 按调色板中的" 继续 "按钮以继续现有会话。
注：地图集蒙太奇无法修改。 - 选择并导航到包含需要继续的会话的文件夹。
- 按调色板中的" 继续 "按钮以继续现有会话。
- 启动一个全新的会话。
- 单击调色板中的 "新建"选项卡 。选择要继续的会话的文件夹。选择要保存数据的文件夹。
注意：默认文件夹名称是使用日期和时间生成的。 - 单击 设置 图标。在出现的 "管理状态浏览 "框中，添加状态，设置 TEM 条件、相机条件和图像/堆栈，然后命名状态。
注意：自动数据采集工作流使用 5 种不同的状态进行自动数据收集。这些状态被配置并存储在各自的状态调色板中。 表 1 给出了状态摘要。
- 单击调色板中的 "新建"选项卡 。选择要继续的会话的文件夹。选择要保存数据的文件夹。
- 配置地图集状态。
- 单击 "图集"状态调色板。
- 使用以下参数配置图集状态：在纳米探头中放大倍率为115x LM模式，照明条件 - 光斑尺寸8和亮度934400，分档：1和相机曝光时间：1.0秒，用于低放大倍率下的成像。请参阅 表 1 中给出的状态摘要。
- 单击" 下一步 "移动到下一个状态。
注：图集状态是最低放大倍率状态，它提供了整个网格的测量（补充图S2）。通常，这种状态有助于我们在低放大倍率下可视化整个网格，并判断网格的冰厚度，平面度和破碎的平方。建议在格网的不同区域生成图集，以观察格网的最佳冰厚和次优冰厚（附图S3）。上述参数可以根据用户需求而变化。
- 配置网格状态。
- 单击" 网格状态"选项板。
- 使用以下显微镜成像光学元件（Nano探头中的放大倍率为380x LM模式）、照度条件（光斑尺寸：8，亮度626，200）、分档：1和相机曝光时间：1.0秒）配置网格状态。
- 请参阅 表 1 中提供的 Latitude-S 状态摘要。
- 单击" 下一步 "移动到下一个状态。
注：网格状态设置为高于图集状态的放大倍率，使得视野为一个网格正方形（图 2）。在这个特定的放大倍率中，观察到一个网格正方形。因此，在此放大倍率下可以正确观察孔，这有助于检查孔的冰厚度（补充图S4）。在网格状态下使用简单的带通滤波器来定位专利网格中的孔。上述参数可以根据用户需求而变化。
- 配置孔状态。
- 单击 孔调色板。
- 使用以下显微镜设置配置孔状态：成像光学元件（Nano探头中的放大倍率为4500x SM模式），照明条件（光斑尺寸：7和光束直径8.81μm），像素：1和相机曝光时间：1.0秒。
- 如果需要，请根据网格类型更改参数。请参阅 表 1 中提供的状态摘要。
- 单击" 下一步 "移动到下一个状态。
注：SA模式表示电子显微镜中的高放大倍率范围。孔状态在SA放大倍率范围内，视场为几微米（10-20μm）（图2 和 补充图S4）。此放大范围高于"图集"或"网格"状态，但远小于"焦点/数据"状态。在此放大倍率下，可以看到单个孔。孔的大小适合观察高度污染，空孔和孔的适当冰厚度。根据这些假设选择成像孔。在孔状态下使用两个滤光片：一个用于将孔参考图像与新孔图像交叉关联，另一个用于将载物台高度调整为真心高度。
- 配置焦点状态。
- 单击" 焦点"调色板。
- 使用以下显微镜设置配置对焦状态：成像光学元件（纳米探头中的放大倍率为45，000x SA模式），照明条件（光斑尺寸：8，亮度934400），像素化：1和相机曝光时间：1.0秒。
- 将焦点集中在孔附近的无定形碳区域。请参阅 表 1 中提供的 Latitude-S 状态摘要。
- 单击" 下一步 "移动到下一个状态。
注：SA模式表示电子显微镜中的高放大倍率范围。对焦状态是较高的 SA 范围放大倍率。在对焦模式下，光束被移动到目标孔附近的碳区域，并自动执行对焦以收集数据状态下的数据。带通滤波器与汉宁或软矩形滤波器相结合，在对焦状态下用于测量同一区域的两个对焦状态图像之间的偏移（图2）。上述参数可以根据用户需求而变化。
- 配置数据状态。
- 单击" 数据"选项板。
- 使用以下显微镜设置配置数据状态：成像光学元件（例如，在纳米探头的SA模式下放大倍率为28，000x，45，000x，54，000x），照明条件（光斑大小：8，亮度934400），分档：1和相机曝光时间：1.0秒。
- 请参阅 表 1 中给出的 Latitude-S 状态摘要。
- 单击" 下一步 "移动到下一个状态。
注：数据状态是根据像素大小要求和目标分辨率选择的最高放大倍率（图2）。通常，聚焦后，光束会自动移动到目标区域以收集数据。上述参数可以根据用户的要求进行更改。
4. 焦点配置
- 单击" 焦点配置调色板"。在给定选项卡中指定散焦值的范围和步长。
- 按 "下一步 "按钮转到下一步。
注：较低的散焦值可用于高分辨率数据采集。通常，散焦步长为0.25或0.5的散焦值为-0.5至-3.0 μm，用于图像采集。如果用户只想筛选示例，则可以跳过焦点设置步骤。只需按调色板上的" 下一步 "按钮即可跳过焦点配置步骤。
5. 精细对齐
- 专注于网格上的一些特征（例如，冰污染六角形冰）;参见 图3。
注意：功能不应太大或太小。它们在 Atlas 状态放大倍率 115 倍（LA 模式）和数据放大倍率下都应可见。 - 单击" 捕获 "按钮。将红叉标记定位在不同状态的每个图像上的同一特征上。
- 从焦点、数据和孔状态开始，因为它们的视野比图集和网格状态大得多。放大地图集和格网状态，将红叉标记定位在地图集和格网状态中的同一要素上。
- 单击" 计算 "按钮以计算五个不同状态的位置，这将计算每个状态之间的偏移量并将其反射到输出窗口中。
注：偏移值已集成到状态中以供进一步使用（图3）。执行精细对准以提供每个状态位置的高精度（图3）。这种精细对齐有助于精确定位所有五个州的确切位置。 精细对准 对于单颗粒数据采集至关重要。因此，强烈建议在成像之前执行精细对准。
6. 使用Latitude-S的数据采集程序
- 单击" 捕获"选项板。
注：通常，地图集数据以低放大倍率（115倍）收集，以可视化大多数网格正方形。 - 根据要求选择地图集的大小以覆盖整个网格或部分网格（例如，6 x 6、8 x 8、12 x 12、6 x 8、8 x 6、12 x 8 或 8 x 12）。
注：16 x 16 图集大小覆盖了整个网格。 - 单击" 捕获 "按钮以捕获地图集。
注：Latitude-S主导航窗口打开并填满数字显微图中的可用空间（补充图S5）。主导航窗口中的三个图片窗格以三种不同的放大倍率显示系统状态的图像。整个地图集当前以其当前获取状态显示在最左侧窗格中。地图集中的图块将在每次捕获发生时填满。 - 通过在图集上导航，根据冰层厚度选择网格正方形（附图 S5）。选择所需的网格方块后，单击" 计划 "按钮，并在捕获每个网格方块时观察网格方块中的磁贴填满。
- 选择网格方块后，单击" 计划 "按钮。
- 通过添加其位置，在栅格正方形中选择一个具有代表性的孔。获取孔图像后，定义数据和焦点位置，并将布局另存为模板（附图S6）。
- 单击" 自动查找"，给出孔大小（例如，R1.2 / 1.3），然后单击程序中的" 查找 "按钮，这将使 "查找" 程序根据孔径自动查找孔。接下来，单击" 标记 "按钮以添加模板（图 4），并在一个网格或部分网格正方形的所有孔中添加红色圆圈标记。
- 设置强度以从网格方块和冰污染中去除孔（图4）。
注意：最后，所选孔将标记为黄色，用于调度数据收集。 - 单击纬度任务中的计划按钮，通过自动查找添加孔后。
注：在安排自动数据收集之前，请确保液氮罐液位充足，自动加载器涡轮泵已关闭，并且 RAID 驱动器空间可用。Latitude-S 任务管理器显示为数据收集计划的数据集、格网正方形、孔和数据状态的数量（图 5）。在Latitude-S GUI中，各种配色方案将可见，并且将显示不同配色方案的含义：1.黄色表示计划外;2. 绿色表示已安排;3. 蓝色表示已获得;4. 红色表示失败。
7. 冷冻电镜数据处理
注：刺突蛋白的冷冻电镜图像处理在最近的文献中有详细描述25。
- 使用RELINE 3.011对SARS-CoV2的刺突蛋白进行图像处理。
- 使用Latitude-S手动筛选收集的电影图像，并使用MotionCor2软件9对单个电影执行光束诱导的运动校正。在cisTEM软件包的帮助下手动执行运动校正显微照片的初始筛选14。
注：近85%的自动采集显微照片质量良好，数据信号在3.7-5.2埃范围内，这是使用cisTEM软件14 计算的（补充图S7A，B）。 - 使用 RELION 3.0 软件包处理数据11。
- 手动拾取尖峰颗粒并对其进行2D类分类（补充图S7C）。使用最佳 2D 类作为参考，使用 RELION 自动选择工具从显微照片中自动选择 3，99，842 个单尖峰粒子11。
注：在对颗粒进行3D分类之前，进行了三轮2D分类（补充图S8）。选择大约2，55，982个单一颗粒进行3D分类，并将数据集分为六类。最终的3D自动细化是用最好的类进行的;从3D分类中获得85，227个尖峰颗粒。 - 自动细化后，使用适当的光束倾斜参数执行每个粒子散焦细化，以提高分辨率。接下来，使用 RELION 3.0 软件包对颗粒进行贝叶斯抛光11。最后，使用抛光粒子集使用RELION 3.011进行另一轮3D自动细化。
- 手动拾取尖峰颗粒并对其进行2D类分类（补充图S7C）。使用最佳 2D 类作为参考，使用 RELION 自动选择工具从显微照片中自动选择 3，99，842 个单尖峰粒子11。
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Representative Results
在当前的大流行形势下，冷冻电镜在表征SARS-CoV-226，27，28，29的各种蛋白质的结构方面起着关键作用，这可能有助于开发针对该病毒的疫苗和药物。迫切需要以有限的人力资源进行快节奏的研究工作，以抗击2019年的冠状病毒病。单颗粒冷冻电镜中的数据采集是大分子结构测定中耗时但至关重要的步骤。冷冻电镜自动数据采集的最新发展使得人为对数据收集的干扰有限。Latitude-S软件是一个重要的自动数据采集软件包，用于自动收集纯化的SARS-CoV2刺突蛋白。
SARS-CoV-2刺突蛋白的冷冻电镜数据采集是使用配备K2 Summit DED的200 keV冷冻电镜进行的。手动标记了具有理想冰厚和颗粒分布的网格上的数据采集位置。在后台进行数据采集期间，这些位置是并行标记的。在标记的位置，Latitude-S软件在试样水平上以42，200倍的标称放大倍率（像素尺寸为1.17 Å）进行了自动数据采集。在42，200倍放大倍率下收集数据的配置已经预先设置并进行了测试。共记录40帧8秒，电子剂量为每帧2 e−/Å2 ;因此，总剂量为80 e−/Å2 用于数据收集（补充图S9）。数据是在−0.75μm和−2.25μm的散焦范围内采集的，在两天内收集了3，000个电影文件。每4小时，软件会进行定期检查和调整，以确保在48小时内收集的所有电影文件都具有良好的质量，并且没有光束偏移或对准偏移。数据是独立收集的，没有任何人为干预。此外，Latitude-S 在液氮充填时会自动停止成像，从而减少图像中不必要的振动或机械漂移。
如实验方案部分所述，运动校正显微照片的初始筛选是使用cisTEM软件手动执行的14。根据筛选结果，发现大部分数据在3.7-5.2 Å的信号范围内（补充图S7A）。这表明使用Latitude-S的自动数据收集是好的，并且大多数数据都适合高分辨率的3D重建。此外，在散焦范围（-0.75至-2.25μm）下收集图像，并通过cisTEM14手动检查各种散焦范围。采集的数据非常接近Latitude-S的设置散焦范围（补充图S7A，B）。
数据处理是使用 RELION 3.0 软件包11 执行的。手动拾取尖峰粒子以计算2D类平均值。在2D类平均值中可以看到各种结构细节（螺旋和β片），这强烈表明使用该数据集可以进行高分辨率的结构表征。然而，3D分类也表明刺突蛋白具有1个受体结合结构域（RBD）向上开放，所有RBD向下关闭构象（补充图S8）。3D 分类表明 1 类具有最大数量的粒子，这些粒子显示为 1-RBD 向上开放构象。此外，3类和4类具有相似数量的粒子，并且两种模型似乎都具有所有RBD下近距离构象。但是，类 5 显示中间构象，其中 1-RBD 处于中间位置。然而，使用C1对称性重建了刺突蛋白的1-RBD向上开放构象，总体分辨率为4.4 Å（图6 和 补充图S10）。同样，所有RBD下近距离构象（3类和4类）都与C3对称性一起进行了改进，0.143 FSC下的总体分辨率约为3.9 Å（图7）。
整体图像处理表明，刺突蛋白采用所有RBD下闭合和1-RBD向上开放构象。此外，鉴定了刺突蛋白的中间构象。刺突蛋白S2子结构域的高分辨率冷冻电镜结构表明单个氨基酸残基的侧链（图6B 和 图7C）。所有3D重建和冷冻电镜结果都与最近发表的文献中的发现高度相似25。然而，刺突蛋白的高分辨率冷冻电镜结构在15天内被表征，这仅仅是由于自动冷冻电镜数据采集协议和自动颗粒拾取软件才有可能。因此，包括Latitude-S在内的自动数据采集软件包可以显着促进生物大分子的几种高分辨率冷冻电镜结构的表征。
图 1：使用 Latitude-S 进行自动数据采集的工作流程： 数据收集前应遵循的一般步骤（网格制备、样品上样和显微镜调整）。数据采集是本手稿的主要部分，并强调了数据采集期间要遵循的管道。缩写：cryo-EM = 冷冻电子显微镜。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：使用 Latitude-S GUI 为单粒子数据收集设置不同状态 。（A） 用于 DM3 软件套件中数据采集的 Latitude-S 软件包。（二）数据采集程序的工作流程。（C） 扩大每个小组。缩写：GUI = 图形用户界面。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：精细对准，为对焦和图像采集设置高精度。 在五个状态上执行精细对齐 a. 图集， b. 孔， c. 数据， d. 网格， e. 焦点。通过将红色标记放在同一位置来聚焦每个状态。强烈建议在开始任何新会话之前执行 精细对齐 ，这将有助于在特定位置执行成像。特定位置的图像采集（没有任何重大偏移）完全取决于精细对准的精度。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：使用 Latitude-S 自动选择孔。 根据孔尺寸自动查找孔以进行数据采集。（A） 显示用于自动查找孔的寻洞向量的位置。比例尺 = 20 μm. （B） 使用孔查找向量和调整强度以从边界区域移除标记和冰污染来显示孔的标记。比例尺 = 20 μm（左）和 10 μm（中间）。（C） 显示自动添加用于成像的孔（黄色）。比例尺 = 20 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图 5：数据采集的实时视图。 （A） 根据每个位置的数据采集状态，这些位置用黄色、绿色、蓝色和红色标记。（B）用于监控数据采集状态的颜色代码。绿色：已计划，黄色：计划外，蓝色：获取，红色：失败。左侧面板显示几个绿色（预定）的孔和几个标记为蓝色（已获得的）孔;比例尺 = 10 μm。中间面板显示单个孔的 4，300 倍放大倍率。在此孔（中间面板）的图像中，蓝色方框显示对焦区域，绿色方框显示成像区域;比例尺 = 1000 nm。右侧面板显示采集的图像。最右侧的面板显示计划的图像编号、成像所需的总时间以及计划用于成像的图像数量。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 6：打开 1RBD 的 Spike 3D 模式。 （A）1-RBD向上打开的自动精炼和锐化的刺突蛋白图以侧视图，顶部和底部视图表示。（B）EM图贴有晶体结构，以便更好地可视化侧链。地图中高亮显示的区域具有侧链的密度。缩写：3D =三维;RBD =受体结合结构域;EM = 电子显微镜;NTD = N-终端域;S1 = 亚基 1;S2 = 亚基 2。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：刺突蛋白的所有 RBD 下近距离构象。 （A） 所有 RBD 下近距离构象的自动精炼和锐化刺突起蛋白图，以侧视图和顶视图表示。（B）EM图贴有晶体结构，以便更好地可视化侧链。箭头显示地图中的区域具有侧链 （C） 的密度。缩写： RBD = 受体结合结构域;EM = 电子显微镜;NTD = N-终端域;S1 = 亚基 1;S2 = 亚基 2。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充图S1：Latitude-S图像采集GUI： 各种显微镜控制器（例如，柱阀打开/关闭、屏幕插入/缩回）由 Latitude-S GUI 控制。柱阀，摄像头，屏幕状态和液氮填充可以在左侧面板中控制。在此面板的底部，各种校准参数显示为绿色（例如，放大倍率、光束倾斜度、物镜焦点）。如果任何参数显示为黑色，则表示该参数未正确优化。因此，在启动任何新会话之前，应优化所有参数。缩写：GUI = 图形用户界面。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：阿特拉斯状态的表示。 不同的Atlas状态显示网格方块和形成的冰的类型。（A-F）各种 Atlas 大小也会突出显示。（A， B， D， F）粗冰图案突出显示。（C、D）破碎的正方形将突出显示。厚冰和破碎区域（在图中标记）不适合成像。（五、法）用于成像的良好网格方块;A、B、C、D 和 F 显示了适合高分辨率成像的网格方块。但是，必须排除厚冰网格正方形和破碎网格正方形。比例尺 = 100 μm （A-C）、50 μm （D， E） 和 25 μm （F）。请点击此处下载此文件。
补充图 S3：网格状态和孔状态的表示。 网格状态和相应的孔状态如图所示。（A、 E）空孔，（F，G）厚冰，（E）冰污染，和（A，B，C，D，E 和 G）合适的冰厚度在图像中标记。为图像采集选择合适的冰层厚度孔（A、B、C、D、E 和 G）。比例尺 = 10 μm （A， E， F， G）， 2 μm （B）， 50 μm （C）， 5 μm （D）. 请点击此处下载此文件。
补充图S4：用于自动成像的孔参考。 孔图像（QUANTIFOIL-Holey Carbon grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3）被捕获并保存以供将来参考。孔参照的大小可以根据不同类型的栅格而变化。建议在开始任何新会话之前始终捕获孔参照。 请点击此处下载此文件。
补充图S5：各种放大倍率和孔选择下的图像捕获面板。 （A） 捕获面板显示数据采集的设置。（B） Latitude-S 主导航窗口显示三个连续放大倍率。在 Atlas 状态 （150x） 下，选择网格方块进行数据采集（左侧面板，比例尺 = 50 μm）。在更高的放大倍率（380x）下，聚焦单个正方形（中间面板，比例尺= 20μm）。进一步更高的放大倍率（4，300x），每个正方形内部的孔被聚焦（右侧面板，比例尺= 5μm）。但是，这些放大倍率会根据网格的大小和形状而变化。 请点击此处下载此文件。
补充图S6：创建用于孔选择和成像的模板。 模板生成是通过在孔上添加数据位置来执行的，并且焦点位于碳表面上的孔附近。焦点应位于碳区域，以便光束直径不应接触任何相邻孔。比例尺 = 20 μm（左面板），10 μm（中间面板），1000 nm（右面板）。 请点击此处下载此文件。
补充图S7：使用Latitude-S和图像筛选对SARS-CoV2进行冷冻电镜成像。 （A） 筛选获得的显微照片：一维CTF拟合、二维CTF拟合和CTF参数;使用顺式TEM估计SARS-CoV2刺突蛋白数据。1D CTF拟合和Thon环显示总体信号为4.8 Å.（B）使用Latitude-S获取刺突蛋白两个不同散焦值的显微照片。比例尺 = 50 nm。（C） 最终的 2D 类平均值。2D 类平均值显示刺突蛋白的顶部、底部和侧面视图。所有高分辨率细节在2D类平均值中都可见。缩写： 冷冻电镜 = 冷冻电子显微镜;1D = 一维;2D = 二维;CTF = 对比度传递函数;SARS-CoV2 = 严重急性呼吸综合征 冠状病毒 2. 请点击此处下载此文件。
补充图S8：使用Latitude-S软件获取的SARS-CoV2刺突蛋白数据的数据处理。该图显示了处理刺突蛋白的冷冻电镜数据所遵循的工作流程。刺突蛋白的3D分类使用Relion 3.0进行。1 类显示 1-RBD 向上开放构象。3类和4类显示刺突蛋白的所有RBD下近距离构象。5类显示刺突蛋白的中间构象。缩写： 冷冻电镜 = 冷冻电子显微镜;3D = 三维;RBD =受体结合结构域;SARS-CoV2 = 严重急性呼吸综合征 冠状病毒 2. 请点击此处下载此文件。
补充图S9：捕获的剂量分段图像作为最终图像采集的参考。剂量分馏图像以8.0 s曝光和0.2 s /帧曝光拍摄。单击照相机附近的 自动保存 按钮以自动保存动画文件。图像采集后，单击图像并使用数据收集状态下 的图像更新 按钮保存剂量分馏图像参数。 请点击此处下载此文件。
补充图S10：所生成的SARS-CoV-2 1 RBD的角分布与傅里叶壳的相关性，上行开放构象刺突蛋白图谱。 （A）1-RBD的最终3D模型的角分布，上去裂隙蛋白的开放构象。蓝色表示较低的值，红色表示归一化粒子分布的较高值。（B）傅里叶壳相关曲线显示刺突蛋白1-RBD向上开放构象的4.4 Å分辨率，在临界值时估计。缩写：3D =三维;RBD =受体结合结构域;SARS-CoV2 =严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2;FSC = 傅里叶壳相关。 请点击此处下载此文件。
| 地图集图像状态 | 阿特拉斯 115 |
| 放大 | 115，像素尺寸34.7 nm |
| 指示散焦 | 4.38 毫米 |
| 光斑尺寸 | 8 |
| 亮度 | 934400 |
| 模式 | 成像ILM |
| 分档 | 1 |
| 曝光时间 | 1.0 秒 |
| 网格测量状态 | 网格 380 |
| 放大 | 380，像素尺寸 11.2 nm |
| 指示散焦 | 2.37 毫米 |
| 光斑尺寸 | 8 |
| 亮度 | 626200 |
| 模式 | 成像ILM |
| 分档 | 1 |
| 曝光时间 | 1.0 秒 |
| 孔测量状态 | 孔 3400 |
| 放大 | 3，400， 像素尺寸 1.20 nm |
| 指示散焦 | -0.75 微米 |
| 光斑尺寸 | 7 |
| 光束直径 | 8.81微米 |
| 模式 | IMAGINGILM, SA, Mh |
| 分档 | 1 |
| 曝光时间 | 1.0 秒 |
| 焦点状态 | 对焦 45k |
| 放大 | 45，000， 像素尺寸 0.0924 nm |
| 指示散焦 | 4.51 微米 |
| 光斑尺寸 | 6 |
| 光束直径 | 0.716 微米 |
| 模式 | IMAGINGILM, SA, Mh |
| 分档 | 1 |
| 曝光时间 | 1.0 秒 |
| 结盟状态 | 数据 45k |
| 放大 | 45，000， 像素尺寸 0.0924 nm |
| 散焦设置 | 最小值： -4，500 nm， 最大值： -1，500 nm， 步长： 250 nm |
| 光斑尺寸 | 6 |
| 光束直径 | 0.752微米 |
| 模式 | 成像ILM，SA，Mh |
| 分档 | 1 |
| 曝光时间 | 20 帧的总曝光速度为 8 秒 |
| 相机设置 | 计数、增益归一化、缺陷已纠正 |
| 数据保存设置 | 断续器 |
表 1：Latitude-S 状态设置摘要。
| 规范 | K2 基地 | K2峰会 |
| 透射电镜工作电压 | 200-400 千伏 | |
| 传感器有效区域 | 19.2 毫米 × 18.6 毫米 | |
| 传感器尺寸（以像素为单位） | 3838 × 3710 | 7676 × 7420 超级- 分辨率 |
| 物理 al 像素大小 | 5 微米 | |
| 分档 | 1–8 倍 | |
| 传感器读出 | 任意区域 | |
| 相对于胶片的放大倍率 | 1.3–1.5 倍 | |
| 传感器读出速度 | 50 全帧/秒 | 400 全帧/秒 |
| 传输到计算机的速度 | 8 全帧/秒 | 40 全 fps |
| 图像显示 | 8 全帧/秒 | 10 全帧/秒 |
| DQE 性能 （300 kV） | >0.30（峰值）>0.25在物理奈奎斯特的0.5处 | >0.7（峰值）>0.50在物理奈奎斯特的0.5>0.06在物理奈奎斯特的1.25 |
| 软件 | Gatan显微镜套件，包括数字显微仪 |
表 2：相机规格。
| 配置选项 | 价值 |
| 显微镜类型 | 北极塔洛斯 G2 |
| 高张力 | 200 千伏 |
| 源 | 断续器 |
| 镜头 | 冷冻双胞胎 |
| 真空系统 | Talos TMP IGP |
| 样品加载器 | 自动加载器 |
表3：显微镜配置。
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Discussion
Latitude-S 是一个直观的用户界面，它提供了一个环境，可以在两天内自动设置和收集数千张高分辨率显微照片或电影文件。它提供了跨网格的轻松导航，并在显微镜载物台从低放大倍率移动到高放大倍率时保持显微镜载物台的位置。使用Latitude-S进行数据采集的每个步骤都非常省时，具有简单的用户界面，以高达4.5 GB / s的速度快速流式传输数据以及在采集过程中同时显示数据等功能。此外，预校准的剂量分馏、剂量率、焦点和放大倍率参数很容易重新加载，以启动新的自动数据采集过程并节省时间。
在没有持续监控的情况下自动获取数据，并且不会影响数据集的质量，这是一项具有挑战性且耗时的任务。当时间和资源受到主要限制时，使用Latitude-S软件进行自动数据收集非常方便，尤其是在大流行期间。然而，在过去的几个月里，SARS-CoV-2的各种蛋白质的几种冷冻电镜结构已经得到解决，这将有助于制药公司开发疫苗。不同的实验室使用不同类型的自动数据收集软件包来收集数据。我们使用Latitude-S和K2 Summit DED，在多孔碳网格或自制GO涂层网格上自动收集低温电镜数据30。
该研究是使用协议部分中的上述参数进行的，这提供了强有力的证据，证明Latitude-S是用于单颗粒冷冻电镜自动数据收集的合适且理想的软件包。但是，强烈建议在使用K2相机开始成像之前遵循某些协议。K2 直接检测相机需要基本的维护程序才能实现最高性能。相机定期退火至50°，持续24小时，通过减少表面的背景噪音和污染，帮助传感器发挥最佳性能。但是，在相机退火后，在进行任何图像采集之前，更新相机的增益和暗参考是一个强制性步骤（需要约45分钟）。
虽然Latitude-S是一个稳定且用户友好的软件包，用于冷冻电镜自动数据收集，但一开始就必须在Latitude-S的5种不同状态下优化各种参数（放大倍率，光斑尺寸，亮度和剂量率）。孔或栅格状态的放大率取决于多孔栅格网或多孔栅格类型的孔大小（例如，R2/2 或 R1.2/1.3 或 R 0.6/1）。例如，R0.6/1 型栅格孔尺寸为 0.6 μm，R2/2 栅格的孔尺寸为 2 μm。因此，需要两种不同类型的放大倍率来正确可视化 Latitude-S 中栅格类型 R0.6/1 和 R2/2 中的栅格类型和孔状态的孔。
因此，处于5种不同状态的各种类型网格的放大倍率设置将是可变的。光斑大小和亮度很大程度上取决于放大倍率。因此，这些值可能会在不同的放大倍率值下发生变化。因此，建议在开始自动数据采集之前，使用不同类型的冷冻电镜网格优化Latitude-S的5种不同状态的各种参数。但是，一旦所有参数都经过优化和保存，就可以很容易地根据用户的要求重新加载所有参数，并在不同的放大倍率或网格类型下使用Latitude-S。
将K2与Latitude-S一起使用的一个重要好处是，用户可以轻松调节光束阀的打开/关闭，插入/收回相机，插入/缩回显微镜的荧光屏，并使用Latitude-S的GUI调节液氮填充。但是，任何其他选项（如枪倾斜、枪移位、光束偏移、枢轴点、C2 孔径居中、旋转中心、无昏迷对齐）都无法通过 K2 Latitude-S GUI 选项卡访问（补充图 S1 和图 2）。在长时间的数据收集过程中，光束的位置可能会发生变化。
Latitude-S可以执行自动定期检查和校正，以跟踪系统在整个数据采集期间的稳定性。通过使光束居中并更新深色参照来保持系统的稳定性。持续检查可确保采集数据的高质量。在 Latitude-S 中，在数据收集之前，真心高度（Z 高度）仅被校正一次，并且 Latitude-S 在更改网格方块时会自动计算真心高度。根据用户定义的对焦范围自动测量和调整对焦。如果阶段 Z 位置超过给定的阈值，程序将重置阶段 Z 位置。此稳定性通过"系统稳定性"选项板进行控制。但是，与其他自动数据采集包一样，Latitude-S也有一些局限性。
如果格网不均匀，Latitude-S 无法计算真心高度（Z 高度）。在这种情况下，它无法收集任何数据，否则散焦值将完全超出范围。因此，用户应非常谨慎地准备其网格，而无需使用Latitude-S进行任何弯曲和仅图像平坦表面网格。此外，与Leginon，SerialEM和UCSF-Image不同，Latitude-S不是一个免费提供的软件包。Latitude-S 兼容 Gatan 相机，包括滤波或独立 K2、K3 和 K3 基础直接检测相机，以及 Rio 和 OneView 相机。用户的另一个重要缺点是它与其他流行的DED（如Falcon DED）不兼容。然而，EPU也是如此，EPU是另一个自动数据采集软件包，可与冷冻显微镜一起使用，并且仅与Falcon相机兼容。但是，EPU也可以与带有能量过滤器（BioQuantum K3成像过滤器）的K2 / K3一起使用，但不能与独立的K2 / K3相机配合使用。
Latitude-S与EPU，SerialEM，AutoEM，AutoEMation和Leginon非常相似，它们是用于单粒子冷冻电镜自动数据采集的软件包。但是，Latitude-S 仅与 K2 DED、K3 DED 或 BioQuantum K3 Imaging Filter 兼容。此外，该公司还为Latitude-S用户提供持续的技术支持。这种技术支持对于需要使用K2 DED，K3 DED或BioQuantum K3成像滤光片设备进行数据采集并且事先不了解如何设置或使用免费软件包（如SerialEM和Leginon）的小型用户组是有益的。
还有许多其他功能，例如微晶电子衍射（microED），断层扫描和能量色散X射线光谱法（EDS），这些功能在其他各种版本的Latitude中可用。因此，用户可以在其他模式下使用相同的软件包进行数据收集。据我们所知，microED、断层扫描和 EDS 的数据收集在 EPU 或任何其他软件包中都不可用。因此，除了在单粒子冷冻EM中自动采集数据外，该Latitude软件包还可用于其他目的。但是，SerialEM和Leginon都是免费软件包，适用于Falcon或K2 / K3相机，对新用户非常有用。但是，Latitude-S不是免费提供的，这可能是此软件包的缺点。
总之，Latitude-S自动数据采集工具与其他自动数据采集软件包（例如EPU，Leginon，SerialEM，UCSF-Image）一样好。Latitude-S是一款极其稳定且用户友好的数据采集软件包，可与滤波或独立的K2、K3和K3基础直接检测相机以及Rio和OneView相机一起使用。
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Disclosures
作者没有竞争或财务利益冲突需要声明。
Acknowledgments
我们感谢印度生物技术部，科学技术部（DST）和科学部以及人力资源开发部（MHRD）提供资金和IISc-Bangalore的冷冻电镜设施。我们感谢位于班加罗尔IISc的国家冷冻电镜设施的DBT-BUILDER计划（BT / INF / 22 / SP22844 / 2017）和DST-FIST（SR / FST / LSII-039 / 2015）。我们感谢科学与工程研究委员会（SERB）（拨款编号-SB/S2/RJN-145/2015、SERB-EMR/2016/000608和SERB-IPA/2020/000094）、DBT（拨款编号：SERB）的财政支持。BT/PR25580/BRB/10/1619/2017）。我们感谢Ishika Pramanick女士准备冷冻电镜网格，冷冻电镜数据收集和准备 材料表。我们还感谢Suman Mishra先生的冷冻电镜图像处理，并帮助我们准备数字。我们感谢Raghavan Varadarajan教授帮助我们为这项研究获得纯化的刺突蛋白样品。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
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