ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Vi presenterar en metod för att isolera endotelceller och kärnor från lumen i mushalspulsåder som utsätts för stabila eller störda flödesförhållanden för att utföra encelliga omics-experiment.
Abstract
Ateroskleros är en inflammatorisk sjukdom i de arteriella regionerna som utsätts för stört blodflöde (d-flöde). D-flöde reglerar uttrycket av gener i endotelet på transkriptomiska och epigenomiska nivåer, vilket resulterar i proaterogena svar. Nyligen utfördes encellig RNA-sekvensering (scRNAseq) och encellsanalys för Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) -studier för att bestämma de transkriptomiska och kromatintillgänglighetsförändringarna vid en encellsupplösning med hjälp av musens partiella karotisligeringsmodell (PCL). Eftersom endotelceller (EC) representerar en mindre bråkdel av de totala cellpopulationerna i artärväggen användes en luminal matsmältningsmetod för att erhålla EC-berikade encellspreparat. För denna studie utsattes möss för PCL-kirurgi för att inducera d-flöde i den vänstra halspulsådern (LCA) medan de använde den högra halspulsådern (RCA) som en kontroll. Halspulsådrorna dissekerades ut två dagar eller två veckor efter PCL-operationen. Lumen i varje halspulsåder utsattes för kollagenasförtunning och endotelberikade enstaka celler eller enstaka kärnor erhölls. Dessa encells- och enkärniga preparat streckkodades därefter med hjälp av en 10x Genomics mikrofluidisk inställning. De streckkodade encellerna och enkärnorna användes sedan för RNA-beredning, biblioteksgenerering och sekvensering på en DNA-sekvenserare med hög genomströmning. Efter bioinformatikbehandling identifierade scRNAseq- och scATACseq-dataseten olika celltyper från den luminala matsmältningen, främst bestående av ECs. Glattmuskelceller, fibroblaster och immunceller var också närvarande. Denna EC-anrikningsmetod hjälpte till att förstå effekten av blodflödet på endotelet, vilket kunde ha varit svårt med den totala artärsmältningsmetoden. Den EC-berikade encellsberedningsmetoden kan användas för att utföra encelliga omics-studier i EC-knockouts och transgena möss där effekten av blodflödet på dessa gener inte har studerats. Viktigt är att denna teknik kan anpassas för att isolera EC-berikade enskilda celler från mänskliga artärutväxter för att utföra liknande mekanistiska studier.
Introduction
Detta laboratorium har tidigare visat att induktion av d-flöde leder till snabb och robust aterosklerosutveckling hos hyperlipidemiska möss 1,2. Den nya musmodellen av d-flödesinducerad åderförkalkning var möjlig med hjälp av partiell karotisligering (PCL) kirurgi 3. PCL-kirurgi inducerar lågt och oscillerande blodflödestillstånd eller d-flöde i den ligerade vänstra halspulsådern (LCA). Däremot fortsätter den kontralaterala högra halspulsådern (RCA) att möta stabilt laminärt flöde (s-flöde). Tidigare, för att förstå effekten av d-flöde på endotelceller, dissekerades halspulsådrorna ut efter partiell ligeringskirurgi och spolades med ett fenol- och guanidinisotiocyanatbaserat lysmedel (luminalt RNA / DNA-spolningsmetod)2,4, vilket gav endotelberikade "poolade bulk" RNA eller DNA. Dessa poolade bulk-RNA eller DNA bearbetades sedan för transkriptomiska studier eller epigenomiska DNA-metylomstudier, respektive 4,5,6. Dessa studier hjälpte till att upptäcka flera flödeskänsliga gener och mikroRNA vars roller i endotelbiologi och åderförkalkning undersöktes omfattande 4,6,7.
Trots endotelanrikning kunde dessa bulk-RNA / DNA-studier inte skilja den specifika rollen för varje celltyp i artärväggen vid d-flödesinducerad åderförkalkning. Endotelberikad encellsisolering (sc) och scRNA- och scATAC-sekvenseringsstudier utfördes för att övervinna denna begränsning8. För detta utsattes C57Bl6-möss för PCL-kirurgi för att inducera d-flöde i LCA medan de använde den s-flödesexponerade RCA som kontroll. Två dagar eller två veckor efter PCL-operationen offrades mössen och halspulsådrorna dissekerades och städades upp. Lumen hos både LCA och RCA infunderades med kollagenas, och de luminala kollagenasuppslutningarna innehållande ECs som en signifikant fraktion och andra arteriella celler samlades in. Encellssuspensionen (scRNAseq) eller enkärnesuspensionen (scATACseq) framställdes och streckkodades med unika identifierare för varje cell eller kärna med hjälp av en 10x Genomics-inställning. RNA utsattes för cDNA-biblioteksberedning och sekvenserades.
ScRNAseq- och scATACseq-datauppsättningarna bearbetades med hjälp av Cell Ranger Single-Cell Software och analyserades ytterligare av Seurat- och Signac R-paketen 9,10. Varje cell och kärna tilldelades en celltyp från dessa analyser och grupperades i celltypen baserat på markörgener och unika genuttrycksmönster. Resultaten av scRNAseq och scATACseq visade att dessa encellspreparat är berikade med ECs och även innehåller glattmuskelceller (SMC), fibroblaster och immunceller.
Ytterligare analyser visade att EG-populationen i den luminala digestionen är mycket divergerande och plastisk (8 olika EG-kluster) och lyhörd för blodflödet. Viktigast av allt, dessa resultat visade att d-flow omprogrammerar ECs från en aterosskyddad antiinflammatorisk fenotyp till pro-aterogena fenotyper, inklusive proinflammatorisk, endotel-till-mesenkymal övergång, endotelstam / stamcellsövergång och mest överraskande, endotel-till-immuncellliknande övergång. Dessutom avslöjar scATACseq-data nya flödesberoende kromatintillgänglighetsförändringar och transkriptionsfaktorbindningsställen på ett genomomfattande sätt, vilket ligger till grund för flera nya hypoteser. Metodiken och protokollet för beredning av enstaka endotelceller för encelliga multi-omics-studier från mushalspulsådrorna beskrivs nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs nedan godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Emory University. Icke-hyperkolesterolemiska, ålders- och könsmatchade C57BL/6-möss användes för att mildra könsberoende variation och kompensera eventuella komplikationer av hyperkolesterolemiska tillstånd.
1. Partiell karotisligering (PCL) kirurgi
OBS: Partiell halspulsåderligering av LCA utfördes som tidigare beskrivits och visats3.
- Bedöva musen genom inandning av isofluran (5% isofluoran i syre för induktion och 1,5% efter det för underhåll) under hela proceduren med hjälp av en bedövningsförångare. Placera musen liggande på en Deltaphase isotermisk dyna för att förhindra förlust av kroppsvärme under operationen.
- Applicera en okulär salva för att förhindra exponering keratit och bekräfta djupet av anestesi genom frånvaro av tå nypa svar.
- Injicera buprenorfin 0,05 mg/kg subkutant för att hantera smärta i förebyggande syfte. Desinficera det epilerade området genom att applicera och rengöra med betadin och isopropanollösning tre gånger. Se till att betadin är det sista steget för att sterilisera operationsområdet, från mitten och avsluta vid sidorna.
- Använd aseptiska tekniker, gör ett ventralt mittlinjesnitt (~ 1 cm) i nackregionen och exponera LCA-grenpunkten genom trubbig dissektion.
- Ligate den vänstra inre halspulsådern, yttre halspulsådern och occipitala artärer med 6-0 silkesuture; lämna den överlägsna sköldkörtelartären orörd.
- Approximera huden och stäng snittet med vävnadslim och/eller suturer.
- Överför musen till en förvärmd återhämtningsbur (hålls vid 37 °C) och placera den på en ren handduk i upp till 1 timme för att undvika hypotermi efter operationen.
OBS: Enligt vår erfarenhet är en förebyggande engångsdos av buprenorfin (0,05 mg/kg) vanligtvis tillräcklig för smärtlindring efter operationen. En upprepad dos buprenorfin kan administreras om djuret är i nöd efter de första 24 timmarna. Om det utförs korrekt finns det ingen dödlighet i samband med denna procedur, och postoperativ stress på musen är minimal. Mössen återförs till sina respektive burar och övervakas dagligen efter operationen. - Förbered perfusionsinställningen.
- Använd 0,9% NaCl (normal saltlösning) som innehåller 10 U/ml heparin i en IV-påse. Haka IV-påsen 244-274 cm (8-9 fot) från marken eller cirka 122-152 cm (4-5 fot) högre än dissektionsbrädan. Fäst fjärilsnålen i slutet av saltlösningen och spola eventuella luftbubblor ur IV-linjen.
2. Isolering av halspulsåder efter offer
- Offra mössen genom CO2-inandning enligt det institutionella IACUC-protokollet.
- Spraya 70% etanol på mushuden och placera den i ryggläge på dissektionskortet som innehåller adsorberande pappershanddukar. Fäst musens tassar på de adsorberande handdukarna på dissektionsbrädan med tejp eller en 21 G nål.
- Använd en steril sax och ta bort musens hud från buken och hela vägen till toppen av bröstkorgen.
- Använd en sax för att öppna bukväggen under bröstkorgen genom trubbig dissektion.
- Använd saxen och gör försiktigt ett snitt längs membranets längd och fortsätt genom revbenen på båda sidor av bröstkorgen tills bröstbenet kan lyftas bort. Lyft försiktigt bort bröstbenet med ett par pincett; Ta sedan bort bröstkorgen för att exponera hjärtat.
- Ta försiktigt bort tymus och eventuell bindväv över hjärtat för att visualisera de stora kärlen.
- Skär vena cava med sax så att blod kan komma ut ur sluten cirkulation.
- Sätt in en 21 G fjärilsnål ansluten till IV-linjen genom hjärtats topp i vänster kammare och tillåt retrograd perfusion i 2-3 minuter med normal saltlösning vid rumstemperatur. Se till att en konstant flödeshastighet för normal saltlösning upprätthålls genom att hålla saltlösningspåsen i höjden 8-9 fot från marken.
OBS: Lungorna och levern blir bleka, vilket indikerar optimal perfusion. Cirka 20 ml perfusionsbuffert används för varje mus. - Ta bort huden från nackregionen och ta bort allt fett, muskler och bindväv för att exponera halspulsådrorna (figur 1A).
OBS: Resten av proceduren utförs under dissekeringsmikroskopet. - Justera synfältet för att hitta ligeringsplatserna. Använd 10 mm mikrodissektionssaxen och gör ett litet snitt under ligeringsstället i LCA för att möjliggöra perfusion.
- Blötlägg igen i ytterligare 1 min via vänster kammare och se till att LCA är väl genomsyrad och fri från synliga blodspår.
- Använd pincett med fin spets och små fjädersaxar för att försiktigt ta bort de peri-adventitiella vävnaderna som omger halsdjuren medan halspulsådern är fäst vid kroppen.
OBS: Var extremt försiktig så att du inte klämmer eller sträcker halspulsådrorna under detta rengöringssteg, eftersom detta kan öka antalet icke-livskraftiga celler. Om det utförs korrekt är cellviabiliteten i den slutliga cellsuspensionen vanligtvis >93%.
3. Endotelcellberikad encellsisolering från möss karotider
OBS: De reagenser som beskrivs nedan kan beredas i förväg och lagras vid 4 °C tills de används: 1x och 0,1x enkärniga lysbuffertar med de reagenser som förtecknas i tabell 1; tvättbuffert med en kärna med de reagenser som anges i tabell 1, recept med kärnor med en kärna med buffert med de reagenser som anges i tabell 1. Arbetslagren för dessa buffertar skall upprättas i enlighet med tillverkarens protokoll. Digestionsbuffertsammansättning: Kollagenas typ II 600 U / ml och DNas I 60 U / ml i 0,5% fetalt bovint serum (FBS) -innehållande fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Medan karotiderna fortfarande är fästa, tvätta utsidan av halspulsådrorna med normal saltlösning för att spola bort eventuella spår av blod.
- Använd en insulinspruta försedd med en 29 G nål och injicera ~ 50 μL av matsmältningsbufferten i lumen i den distala änden av den vänstra halspulsådern. När matsmältningsbufferten börjar fylla halspulsådern, kläm fast den proximala änden av halspulsådern med ett mikroklämma (figur 1B). Inför ytterligare 15-20 μL matsmältningsbuffert i lumen och klipp den distala änden för att undvika frisättning av matsmältningsbufferten.
- Stick försiktigt ut halspulsådrorna från musen (figur 1B,C) och placera dem i 35 mm skålar som innehåller varm (vid 37 °C) hepesbuffrad saltlösning.
OBS: Se till att båda klämmorna är ordentligt placerade. Om klämman lossnar kan matsmältningslösningen läcka ut ur lumen och påverka det erhållna cellantalet. Om detta händer, tillsätt ytterligare enzymatisk lösning med en insulinspruta försedd med en 29 G-nål från halspulsåderns öppna ände och säkra klämman igen (figur 1D). Om enzymbuffertlösningen läcker igen är det troligt att halspulsådern avskiljs under explantationsprocessen. Kassera i så fall halspulsådern och uteslut provet från studien. Upprepad grov hantering av halspulsådern kommer att minska cellviabiliteten och kvaliteten på encellsberedningen. Var noga med att identifiera och korrekt märka vänster och höger halspulsåder. - Inkubera de explanterade halsdjuren i 45 minuter vid 37 °C med intermittent gungning.
4. Spola halspulsådrorna
- Efter avslutad luminal enzymatisk matsmältning, ta bort halspulsådern tillsammans med klämmorna från 35 mm-skålen. Ta försiktigt bort varje klämma och se till att matsmältningsbufferten inte läcker.
- Håll försiktigt ena änden av halspulsådern med fina pincett ovanpå ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. För in en 29 G-nål försedd med en insulinspruta som innehåller 100 μl varm matsmältningsbuffert (37 °C) i lumen med den andra handen (figur 1D).
- Spola snabbt karotisens lumen i mikrocentrifugröret. Blockera den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 0,3 ml FBS i 1,5 ml röret. Placera röret på is.
OBS: Spolningen innehåller cellerna från den luminala enzymatiska matsmältningen. Att lägga till FBS och sänka temperaturen stoppar den enzymatiska matsmältningsprocessen. Om antalet celler i preparatet är högt och innehåller skräp eller fettvävnad rekommenderas användning av en 50 eller 70 μm cellsil för att filtrera bort oönskade vävnader. För att öka antalet enceller rekommenderas spolning av flera karotider. Här, för att få minst 5 000 celler, spolades 10-12 karotider och poolades som ett prov. - Centrifugera cellerna vid 500 × g i 5 minuter vid 4 °C med en centrifug utrustad med en rotor med fast vinkel (se materialförteckningen).
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i digestionsbuffert som innehåller celldissociationsreagens (se materialförteckningen) i 5 minuter vid 37 °C för att separera alla celler i enskilda celler.
OBS: Om antalet celler i preparatet är lågt, öka centrifughastigheten upp till 2 000-3 000 × g för att snurra ner cellerna. Dessutom underlättar användning av 0,5 ml centrifugrör bättre visualisering av cellpelleten längst ner på röret. - Blockera den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 0,15 ml FBS i 0,5 ml röret.
- Centrifugera encellssuspensionen vid 500 × g i 5 minuter vid 4 °C med en centrifug utrustad med en rotor med fast vinkel, som i steg 4.4.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 μl iskall 1% bovint serumalbumin (BSA) lösning i PBS i ett 0,2 ml mikrocentrifugrör.
OBS: Att använda 0,2 ml centrifugrör förbättrar visualiseringen av encellspelleten längst ner på röret.
5. Encells- och enkärnanalyser
- Återsuspendera och skicka in encellspreparatet för scRNAseq.
- Återsuspendera encellpelleten med 100 μL iskall 1% BSA i PBS i ett 0,2 ml rör.
- Efter att ha återsuspenderat cellerna för encellsinkapsling, fortsätt omedelbart för encellsinkapsling och streckkodning med hjälp av ett mikrofluidikbaserat encellspartitionerings- och streckkodningssystem (se materialförteckningen).
- Innan du skickar in proverna till Genomics Core, räkna och inspektera encellspreparaten; säkerställa frånvaron av cellaggregat.
OBS: Aggregeringen av enskilda celler kan minimeras ytterligare genom att öka BSA-mängden upp till 2%.
- Återsuspendera och skicka in encellspreparatet för scATACseq.
- Återsuspendera cellpelleten i 100 μl 0,04% BSA i iskall 1x PBS och centrifugera encellssuspensionen vid 500 × g vid 4 °C.
- Lysera encellssuspensionen med iskall 0,1x lysbuffert (tabell 1) och inkubera i 5 min på is.
- Blanda lysatet 10 gånger med en P-20-pipett och inkubera i ytterligare 10 minuter.
- Tillsätt 500 μl kyld tvättbuffert (tabell 1) till lyscellerna och blanda 5 gånger med pipett.
OBS: Använd en 70 μm cellsil för att filtrera eventuellt skräp från cellsuspensionen och överföra dem till ett 2 ml rör. - Centrifugera lysaten vid 500 × g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och återsuspendera kärnpelleten i den utspädda kärnbufferten (150 μl) (se materialförteckningen och tabell 1). Räkna och inspektera preparaten med en kärna med hjälp av en hemocytometer11.
- Skicka in provet med en kärna till Genomics Core för transponering av enkärnor, kärnpartitionering, biblioteksförberedelse och sekvensering.
OBS: Om det ursprungliga cellnumret är lågt är det vanligt att observera skräp längs kärnorna. Därför rekommenderas att börja med ett högt cellnummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Partiella karotisligeringsoperationer utfördes på 44 möss, och uppkomsten av d-flöde i LCA validerades genom att utföra ultraljud en dag efter partiell ligeringskirurgi. Framgångsrik partiell ligeringskirurgi orsakar minskad blodflödeshastighet och vänder blodflödet (stört flöde) i LCA3. Halspulsådrorna dissekerades ut antingen vid två dagar eller vid två veckor efter ligering. Lumen i varje karotis utsattes för kollagenasförtunning och endotelberikade enkelceller eller enkärniga suspensioner framställdes. Encellssuspensioner poolades från 10 RCA och LCA för att öka cellutbytet. De framställda cellerna/kärnorna streckkodades därefter och sekvenserades. För sc-RNAseq-studien var antalet erhållna enskilda celler ~ 9 700. Fördelningen av celler från 4 prover visas i tabell 2.
På samma sätt isolerades enskilda celler från 12 RCA och LCA som framställdes, utsattes för transposasbehandling, streckkodades och sekvenserades för scATACseq-studien. Sekvensering utfördes för 18 324 enkla kärnor, som poolades från 1 291 (2-dagars RCA [2D-R]), 5 351 (2-dagars LCA [2D-L]), 5 826 (2-veckors RCA [2W-R]) och 5 856 (2-veckors LCA [2W-L]) (Tabell 2). Representativa encells- och enkärniga preparat som visualiseras med ljusfältsmikroskopi och faskontrastmikroskopi visas i figur 2A,B. Effektiviteten hos enkärnig beredning från encellssuspension visas i figur 2C.
Kärnorna (~ 7 000 vardera) från 2D (RCA och LCA) och 2W (RCA och LCA) prover inkuberades med en Transposition Mix (Tn5 transposasenzym och buffert) se materialtabellen) i 60 minuter vid 37 ° C enligt tillverkarens protokoll. Baserat på tillverkarens rekommendation hjälpte ett milt tvättmedelstillstånd att hålla kärnorna intakta under tagmentation. En masterblandning, bestående av ett streckkodningsreagens, reduktionsmedel B och streckkodningsenzym, laddades sedan på en mikrofluidisk cell / kärninkapslingsplattform för att förbereda enkärniga gelemulsioner med streckkodning enligt tillverkarens instruktioner.
Efter sekvensering användes Cell Ranger Single-Cell Software-sviten för demultiplexering, streckkodsbehandlingsjustering och initial klustring av de råa scATACseq- och scRNaseq-profilerna. För scRNAseq-studien visas fördelningen av gener per cell, unik molekylär identifierare (UMI) per cell, mitokondriella avläsningar per cell och sekvenseringsmättnadsinformation i figur 3A-C. På samma sätt visas för scATACseq-studien kvalitetskontrollmätvärden som visar insatsstorleksfördelningen (nukleosombandmönster) och normaliserad TSS-anrikningspoäng i figur 3D-F. Dessutom visas procentfragmentet i topparna, toppregionfragment, TSS-anrikningspoäng, förhållandet mellan läsningar i svartlistade genomiska platser och nukleosomsignalförhållandet i figur 3G-K.
Endotelanrikning kvantifierades genom att jämföra denna metod med den enzymatiska matsmältningen av hela halspulsådern12. Endotelcellantalet från den fullständiga halspulsådersmältningen var 3-5% av de totala cellerna erhållna, medan denna metod möjliggjorde anrikning av endotelceller till >50% 8. På samma sätt visade en annan encellsstudie som använde hela musaortan att endotelfraktionen var <7% av det totala cellantalet. För en djupgående encellig RNAseq- och encellig ATACseq-analys uppmanas läsarna att hänvisa till 8.
Figur 1: Isolering av halspulsåder för encellsberedning. (A) Anatomisk syn på halspulsådrorna hos möss. Röda pilar och infälld visar den isolerade vänstra halspulsådern efter rengöring av periadventitialt fett. För en schematisk bild av halspulsåderns anatomi och ligeringar, se figur 1 i Nam et al3 (B) Bilden visar placeringen av mikroklipp efter att ha fyllt halspulsådern med matsmältningsbufferten. C) Explanterad halspulsåder som innehåller digestionsbuffert. Skala: avstånd mellan svarta linjer = 1 mm. (D) En 29 G nål i lumen i mushalspulsådern. Detta steg hjälper till att fylla på halspulsådern med matsmältningsbuffert om det behövs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Encells- och enkärneberedning från luminal enzymatisk matsmältning av mushalspulsåder. (A) Representativa encells- och enkärniga preparat. Skalstänger = 0,25 mm (B) Representativ faskontrast och gelröda bilder av enkärniga preps. Skalstänger = 0,25 mm. (C) Effektiviteten hos enkärnig beredning i den vänstra kolumnen visar antalet enskilda celler i början medan den högra kolumnen visar antalet enskilda kärnor efter bearbetning med kärnisoleringsbuffert i olika steg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Standard QC-mått för scRNAseq- och scATACseq-studien. Fioldiagram visar (A) fördelningen av gener per cell (nFeature RNA), (B) UMI per cell (nCount_RNA), (C) mitokondriella avläsningar per cell (procent mt) för scRNAseq-data. (D och E) visar nukleosombandmönstret för scATACseq-studien. Histogrammet av DNA-fragmentstorlekar uppvisar ett starkt nukleosombandmönster som motsvarar längden på DNA som är lindat runt en enda nukleosom. (F) Normaliserad TSS-anrikningspoäng vid varje position i förhållande till TSS. Spridnings-/fioldiagrammen visar (G) procentfragmentläsningar i topparna, ett mått på sekvenseringsdjup, (H) toppregionfragment som visar antalet fragment som överlappar toppar, (I) TSS-anrikningspoäng, ett förhållande mellan den aggregerade fördelningen av läsningar centrerade på TSS och det som flankerar motsvarande TSS, (J) svartlistningsförhållande, ett förhållande mellan läsningar i svartlistade genomiska platser, och (K) nukleosomsignal, ett förhållande mellan mononukleosomala och nukleosomfria fragment. Förkortningar: scRNAseq = encells RNA-sekvensering; scATACseq = encellsanalys för transposas tillgänglig kromatinsekvensering; QC = kvalitetskontroll; UMI = unik molekylär identifierare; TSS = transkription startplats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Sammansättning av enkärniga lys- och tvättbuffertar. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Encells- och enkärniga kärnor räknas från mushalshinnans luminala matsmältning. Tabellen visar också medelvärden för läsningar/celler och antal gener/celler för scRNAseq-data. För scATACseq-data visas medelvärdesfragment/celler och totala läsningar som erhållits per prov8. Förkortningar: scRNAseq = encells RNA-sekvensering; scATACseq = encellsanalys för transposas tillgänglig kromatinsekvensering; 2D = 2-dagars; 2W = 2-veckors; R/RCA = höger halspulsåder; L/LCA = vänster halspulsåder. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument ger ett detaljerat protokoll för att isolera encellspreparat från musens halspulsåder. Påverkan av d-flöde på endotelcellerna kan studeras noggrant om PCL-operationen utförs korrekt. Det är viktigt att korrekt identifiera grenarna i den gemensamma halspulsådern, såsom den yttre halspulsådern, den inre halspulsådern, occipitalartären och den överlägsna sköldkörtelartären. Validering av flödesmönster genom ultraljud validerar ytterligare den framgångsrika uppkomsten av d-flödesförhållanden . Även om PCL-kirurgi kan utföras på möss oavsett ålder, är den föredragna åldern 10 ± 2 veckor. Äldre möss och möss med hyperkolesterolemisk bakgrund tenderar i allmänhet att ha mer periadventitiellt fett och styvare hud.
Det är viktigt att noggrant dissekera halspulsådern endotelberikade encelliga preparat fria från omgivande vävnad och periadventitiellt fett. Karotidernas lumen måste perfuseras noggrant för att undvika att förorena blodkroppar i encellspreparaten. Felaktig vävnadsidentifiering och märkning kan resultera i hög standardavvikelse. Noggrann planering och tidshantering krävs för detta protokoll. En skicklig kirurg och operatör kan ta 15-20 minuter att utföra en PCL-operation. Offer, karotisisolering och luminal enzymatisk matsmältning från varje mus skulle ta ytterligare 35-40 minuter. Den praktiska bearbetningstiden från endotelcellsspolning till encellig / enkärnig förberedelse är ytterligare 2 timmar. Noggrann planering och lagarbete rekommenderas starkt.
Som med alla experimentella protokoll bör vissa nackdelar och begränsningar beaktas. Det nuvarande protokollet innehåller inte steg för att undvika artefaktisk aktivering av omedelbart tidigt svar under luminal vävnadsdissociation. Det har rapporterats i litteraturen att enzymatisk matsmältning kan leda till stresssignaleringshändelser, såsom inflammation och apoptos. Detta kan åtgärdas genom att införliva lämpliga kontrollgrupper i den experimentella designen. Dessutom bör våta laboratoriemetoder som kan minimera den artefaktiska aktiveringen av omedelbar respons under enzymatisk matsmältning, såsom kallaktiva proteaser, övervägas13,14.
Detta protokoll kan användas för alla musstammar oavsett dess genetiska bakgrund. De endotelberikade preparaten kan dock bäst svara på forskningsfrågor som rör förändringarna i endotel och är därför väl lämpade för EC-specifika knockouts och EC-specifika transgena möss. Denna encellsisoleringsmetod kan anpassas för att utföra encelliga multi-omics-studier och andra flödescytometribaserade analyser såsom Imaging Flow Cytometry. Den luminala matsmältningsmetoden kan användas för nyerhållna musaortor, artärer från stora djur (kaniner och grisar) samt för nyerhållna humana vaskulära explanter. Sammantaget skulle denna metod göra det möjligt för oss att fullt ut förstå blodflödets exakta roll på endotelfunktion och omprogrammering vid en encellsupplösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
HJ är grundaren av FloKines Pharma. Andra författare har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering från National Institutes of Health-bidrag HL119798, HL095070 och HL139757 till HJ. HJ stöds också av Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. Tjänsterna som tillhandahölls av Emory Integrated Genomics Core (EIGC) subventionerades av Emory University School of Medicine och stöddes också delvis av Georgia Clinical and Translational Science Alliance of the National Institutes of Health under tilldelning nr. UL1TR002378. Innehållet ovan är enbart författarnas ansvar och återspeglar inte de officiella åsikterna från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
References
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al.
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
Tags
Biologi Fråga 176 Artärceller Endotelceller encelligt RNAseq encelligt ATACseq ÅderförkalkningErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 06/22/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
