ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
אנו מציגים שיטה לבידוד תאי אנדותל וגרעינים מלומן של עורקי הצוואר של עכברים החשופים לתנאי זרימה יציבים או מופרעים כדי לבצע ניסויים באומיקה חד-תאית.
Abstract
טרשת עורקים היא מחלה דלקתית של אזורי העורקים החשופים לזרימת דם מופרעת (d-flow). זרימת D מווסתת את ביטוי הגנים באנדותל ברמות השעתוק והאפיגנומיה, וכתוצאה מכך תגובות פרואתרוגניות. לאחרונה, בוצעו מחקרי ריצוף RNA חד-תאי (scRNAseq) ו-Assay חד-תאי לריצוף כרומטין נגיש של טרנספוזות (scATACseq) כדי לקבוע את השינויים בנגישות של תעתיק וכרומטין ברזולוציה של תא יחיד באמצעות מודל קשירת הקרוטיד החלקית של העכבר (PCL). מכיוון שתאי אנדותל (ECs) מייצגים חלק קטן מכלל אוכלוסיות התאים בדופן העורק, נעשה שימוש בשיטת עיכול לומינלית כדי להשיג תכשירים חד-תאיים מועשרים ב-EC. לצורך מחקר זה, עכברים עברו ניתוח PCL כדי לגרום לזרימת d בעורק הצוואר השמאלי (LCA) תוך שימוש בעורק הצוואר הימני (RCA) כבקרה. עורקי הצוואר נותחו יומיים או שבועיים לאחר ניתוח PCL. לומן של כל קרוטיד היה נתון לעיכול קולגןאז, והתקבלו תאים בודדים מועשרים באנדותל או גרעינים בודדים. תכשירים אלה, המכילים תאים בודדים וגרעינים בודדים, רוכזו לאחר מכן באמצעות מערך מיקרופלואידי של 10x Genomics. לאחר מכן נוצלו התאים הבודדים והגרעינים הבודדים הברקודים להכנת רנ"א, ליצירת ספרייה ולריצוף על רצף דנ"א בעל תפוקה גבוהה. לאחר עיבוד ביואינפורמטיקה, מערכי הנתונים scRNAseq ו- scATACseq זיהו סוגי תאים שונים מהעיכול הלומינלי, המורכב בעיקר מ- ECs. היו גם תאי שריר חלק, פיברובלסטים ותאי מערכת החיסון. שיטת העשרת EC זו סייעה בהבנת ההשפעה של זרימת הדם על האנדותל, מה שיכול היה להיות קשה עם שיטת העיכול הכוללת של העורקים. ניתן להשתמש בשיטת ההכנה החד-תאית המועשרת ב-EC כדי לבצע מחקרי אומיקה חד-תאיים בנוקאאוטים של EC ובעכברים מהונדסים שבהם השפעת זרימת הדם על גנים אלה לא נחקרה. חשוב לציין כי ניתן להתאים טכניקה זו כדי לבודד תאים בודדים מועשרים ב-EC מצמחי עורקים אנושיים כדי לבצע מחקרים מכניסטיים דומים.
Introduction
מעבדה זו הראתה בעבר כי אינדוקציה של זרימת d מובילה להתפתחות מהירה ומחוספסת של טרשת עורקים בעכברים היפרליפידמיים 1,2. מודל העכבר החדשני של טרשת עורקים הנגרמת על ידי זרימת d התאפשר באמצעות ניתוח קשירת קרוטיד חלקית (PCL) 3. ניתוח PCL גורם למצב של זרימת דם נמוכה ותנודתית או זרימת d בעורק הצוואר השמאלי הכבול (LCA). לעומת זאת, עורק הצוואר הימני הנגדי (RCA) ממשיך להתמודד עם זרימה למינרית יציבה (s-flow). בעבר, כדי להבין את ההשפעה של זרימת d על תאי האנדותל, עורקי הצוואר נותחו החוצה לאחר ניתוח קשירת חלקי ונשטפו באמצעות חומר ליסינג מבוסס פנול וגואנידין איזותיוציאנט (שיטת שטיפת RNA/DNA לומינלית)2,4, אשר סיפקה RNA מועשר באנדותל "בתפזורת" או DNAs. רנ"א או דנ"א בתפזורת אלה עובדו לאחר מכן למחקרי תעתיק או למחקרי מתילום DNA אפיגנומיים,בהתאמה 4,5,6. מחקרים אלה סייעו לגלות גנים ומיקרו-רנ"א רבים הרגישים לזרימה, שתפקידיהם בביולוגיה של האנדותל ובטרשת עורקים נחקרו בהרחבהב-4,6,7.
עם זאת, למרות העשרת האנדותל, מחקרי RNA/DNA בתפזורת אלה לא הצליחו להבחין בתפקיד הספציפי של כל סוג תא בדופן העורק בטרשת עורקים הנגרמת על ידי זרימת d. בידוד חד-תאי מועשר באנדותל (sc) ומחקרי ריצוף scRNA ו-scATAC בוצעו כדי להתגבר על מגבלה זו8. לשם כך, עכברי C57Bl6 היו נתונים לניתוח PCL כדי לגרום לזרימת d ב-LCA תוך שימוש ב-RCA החשוף ל-s-flow כבקרה. יומיים או שבועיים לאחר ניתוח ה-PCL, העכברים הוקרבו, והקרוטיפים נותחו ונוקו. לומן של LCAs ו- RCAs הוחדר עם קולגןאז, ועיכול הקולגן הלומינלי המכיל ECs כשבריר משמעותי ותאי עורקים אחרים נאספו. ההשעיה החד-תאית (scRNAseq) או ההשעיה החד-גרעינית (scATACseq) הוכנה וברקודה עם מזהים ייחודיים עבור כל תא או גרעין באמצעות מערך גנומיקה 10x. הרנ"א היו נתונים להכנה וריצוף של ספריית cDNA.
מערכי הנתונים scRNAseq ו-scATACseq עובדו באמצעות התוכנה החד-תאית Cell Ranger ונותחו עוד יותר על ידי חבילות Seurat ו-Signac R 9,10. לכל תא וגרעין הוקצה סוג תא מניתוחים אלה והוא הוכנס לסוג התא בהתבסס על הגנים של הסמן ודפוסי ביטוי גנים ייחודיים. התוצאות של ה-scRNAseq וה-scATACseq הראו שהתכשירים החד-תאיים האלה מועשרים ב-ECs ומכילים גם תאי שריר חלק (SMCs), פיברובלסטים ותאי מערכת החיסון.
ניתוח נוסף גילה כי אוכלוסיית ה- EC בעיכול הלומינלי שונה מאוד ופלסטית (8 אשכולות EC שונים) ומגיבה לזרימת הדם. והכי חשוב, התוצאות האלה הראו ש-d-flow מתכנת מחדש את ה-ECs מפנוטיפ אנטי-דלקתי המוגן על-ידי athero לפנוטיפים פרו-אתרוגניים, כולל פרו-דלקתיים, מעבר אנדותל-אל-מזנכימלי, מעבר גזע אנדותל/תא אב, ובאופן מפתיע ביותר, מעבר דמוי אנדותל לתא חיסון. בנוסף, נתוני scATACseq חושפים שינויים חדשניים בנגישות כרומטין תלויי זרימה ואתרי קשירה של גורמי שעתוק באופן כלל-גנומי, המהווים בסיס למספר השערות חדשות. המתודולוגיה והפרוטוקול להכנת תאי אנדותל בודדים למחקרים רב-תאיים חד-תאיים מעוקי הצוואר של העכברים מפורטים להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים המתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אמורי. עכברי C57BL/6 שאינם תואמי היפרכולסטרולמי, תואמי גיל ומין, שימשו כדי למתן שונות תלוית מין ולקזז כל סיבוך של מצבים היפרכולסטרולמיים.
1. ניתוח קשירת קרוטיד חלקית (PCL)
הערה: קשירת עורק הצוואר החלקית של LCA בוצעה כפי שתואר קודם לכן והודגמה3.
- הרדמת העכבר על ידי שאיפת איזופלורן (5% איזופלואורן בחמצן לאינדוקציה ו-1.5% לאחר מכן לתחזוקה) לאורך כל ההליך באמצעות מכשיר אידוי הרדמה. הניחו את שכיבה של העכבר על כרית איזותרמית של Deltaphase כדי למנוע אובדן חום גוף במהלך הניתוח.
- החל משחה עינית כדי למנוע חשיפה קרטיטיס, ולאשר את עומק ההרדמה על ידי היעדר תגובה צביטה הבוהן.
- להזריק buprenorphine 0.05 מ"ג / ק"ג תת עורית כדי לנהל את הכאב מראש. יש לחטא את האזור האפילציה על ידי מריחה וניקוי עם תמיסת בטאדין ואיזופרופנול שלוש פעמים. ודא כי betadine הוא הצעד האחרון כדי לעקר את אזור הניתוח, החל מהמרכז ולסיים בצדדים.
- באמצעות טכניקות אספטיות, לבצע חתך קו האמצע הגחוני (~1 ס"מ) באזור הצוואר, ולחשוף את נקודת ההסתעפות LCA על ידי דיסקציה קהה.
- Ligate את הצוואר הפנימי השמאלי, הצוואר החיצוני, ואת העורקים העורפיים עם 6-0 תפר משי; להשאיר את עורק בלוטת התריס העליון ללא פגע.
- יש להעריך את העור ולסגור את החתך באמצעות דבק רקמות ו/או תפרים.
- העבירו את העכבר לכלוב התאוששות שחומם מראש (נשמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס) והניחו אותו על מגבת נקייה למשך עד שעה כדי למנוע היפותרמיה לאחר הניתוח.
הערה: מניסיוננו, מינון יחיד של בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) בדרך כלל מספיק לטיפול בכאב לאחר ניתוח. ניתן לתת מנה חוזרת של בופרנורפין אם בעל החיים נמצא במצוקה לאחר 24 השעות הראשונות. אם מבוצע כראוי, אין תמותה הקשורה להליך זה, ולחץ לאחר הניתוח לעכבר הוא מינימלי. העכברים מוחזרים לכלובים שלהם ומנוטרים מדי יום לאחר הניתוח. - הכן את הגדרת הזליפה.
- יש להשתמש ב-0.9% NaCl (מי מלח רגילים) המכילים 10 U/mL הפרין בשקית IV. חברו את שקית האינפוזיה 244-274 ס"מ (8-9 רגל) מהקרקע או בערך 122-152 ס"מ (4-5 רגל) גבוה יותר מלוח הנתיחה. חברו את מחט הפרפר לקצה קו המלח ושטפו את כל בועות האוויר מקו האינפוזיה.
2. בידוד עורקי הצוואר לאחר ההקרבה
- להקריב את העכברים על ידי שאיפת CO2 בעקבות פרוטוקול IACUC המוסדי.
- יש לרסס 70% אתנול על עור העכבר ולהניח אותו במצב שכיבה על לוח הנתיחה המכיל מגבות נייר ספיחה. הצמידו את כפות העכבר למגבות הספיחה שעל לוח הנתיחה באמצעות סרט דבק או מחט 21 גרם.
- באמצעות זוג מספריים סטריליים, הסר את עור העכבר החל מהבטן ועד לחלק העליון של בית החזה.
- השתמש זוג מספריים כדי לפתוח את דופן הבטן מתחת לצלעות על ידי דיסקציה קהה.
- בעזרת המספריים, בזהירות לבצע חתך לאורך הסרעפת, ולהמשיך דרך הצלעות משני צידי בית החזה עד שניתן להרים את עצם החזה. בעדינות להרים את עצם החזה עם זוג מלקחיים; לאחר מכן, להסיר את הצלעות כדי לחשוף את הלב.
- הסר בזהירות את בלוטת התימוס וכל רקמת חיבור מעל הלב כדי לדמיין את כלי הדם העיקריים.
- לנתק את הווריד קאווה עם מספריים כדי לאפשר לדם לצאת ממחזור סגור.
- יש להחדיר מחט 21 גרם פרפר המחוברת לקו האינפוזיה דרך קצה הלב לחדר השמאלי ולאפשר זלוף מדרדר למשך 2-3 דקות עם תמיסת מלח רגילה בטמפרטורת החדר. הקפידו על קצב זרימה קבוע של מי מלח רגילים על ידי שמירה על שקית המלח בגובה של 8-9 מטרים מהקרקע.
הערה: הריאות והכבד נעשים חיוורים, מה שמעיד על זלוף אופטימלי. כ 20 מ"ל של מאגר פרפוזיה משמש עבור כל עכבר. - הסר את העור מאזור הצוואר והסר את כל השומן, השרירים ורקמות החיבור כדי לחשוף את עורקי הצוואר (איור 1A).
הערה: שאר ההליך מתבצע תחת מיקרוסקופ הניתוח. - התאם את שדה הראייה כדי לאתר את אתרי הקשירה. באמצעות מספריים מיקרו-דיסקציה בקוטר 10 מ"מ, יש לבצע חתך קטן מתחת לאתר הקשירה ב-LCA כדי לאפשר זילוף.
- יש לחדור שוב למשך דקה אחת נוספת דרך החדר השמאלי ולוודא כי ה- LCA משופע היטב ונקי מכל עקבות גלויים של דם.
- השתמש מלקחיים דקים ומספריים קפיציים קטנים כדי להסיר בזהירות את הרקמות peri-adventitial המקיפות את הקרוטידים בזמן שהקרוטיס מחובר לגוף.
הערה: יש להיזהר מאוד שלא לסחוט או למתוח את עורקי הצוואר במהלך שלב ניקוי זה, שכן הדבר עלול להגדיל את מספר התאים שאינם בני קיימא. אם מבוצע כראוי, כדאיות התא בהשעיית התא הסופית היא בדרך כלל >93%.
3. בידוד חד-תאי מועשר באנדותל מקרוטידים של עכברים
הערה: ניתן להכין מראש את הריאגנטים המתוארים להלן ולאחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש: מאגרי תזה חד-גרעיניים 1x ו-0.1x עם הריאגנטים המפורטים בטבלה 1; חיץ שטיפה של גרעין יחיד עם הריאגנטים המפורטים בטבלה 1; מתכון חיץ גרעינים חד-גרעיני עם הריאגנטים המפורטים בטבלה 1. מלאי העבודה של מאגרים אלה יוכנו בהתאם לפרוטוקול היצרן. הרכב מאגר העיכול: קולגןאז סוג II 600 U/mL ו-DNase I 60 U/mL ב-0.5% סרום בקר עוברי (FBS) המכיל תמיסת מלח עם מאגר פוספט (PBS).
- בזמן שהקרוטידים עדיין מחוברים, שטפו את החלק החיצוני של עורקי הצוואר בתמיסת מלח רגילה כדי לשטוף כל זכר לדם.
- באמצעות מזרק אינסולין מצויד במחט 29 גרם, להזריק ~ 50 μL של חיץ העיכול לתוך לומן של הקצה הדיסטלי של עורק הצוואר השמאלי. כאשר חיץ העיכול מתחיל למלא את עורק הצוואר, הידקו את הקצה הפרוקסימלי של הקרוטיד באמצעות מיקרו-קליפס (איור 1B). הכנס 15-20 μL נוספים של חיץ עיכול לתוך לומן וחתך את הקצה הדיסטלי כדי למנוע את שחרורו של חיץ העיכול.
- הוציאו בזהירות את עורקי הצוואר מהעכבר (איור 1B,C) והניחו אותם בכלים בקוטר 35 מ"מ המכילים תמיסת מלח חמה (בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס).
הערה: ודא ששני המהדקים ממוקמים היטב. אם המהדק משתחרר, תמיסת העיכול יכולה לדלוף מתוך לומן ולהשפיע על ספירת התאים המתקבלת. אם זה קורה, הוסיפו תמיסה אנזימטית נוספת באמצעות מזרק אינסולין המצויד במחט של 29 גרם מהקצה הפתוח של הקרוטיד והדקו שוב את המהדק (איור 1D). אם תמיסת האנזים בופר דולפת שוב, סביר להניח שהקרוטיד נקטע במהלך תהליך ההשרשה. במקרה זה, להשליך את carotid ולא לכלול את המדגם מן המחקר. טיפול גס חוזר ונשנה בקרוטיד יקטין את הכדאיות של התא ואת איכות ההכנה של התא החד-תאי. הקפידו לזהות ולתייג נכון את עורקי הצוואר השמאלי והימני. - לדגום את הקרוטידים המושתלים במשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה לסירוגין.
4. שטיפת עורקי הצוואר
- לאחר השלמת העיכול האנזימטי הלומי, הסר את עורק הצוואר יחד עם המהדקים מצלחת 35 מ"מ. בזהירות להסיר כל מהדק, תוך הקפדה כי מאגר העיכול לא צריך לדלוף.
- החזיקו בעדינות קצה אחד של עורק הצוואר עם מלקחיים עדינים על גבי צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. החדירו מחט של 29 גרם המצוידת במזרק אינסולין המכיל 100 מיקרוגרם של חיץ עיכול חם (37 מעלות צלזיוס) לתוך הלומן ביד השנייה (איור 1D).
- לשטוף במהירות את לומן של הקרוטיד לתוך צינור microcentrifuge. חסום את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 0.3 מ"ל של FBS לתוך צינור 1.5 מ"ל. מניחים את הצינור על קרח.
הערה: ההדחה מכילה את התאים מהעיכול האנזימטי הלומינלי. הוספת FBS והפחתת הטמפרטורה עוצרת את תהליך העיכול האנזימטי. אם מספר התאים בתכשיר גבוה ומכיל פסולת או רקמת שומן, מומלץ מאוד להשתמש במסננת תאים של 50 או 70 מיקרומטר כדי לסנן פסולת של רקמות לא רצויות. כדי להגדיל את ספירת התאים הבודדים, מומלץ לשטוף מספר קרוטידים. כאן, כדי להשיג לפחות 5,000 תאים, 10-12 קרוטידים נשטפו ואוחסנו כדגימה אחת. - צנטריפוגה התאים ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה מצויד רוטור זווית קבועה (ראה טבלת החומרים).
- יש להשליך את הסופר-נאטנט ולתלות מחדש את כדור התא במאגר עיכול המכיל מגיב דיסוציאציה של תאים (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להפריד את כל התאים לתאים בודדים.
הערה: אם מספר התאים בתכשיר נמוך, הגדל את מהירות הצנטריפוגה עד 2,000-3,000 × גרם כדי לסובב את התאים. יתר על כן, באמצעות צינורות צנטריפוגה 0.5 מ"ל מאפשר הדמיה טובה יותר של כדור התא בתחתית הצינור. - חסום את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 0.15 מ"ל של FBS לתוך צינור 0.5 מ"ל.
- צנטריפוגה המתלה החד-תאי ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגה המצוידת ברוטור בעל זווית קבועה, כמו בשלב 4.4.
- יש להשליך את הסופר-נאטנט ולהשהות את התאים ב-100 μL של תמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) קר כקרח ב-PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.2 מ"ל.
הערה: שימוש בצינורות צנטריפוגה של 0.2 מ"ל משפר את ההדמיה של הכדור החד-תאי בתחתית הצינור.
5. אנליזות חד-תאיות וחד-גרעיניות
- יש להשעות ולהגיש את ההכנה החד-תאית ל-scRNAseq.
- השהה את הכדור החד-תאי עם 100 μL של BSA קר כקרח 1% ב- PBS בצינור של 0.2 מ"ל.
- לאחר חידוש השימוש בתאים לצורך אנקפסולציה של תא יחיד, המשך מיד לאנקפסולציה חד-תאית וברקוד באמצעות מערכת חלוקה וברקוד חד-תאית מבוססת מיקרופלואידיקה (ראה טבלת החומרים).
- לפני הגשת הדגימות לליבת הגנומיקה, לספור ולבדוק את ההכנות החד-תאיות; להבטיח את היעדרם של אגרגטים של תאים.
הערה: ניתן למזער עוד יותר את הצבירה של תאים בודדים על-ידי הגדלת כמות ה-BSA בעד 2%.
- דחה ושלח את הכנת התא הבודד עבור scATACseq.
- השהה את גלולת התא ב-100 μL של 0.04% BSA ב-PBS 1x קר כקרח וצנטריפוגה של מתלה חד-תאי ב-500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
- Lyse את ההשעיה החד-תאית עם חיץ תזה קר כקרח 0.1x (טבלה 1) ודגירה במשך 5 דקות על קרח.
- מערבבים את הליזאט 10 פעמים עם פיפטה P-20 ודוגרים במשך 10 דקות נוספות.
- הוסיפו 500 μL של חיץ כביסה מקורר (טבלה 1) לתאים המוזנחים וערבבו 5 פעמים באמצעות פיפטה.
הערה: השתמש במסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר כדי לסנן כל פסולת מתלייה התא ולהעביר אותה לצינור של 2 מ"ל. - צנטריפוגה ליזאט ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נאטנט והניחו מחדש את כדור הגרעין במאגר הגרעינים המדולל (150 μL) (ראו טבלת החומרים וטבלה 1). לספור ולבדוק את ההכנות של גרעינים בודדים באמצעות hemocytometer11.
- שלח את דגימת הגרעין הבודד לליבת הגנומיקה לצורך טרנספוזיציה של גרעין יחיד, חלוקת גרעינים, הכנת ספרייה וריצוף.
הערה: אם מספר התא ההתחלתי נמוך, מקובל לצפות בפסולת לאורך הגרעינים. לכן, מומלץ להתחיל עם מספר תא גבוה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוחי קשירת קרוטיד חלקיים בוצעו על 44 עכברים, ותחילת זרימת d ב- LCA אומתה על ידי ביצוע אולטרה-סאונד יום אחד לאחר ניתוח קשירה חלקית. ניתוח קשירה חלקית מוצלח גורם למהירות זרימת דם מופחתת והופך את זרימת הדם (זרימה מופרעת) ב- LCA3. עורקי הצוואר נותחו ביומיים או בשבועיים לאחר הקשירה. הלומן של כל קרוטיד היה נתון לעיכול קולגןאז, והוכנו תרחיפים חד-תאיים מועשרים באנדותל או בגרעין יחיד. מתלים חד-תאיים אוחד-תאיים מ-10 RCAs ו-LCAs כדי להגדיל את תפוקת התא. התאים/גרעינים שהוכנו עברו לאחר מכן ברקוד וריצוף. עבור מחקר sc-RNAseq, מספר התאים הבודדים שהתקבלו היה ~ 9,700. התפלגות התאים מ-4 דגימות מוצגת בטבלה 2.
כמו כן, עבור מחקר scATACseq, תאים בודדים בודדו מ -12 RCAs ו- LCAs שהוכנו, היו נתונים לטיפול בטרנספוזאז, ברקוד ורצף. הריצוף בוצע עבור 18,324 גרעינים בודדים, אשר אוחדו מ-1,291 (RCA של יומיים [2D-R]), 5,351 (LCA של יומיים [2D-L]), 5,826 (RCA של שבועיים [2W-R]) ו-5,856 (LCA של שבועיים [2W-L]) (טבלה 2). תכשירים מייצגים של תאים בודדים וגרעינים בודדים, כפי שהם מוצגים על-ידי מיקרוסקופיית שדה בהיר ומיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה, מוצגים באיור 2A,B. היעילות של הכנת גרעינים בודדים מתרחיף חד-תאי מוצגת באיור 2C.
הגרעינים (~ 7,000 כל אחד) מדגימות דו-ממדיות (RCAs ו- LCAs) ו- 2W (RCAs ו- LCAs) דוגרו עם תערובת טרנספוזיציה (Tn5 טרנספוזאז אנזים ובופר) ראו טבלת החומרים) במשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בהתאם לפרוטוקול היצרן. בהתבסס על המלצת היצרן, תנאי דטרגנט קלים סייעו לשמור על שלמות הגרעינים במהלך התיוג. תערובת אב, המורכבת ממגיב ברקוד, סוכן מפחית B ואנזים ברקוד, הועמסה לאחר מכן על פלטפורמת אנקפסולציה של תאים/גרעינים מיקרופלואידיים כדי להכין תחליבי ג'ל חד-גרעיניים עם ברקוד בהתאם להוראות היצרן.
לאחר הריצוף, חבילת התוכנה החד-תאית של Cell Ranger שימשה לפירוק מפרק, יישור עיבוד ברקוד ואשכולות ראשוניים של פרופילי scATACseq ו-scRNaseq גולמיים. במחקר scRNAseq, התפלגות הגנים לכל תא, מזהה מולקולרי ייחודי (UMI) לכל תא, קריאות מיטוכונדריאליות לכל תא ומידע רוויית ריצוף מוצגים באיור 3A-C. באופן דומה, עבור מחקר scATACseq, מדדי בקרת איכות המציגים את התפלגות גודל ההוספה (תבנית פסים של נוקלאוזומים) וציון העשרת TSS מנורמל מוצגים באיור 3D-F. בנוסף, מקטעי האחוזים הנקראים בפסגות, שברי אזורי שיא, ציון העשרת TSS, יחס הקריאות באתרים גנומיים ברשימה השחורה ויחס אות נוקלאוזום מוצגים באיור 3G-K.
העשרת האנדותל הייתה כמותית על ידי השוואת שיטה זו לזו של עיכול אנזימטי של כל עורק הצוואר12. ספירת תאי האנדותל מהעיכול המלא של עורק הצוואר הייתה 3-5% מכלל התאים שהתקבלו, בעוד ששיטה זו אפשרה העשרת תאי אנדותל ל->50% 8. באופן דומה, מחקר חד-תאי אחר שהשתמש באבי העורקים של כל העכבר הראה כי חלק האנדותל היה <7% מספירת התאים הכוללת. לצורך ניתוח מעמיק של RNAseq חד-תאי ו-ATACseq חד-תאי, הקוראים מתבקשים להתייחס ל-8.
איור 1: בידוד עורקי הצוואר לצורך הכנת תאים בודדים. (A) מבט אנטומי על עורקי הצוואר בעכברים. חיצים אדומים וכניסה מראים את עורק הצוואר השמאלי המבודד לאחר ניקוי של שומן periadventitial. לשרטוט של האנטומיה והקשירה של הקרוטיד, ראו איור 1 ב-Nam et al3 (B) התמונה מראה את מיקומם של מיקרו-קליפים לאחר מילוי עורק הצוואר במאגר העיכול. (C) עורק הצוואר המושתל המכיל חיץ עיכול. קנה מידה: מרחק בין קווים שחורים = 1 מ"מ. (D) מחט של 29 גרם בלומן של עורק הצוואר של העכבר. שלב זה מסייע לחדש את עורק הצוואר עם חיץ עיכול במידת הצורך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הכנה חד-תאית וחד-גרעינית מעיכול אנזימטי לומינלי של עורק הצוואר של העכבר . (A) תכשירים מייצגים חד-תאיים וחד-גרעיניים. פסי קנה מידה = 0.25 מ"מ (B) ניגודיות פאזה מייצגת ותמונות ג'ל-אדום של מכינות של גרעין יחיד. פסי קנה מידה = 0.25 מ"מ. (C) היעילות של הכנת גרעינים בודדים בעמודה השמאלית מציגה את מספר התאים הבודדים בהתחלה ואילו העמודה הימנית מציגה את מספר הגרעינים הבודדים לאחר עיבוד עם מאגר בידוד גרעינים בשלבים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מדדי QC סטנדרטיים למחקר scRNAseq ו-scATACseq. עלילות כינור מראות (A) את התפלגות הגנים לכל תא (nFeature RNA), (B) UMI לכל תא (nCount_RNA), (C) קריאות מיטוכונדריאליות לכל תא (אחוז mt) עבור נתוני scRNAseq. (D ו-E) מראים את תבנית הפסים של הנוקלאוזומים עבור מחקר ה-scATACseq. ההיסטוגרמה של גדלי מקטעי דנ"א מציגה תבנית פסים חזקה של נוקלאוזומים המתאימה לאורך הדנ"א העוטף נוקלאוזום יחיד. (F) ציון העשרת TSS מנורמל בכל עמדה ביחס ל-TSS. עלילות הפיזור/כינור מראות (G) אחוזי קריאות קטעים בפסגות, מידה של עומק רצף, (H) שברי אזורי שיא המציגים את מספר השברים החופפים פסגות, (I) ציון העשרת TSS, יחס בין התפלגות הקריאות המצטברת המרוכזת ב- TSSs לבין זו המקיפה את ה- TSS המתאים, (J) יחס הרשימה השחורה, יחס של קריאות באתרים גנומיים ברשימה השחורה, ו-(K) אות נוקלאוזום, יחס בין מקטעים חד-נוקלאוזומליים לשברים נטולי נוקלאוזומים. קיצורים: scRNAseq = ריצוף RNA חד-תאי; scATACseq = בדיקה חד-תאית לריצוף כרומטין נגיש של טרנספוזה; QC = בקרת איכות; UMI = מזהה מולקולרי ייחודי; TSS = אתר התחלת תמלול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: הרכב של ליזיס חד-גרעיני ומאגרי שטיפה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: ספירת תאים בודדים וגרעינים בודדים מעיכול לומינלי של עורק הצוואר של עכבר. הטבלה מציגה גם אמצעים לקריאה/תא ומספר גנים/תא עבור נתוני scRNAseq. עבור נתוני scATACseq, שברים/תאים ממוצעים וסך כל הקריאות המתקבלות לכל דגימה מוצגים8. קיצורים: scRNAseq = ריצוף RNA חד-תאי; scATACseq = בדיקה חד-תאית לריצוף כרומטין נגיש של טרנספוזה; 2D = יומיים; 2W = שבועיים; R/RCA = עורק הצוואר הימני; L/LCA = עורק הצוואר השמאלי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לבידוד תכשירים חד-תאיים מעורק הצוואר של העכבר. ניתן לחקור במדויק את השפעת זרימת ה-d על תאי האנדותל אם ניתוח ה-PCL מבוצע כהלכה. חשוב לזהות נכונה את ענפי הצוואר המשותף, כגון הצוואר החיצוני, הצוואר הפנימי, העורק העורפי ועורק בלוטת התריס העליון. אימות דפוסי זרימה על ידי אולטרה-סאונד מאמת עוד יותר את ההתחלה המוצלחת של תנאי זרימה d. למרות שניתן לבצע ניתוח PCL בעכברים ללא קשר לגילם, הגיל המועדף הוא 10 ± שבועיים. עכברים ועכברים מבוגרים יותר עם רקע היפרכולסטרולמי נוטים בדרך כלל להיות בעלי שומן פריאדוונטי רב יותר ועור נוקשה יותר.
חיוני לנתח בזהירות את התכשירים החד-תאיים המועשרים באנדותל בעורק הצוואר ללא הרקמות הסובבות ושומן פריאדוונטיאלי. לומן של carotids חייב להיות perfused ביסודיות כדי למנוע זיהום תאי הדם בהכנות של תאים בודדים. זיהוי ותיוג לא נאותים של רקמות עלולים לגרום לסטיית תקן גבוהה. תכנון זהיר וניהול זמן נדרשים לפרוטוקול זה. מנתח ומפעיל מיומן יכול לקחת 15-20 דקות כדי לבצע ניתוח PCL אחד. הקרבה, בידוד קרוטיד ועיכול אנזימטי לומינלי מכל עכבר ייקחו 35-40 דקות נוספות. זמן העיבוד המעשי משטיפת תאי אנדותל ועד הכנה חד-תאית/חד-גרעינית הוא שעתיים נוספות. תכנון מוקפד ועבודת צוות מומלצים מאוד.
כמו בכל פרוטוקול ניסיוני, יש לקחת בחשבון כמה חסרונות ומגבלות. הפרוטוקול הנוכחי אינו כולל צעדים למניעת הפעלה מלאכותית של תגובה מוקדמת מיידית במהלך דיסוציאציה של רקמת הלומיה. בספרות דווח כי עיכול אנזימטי יכול להוביל לאירועי איתות סטרס, כגון דלקת ואפופטוזיס. ניתן לטפל בכך על ידי שילוב קבוצות ביקורת מתאימות בתכנון הניסוי. בנוסף, יש לשקול שימוש בשיטות מעבדה רטובות שיכולות למזער את ההפעלה המלאכותית של תגובה מיידית במהלך עיכול אנזימטי, כגון פרוטאזות פעילות קרה,13,14.
פרוטוקול זה יכול לשמש לכל זן עכבר ללא קשר לרקע הגנטי שלו. עם זאת, התכשירים המועשרים באנדותל יכולים לענות בצורה הטובה ביותר על שאלות מחקר הנוגעות לשינויים באנדותל, ולכן הם מתאימים היטב לנוקאאוטים ספציפיים ל-EC ולעכברים מהונדסים ספציפיים ל-EC. ניתן להתאים את שיטת הבידוד החד-תאית הזו לביצוע מחקרים רב-תאיים חד-תאיים ומבחנים אחרים המבוססים על ציטומטריה של זרימה כגון ציטומטריה של זרימה הדמיה. גישת העיכול הלומינלי יכולה לשמש עבור אבי העורקים של עכברים שזה עתה הושגו, עורקים מבעלי חיים גדולים (ארנבות וחזירים), כמו גם עבור צמחים וסקולריים אנושיים שהושגו זה עתה. באופן קולקטיבי, שיטה זו תאפשר לנו להבין באופן מלא את התפקיד המדויק של זרימת הדם על תפקוד האנדותל ותכנות מחדש ברזולוציה של תא בודד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
HJ הוא המייסד של פלוקינס פארמה. למחברים אחרים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות מענקים HL119798, HL095070 ו- HL139757 ל- HJ. HJ נתמך גם על ידי פרופסוריית הקתדרה על שם וואלאס ה. קולטר לפקולטה. השירותים הניתנים על ידי ליבת הגנומיקה המשולבת של אמורי (EIGC) סובסדו על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אמורי ונתמכו חלקית גם על ידי הברית המדעית הקלינית והתרגומית של ג'ורג'יה של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר. UL1TR002378. התוכן המובא לעיל הוא באחריות המחברים בלבד ואינו משקף את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
References
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al.
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
Tags
ביולוגיה גיליון 176 תאי עורק תאי אנדותל RNAseq חד-תאי ATACseq חד-תאי טרשת עורקיםErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 06/22/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
