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Summary
우리는 단일 세포 체학 실험을 수행하기 위해 안정하거나 방해받는 흐름 조건에 노출 된 마우스 경동맥의 내강에서 내피 세포와 핵을 분리하는 방법을 제시합니다.
Abstract
죽상 동맥 경화증은 방해받은 혈류 (d- 흐름)에 노출 된 동맥 부위의 염증성 질환입니다. D-flow 는 전사체 및 후성유전체 수준에서 내피의 유전자 발현을 조절하여 전동맥경화 반응을 일으킵니다. 최근에는 마우스 부분 경동맥 결찰(PCL) 모델을 사용하여 단일 세포 분해능에서 전사체 및 염색질 접근성 변화를 결정하기 위해 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq) 및 트랜스포아제 접근 가능한 염색질 시퀀싱을 위한 단일 세포 분석(scATACseq) 연구가 수행되었습니다. 내피 세포 (ECs)는 동맥벽의 전체 세포 집단의 작은 부분을 나타내기 때문에 내강 분해 방법을 사용하여 EC가 풍부한 단일 세포 제제를 얻었습니다. 이 연구를 위해 마우스는 오른쪽 경동맥 (RCA)을 대조군으로 사용하면서 왼쪽 경동맥 (LCA)에서 d- 흐름을 유도하기 위해 PCL 수술을 받았다. 경동맥은 PCL 수술 후 2일 또는 2주 후에 해부되었다. 각 경동맥의 내강을 콜라게나제 소화를 거쳐 내피가 풍부한 단일 세포 또는 단일 핵을 얻었다. 이러한 단일 세포 및 단일 핵 제제는 이후 10x Genomics 미세유체 설정을 사용하여 바코드화되었습니다. 그런 다음 바코드된 단일 세포 및 단일 핵을 고처리량 DNA 시퀀서에서 RNA 준비, 라이브러리 생성 및 시퀀싱에 활용했습니다. 생물정보학 처리 후 scRNAseq 및 scATACseq 데이터 세트는 주로 EC로 구성된 내강 분해에서 다양한 세포 유형을 식별했습니다. 평활근 세포, 섬유 아세포 및 면역 세포도 존재했습니다. 이 EC 농축 방법은 전체 동맥 소화 방법으로는 어려울 수 있는 혈류가 내피에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이 되었습니다. EC 농축 단일 세포 준비 방법은 이러한 유전자에 대한 혈류의 영향이 연구되지 않은 EC- 녹아웃 및 형질 전환 마우스에서 단일 세포 체학 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 중요하게도, 이 기술은 유사한 기계론적 연구를 수행하기 위해 인간 동맥 외식편으로부터 EC가 풍부한 단일 세포를 분리하도록 조정될 수 있다.
Introduction
이 실험실은 이전에 d-flow의 유도가 고지혈증 마우스 1,2에서 빠르고 견고한 죽상 동맥 경화증 발달로 이어진다는 것을 입증했습니다. d-flow-유도 죽상동맥경화증의 새로운 마우스 모델은 부분 경동맥 결찰(PCL) 수술을 사용하여 가능했습니다3. PCL 수술은 결찰된 좌경동맥(LCA)에서 낮고 진동적인 혈류 상태 또는 d-flow를 유도합니다. 대조적으로, 반대쪽 우경동맥(RCA)은 계속해서 안정적인 층류(s-flow)에 직면합니다. 이전에는 내피 세포에 대한 d-flow의 효과를 이해하기 위해 부분 결찰 수술 후 경동맥을 해부하고 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트 기반 용해제(내막 RNA/DNA 플러싱 방법)2,4로 플러싱하여 내피가 풍부한 "풀링된 벌크" RNA 또는 DNA를 제공했습니다. 이러한 풀링된 벌크 RNA 또는 DNA는 전사체 연구 또는 후성유전체 DNA 메틸롬 연구를 위해 각각 4,5,6으로 처리되었습니다. 이 연구는 내피 생물학 및 죽상 동맥 경화증에서 역할이 광범위하게 조사 된 여러 흐름에 민감한 유전자와 microRNA를 발견하는 데 도움이되었습니다 4,6,7.
그러나 내피 농축에도 불구하고 이러한 대량 RNA / DNA 연구는 d- 흐름 유발 죽상 동맥 경화증에서 동맥벽에서 각 세포 유형의 특정 역할을 구별 할 수 없었습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 내피-농축 단일세포(sc) 분리 및 scRNA 및 scATAC 시퀀싱 연구가 수행되었다8. 이를 위해, C57Bl6 마우스는 s-flow가 노출된 RCA를 대조군으로 사용하면서 LCA에서 d-flow를 유도하기 위해 PCL 수술을 실시하였다. PCL 수술 2 일 또는 2 주 후, 마우스를 희생시키고 경동맥을 해부하고 청소했습니다. LCA와 RCA의 내강에는 콜라게나 제가 주입되었고, ECs를 중요한 분획으로 함유하는 내강 콜라게나제 소화물과 다른 동맥 세포가 수집되었습니다. 단일 세포 현탁액(scRNAseq) 또는 단일 핵 현탁액(scATACseq)을 준비하고 10x Genomics 설정을 사용하여 각 세포 또는 핵에 대한 고유 식별자로 바코드화했습니다. RNA를 cDNA 라이브러리 제조를 실시하고 시퀀싱하였다.
scRNAseq 및 scATACseq 데이터 세트는 Cell Ranger Single-Cell Software를 사용하여 처리되었으며 Surat 및 Signac R 패키지 9,10에 의해 추가로 분석되었습니다. 각 세포와 핵은 이러한 분석으로부터 세포 유형을 할당하고 마커 유전자 및 고유 한 유전자 발현 패턴을 기반으로 세포 유형으로 클러스터링되었습니다. scRNAseq 및 scATACseq의 결과는 이러한 단일 세포 제제가 EC가 풍부하고 평활근 세포 (SMC), 섬유 아세포 및 면역 세포를 포함한다는 것을 입증했습니다.
추가 분석에 따르면 내강 소화의 EC 개체군은 매우 발산하고 플라스틱 (8 개의 다른 EC 클러스터)이며 혈류에 반응합니다. 가장 중요한 것은 이러한 결과가 d-flow 가 EC를 죽상 보호 항염증 표현형에서 전염증, 내피에서 중간엽으로의 전이, 내피 줄기/전구 세포 전이, 그리고 가장 놀랍게도 내피에서 면역 세포로의 유사 전이를 포함한 전이동맥 보호 항염증 표현형에서 전이형 동맥경화성 표현형으로 재프로그래밍한다는 것을 입증했습니다. 또한 scATACseq 데이터는 새로운 흐름 의존적 염색질 접근성 변화 및 전사 인자 결합 부위를 게놈 전반에 걸친 방식으로 밝혀 몇 가지 새로운 가설의 기초를 형성합니다. 마우스 경동맥으로부터의 단일 세포 다중 오믹스 연구를 위한 단일 내피 세포를 제조하기 위한 방법론 및 프로토콜은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
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Protocol
아래에 설명 된 모든 동물 절차는 Emory University의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 비 고 콜레스테롤 혈증, 연령 및 성별 일치 C57BL / 6 마우스를 사용하여 성별에 따른 변이를 완화하고 고 콜레스테롤 혈증 상태의 합병증을 상쇄했습니다.
1. 부분 경동맥 결찰 (PCL) 수술
참고: LCA의 부분 경동맥 결찰은 이전에 기술되고 입증된 바와 같이 수행되었다3.
- 마취 기화기를 사용하여 절차 전반에 걸쳐 이소플루란 흡입(유도를 위해 산소에서 5% 이소플루오란, 유지를 위해 그 후 1.5%)으로 마우스를 마취합니다. 수술 중 체온 손실을 방지하기 위해 마우스 앙와위를 델타페이즈 등온 패드에 놓습니다.
- 노출 각막염을 예방하기 위해 안구 연고를 바르고 발가락 핀치 반응이없는 경우 마취 깊이를 확인하십시오.
- 부 프레 노르 핀 0.05 mg / kg을 피하 주사하여 통증을 선제적으로 관리합니다. 베타 딘과 이소프로판올 용액으로 3 번 도포하고 청소하여 제모 된 부위를 소독하십시오. betadine이 중앙에서 시작하여 측면에서 끝나는 수술 부위를 살균하는 마지막 단계인지 확인하십시오.
- 무균 기술을 사용하여 목 부위에 복부 정중선 절개(~1cm)를 하고 무딘 해부로 LCA 분기점을 노출시킵니다.
- 왼쪽 내 경동맥, 외부 경동맥 및 후두 동맥을 6-0 실크 봉합사로 결찰하십시오. 상 갑상선 동맥은 그대로 두십시오.
- 피부를 근사화하고 조직 접착제 및/또는 봉합사로 절개 부위를 닫습니다.
- 마우스를 예열된 회복 케이지(37°C로 유지)로 옮기고 수술 후 저체온증을 방지하기 위해 최대 1시간 동안 깨끗한 수건 위에 놓습니다.
참고: 우리의 경험에 비추어 볼 때, 부 프레 노르 핀 (0.05 mg / kg)의 선제 적 단일 용량은 일반적으로 수술 후 통증 관리에 충분합니다. Buprenorphine의 반복 용량은 동물이 처음 24 시간 후에 고통 스러울 경우 투여 할 수 있습니다. 올바르게 수행되면이 절차와 관련된 사망률이 없으며 마우스에 대한 수술 후 스트레스가 최소화됩니다. 마우스는 각각의 케이지로 돌아가 수술 후 매일 모니터링됩니다. - 관류 설정을 준비합니다.
- IV 백에 10 U / mL 헤파린을 함유 한 0.9 % NaCl (생리 식염수)을 사용하십시오. IV 백을 지면에서 244-274cm(8-9피트) 또는 해부 보드보다 약 122-152cm(4-5피트) 높은 곳에 걸습니다. 나비 바늘을 식염수 라인 끝에 부착하고 IV 라인에서 기포를 씻어냅니다.
2. 희생 후 경동맥 분리
- 마우스를 기관 IACUC 프로토콜에 따른CO2 흡입으로 희생시켰다.
- 마우스 피부에 70 % 에탄올을 뿌리고 흡착제 종이 타월이 들어있는 해부 보드의 앙와위 위치에 놓습니다. 접착 테이프 또는 21G 바늘을 사용하여 해부 보드의 흡착제 타월에 마우스 발을 고정합니다.
- 한 쌍의 멸균 가위를 사용하여 복부에서 시작하여 흉부 상단까지 마우스의 피부를 제거하십시오.
- 한 쌍의 가위를 사용하여 무딘 해부로 흉곽 아래의 복벽을 엽니 다.
- 가위를 사용하여 횡격막의 길이를 따라 조심스럽게 절개하고 흉골을 들어 올릴 수있을 때까지 흉부 양쪽의 갈비뼈를 통해 계속하십시오. 한 쌍의 집게로 흉골을 부드럽게 들어 올리십시오. 그런 다음 흉곽을 제거하여 심장을 노출시킵니다.
- 흉선과 심장 위의 결합 조직을 조심스럽게 제거하여 주요 혈관을 시각화하십시오.
- 혈액이 닫힌 순환에서 빠져 나갈 수 있도록 가위로 대정맥을 절단하십시오.
- 심장의 정점을 통해 IV 라인에 연결된 21G 나비 바늘을 좌심실에 삽입하고 실온에서 일반 식염수로 2-3 분 동안 역행 관류를 허용합니다. 식염수 백을지면에서 8-9 피트 높이로 유지하여 일반 식염수의 일정한 유속이 유지되도록하십시오.
알림: 폐와 간이 창백해져 최적의 관류를 나타냅니다. 각 마우스에는 약 20mL의 관류 완충액이 사용됩니다. - 목 부위에서 피부를 제거하고 모든 지방, 근육 및 결합 조직을 제거하여 경동맥을 노출시킵니다 (그림 1A).
알림: 나머지 절차는 해부 현미경으로 수행됩니다. - 시야를 조정하여 결찰 부위를 찾습니다. 10mm 미세 해부 가위를 사용하여 LCA의 결찰 부위 아래에 작은 절개를하여 관류를 허용합니다.
- 좌심실을 통해 추가로 1분 동안 다시 관류하고 LCA가 잘 관류되고 눈에 보이는 혈액 흔적이 없는지 확인합니다.
- 가는 끝 집게와 작은 스프링 가위를 사용하여 경동맥이 몸에 붙어있는 동안 경동맥을 둘러싼 외막 주위 조직을 조심스럽게 제거하십시오.
알림: 이 세척 단계에서 경동맥을 짜내거나 늘리지 않도록 매우 주의하십시오., 생존할 수 없는 세포의 수를 증가시킬 수 있으므로. 올바르게 수행되면 최종 세포 현탁액에서 세포 생존율은 일반적으로 >93%입니다.
3. 생쥐 경동맥에서 내피 세포가 풍부한 단일 세포 분리
참고: 아래에 설명된 시약은 미리 준비하여 사용할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다: 표 1에 나열된 시약과 함께 1x 및 0.1x 단일 핵 용해 완충액; 단일핵 세척 완충액과 표 1에 열거된 시약; 단일 핵 핵 버퍼 제조법과 표 1에 나열된 시약. 이러한 완충액의 작업 재고는 제조업체의 프로토콜에 따라 준비되어야 합니다. 소화 완충액 조성 : 0.5 % 태아 소 혈청 (FBS) 함유 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 콜라게나제 II 유형 600 U / mL 및 DNase I 60 U / mL.
- 경동맥이 아직 붙어있는 동안 경동맥 외부를 일반 식염수로 씻어 혈액의 흔적을 씻어냅니다.
- 29G 바늘이 장착 된 인슐린 주사기를 사용하여 ~ 50μL의 소화 완충액을 왼쪽 경동맥 말단부 내강에 주입합니다. 소화 완충액이 경동맥을 채우기 시작하면 경동맥의 근위 끝을 마이크로 클립으로 고정합니다(그림 1B). 15-20 μL의 분해 완충액을 루멘에 추가로 도입하고 분해 완충액의 방출을 피하기 위해 말단부를 자릅니다.
- 마우스에서 경동맥을 조심스럽게 이식하고(그림 1B, C) 따뜻한 (37°C에서) Hepes 완충 식염수가 포함된 35mm 접시에 넣습니다.
알림: 두 cl이 모두 단단히 배치되었는지 확인하십시오.amps. 클램프가 느슨해지면 소화 용액이 루멘 밖으로 누출되어 얻은 세포 수에 영향을 줄 수 있습니다. 이 경우 경동맥의 열린 끝에서 29G 바늘이 장착된 인슐린 주사기를 사용하여 효소 용액을 추가하고 클램프를 다시 고정합니다(그림 1D). 효소 완충액이 다시 누출되면 이식 과정에서 경동맥이 절단 될 가능성이 있습니다. 이 경우 경동맥을 폐기하고 샘플에서 연구를 제외하십시오. 경동맥을 반복적으로 거칠게 취급하면 세포 생존율과 단일 세포 제제의 품질이 저하됩니다. 왼쪽 및 오른쪽 경동맥을 식별하고 올바르게 표시하도록주의하십시오. - 이식된 경동맥을 간헐적 흔들림과 함께 37°C에서 45분 동안 배양한다.
4. 경동맥 세척
- 내강 효소 소화를 완료 한 후 35mm 접시에서 클램프와 함께 경동맥을 제거하십시오. 소화 완충액이 누출되지 않도록주의하면서 각 클램프를 조심스럽게 제거하십시오.
- 1.5mL 미세 원심 분리기 튜브 위에 미세한 집게로 경동맥의 한쪽 끝을 부드럽게 잡습니다. 다른 손으로 100μL의 따뜻한 분해 완충액(37°C)이 들어 있는 인슐린 주사기가 장착된 29G 바늘을 루멘에 삽입합니다(그림 1D).
- 경동맥의 내강을 미세 원심 분리기 튜브로 빠르게 플러시하십시오. 1.5mL 튜브에 0.3mL의 FBS를 첨가하여 효소 반응을 차단합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
참고: 플러싱에는 내강 효소 소화의 세포가 포함되어 있습니다. FBS를 추가하고 온도를 낮추면 효소 소화 과정이 중지됩니다. 제제의 세포 수가 많고 파편이나 지방 조직을 포함하는 경우 원치 않는 조직 파편을 걸러내기 위해 50 또는 70μm 세포 여과기를 사용하는 것이 좋습니다. 단일 세포 수를 늘리려면 여러 경동맥을 플러시하는 것이 좋습니다. 여기에서 최소 5,000 개의 세포를 얻기 위해 10-12 개의 경동맥을 플러싱하고 하나의 샘플로 풀링했습니다. - 고정 각도 로터가 장착된 원심분리기를 사용하여 4°C에서 5 분 동안 500×g에서 셀을 원심분리합니다( 재료 표 참조).
- 상청액을 버리고 세포 해리 시약이 들어 있는 소화 완충액( 재료 표 참조)에 세포 펠릿을 37°C에서 5분 동안 재현탁시켜 모든 세포를 단일 세포로 분리합니다.
알림: 준비물의 셀 수가 적 으면 원심 분리기 속도를 최대 2,000-3,000 ×g까지 높여 셀을 스핀 다운하십시오. 또한 0.5mL 원심분리 튜브를 사용하면 튜브 바닥에서 세포 펠릿을 더 잘 시각화할 수 있습니다. - 0.5mL 튜브에 0.15mL의 FBS를 첨가하여 효소 반응을 차단합니다.
- 단세포 현탁액을 500 ×g에서 4°C에서 5 분 동안 원 심분리하고, 단계 4.4에서와 같이 고정각 로터가 장착된 원심분리기를 사용한다.
- 상청액을 버리고 세포를 0.2mL 마이크로 원심분리 튜브의 PBS 중 100μL의 얼음처럼 차가운 1% 소 혈청 알부민(BSA) 용액에 재현탁합니다.
참고: 0.2mL 원심분리 튜브를 사용하면 튜브 바닥에 있는 단일 셀 펠릿의 시각화가 향상됩니다.
5. 단일 세포 및 단일 핵 분석
- scRNAseq에 대한 단일 세포 제제를 다시 일시 중단하고 제출합니다.
- 단일 셀 펠릿을 0.2mL 튜브의 PBS에 얼음처럼 차가운 1% BSA 100μL로 재현탁합니다.
- 단일 세포 캡슐화를 위해 세포를 재현탁시킨 후 즉시 미세 유체 기반 단일 세포 분할 및 바코드 시스템을 사용하여 단일 세포 캡슐화 및 바코드를 진행합니다 ( 재료 표 참조).
- 샘플을 유전체학 코어에 제출하기 전에 단일 세포 제제를 세고 검사하십시오. 세포 응집체가 없는지 확인하십시오.
참고: 단일 셀의 응집은 BSA 양을 최대 2%까지 증가시켜 더욱 최소화할 수 있습니다.
- scATACseq에 대한 단일 세포 제제를 다시 중단하고 제출하십시오.
- 세포 펠렛을 빙냉 1x PBS 중 0.04% BSA 중 100μL에 재현탁하고 4°C에서 500× g에서 단일 세포 현탁액을 원심분리합니다.
- 단일 세포 현탁액을 얼음처럼 차가운 0.1x 용해 완충액(표 1)으로 용해하고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
- 용해물을 P-20 피펫으로 10회 혼합하고 추가로 10분 동안 배양합니다.
- 용해된 세포에 500μL의 냉장 세척 완충액(표 1)을 추가하고 피펫을 사용하여 5회 혼합합니다.
알림: 70μm 세포 여과기를 사용하여 세포 현탁액에서 파편을 걸러내고 2mL 튜브로 옮깁니다. - 용해물을 500 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 핵-펠렛을 희석된 핵 완충액(150 μL)에 재현탁시킨다( 재료 표 및 표 1 참조). 혈구계11을 사용하여 단일 핵 제제를 계수하고 검사합니다.
- 단일 핵 전이, 핵 분할, 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위해 단일 핵 샘플을 Genomics Core에 제출합니다.
참고: 초기 세포 수가 낮으면 핵을 따라 파편을 관찰하는 것이 일반적입니다. 따라서 높은 셀 번호로 시작하는 것이 좋습니다.
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Representative Results
부분 경동맥 결찰 수술은 44 마리의 마우스에서 수행되었으며, 부분 결찰 수술 후 하루 동안 초음파 검사를 수행하여 LCA에서 d- 흐름 의 시작을 검증했습니다. 성공적인 부분 결찰 수술은 LCA3에서 혈류 속도를 감소시키고 혈류 (방해 된 흐름)를 역전시킵니다. 경동맥은 결찰 후 2일 또는 2주에 해부되었습니다. 각 경동맥의 내강을 콜라게나제 소화를 실시하고, 내피가 풍부한 단일 세포 또는 단일 핵 현탁액을 제조하였다. 세포 수율을 증가시키기 위해 10개의 RCA 및 LCA로부터 단일 세포 현탁액을 풀링하였다. 준비된 세포/핵은 이후에 바코드화되고 시퀀싱되었습니다. sc-RNAseq 연구의 경우, 수득 된 단일 세포의 수는 ~ 9,700이었다. 4개의 샘플로부터의 세포의 분포는 표 2에 나타내었다.
마찬가지로, scATACseq 연구를 위해, 단일 세포를 제조 된 12 개의 RCA 및 LCA로부터 분리하고, 트랜스 포즈 제 처리를 받고, 바코드화하고, 시퀀싱했다. 시퀀싱은 1,291 (2 일 RCA [2D-R]), 5,351 (2 일 LCA [2D-L]), 5,826 (2 주 RCA [2W-R]) 및 5,856 (2 주 LCA [2W-L]) (표 2)에서 풀링 된 18,324 개의 단일 핵에 대해 수행되었다. 명시야 현미경 및 위상차 현미경으로 시각화된 대표적인 단일 세포 및 단일 핵 제제가 그림 2A,B에 나와 있습니다. 단일 세포 현탁액으로부터 단일핵 제제의 효율은 도 2C에 도시되어 있다.
2D (RCA 및 LCA) 및 2W (RCA 및 LCA) 샘플의 핵 (각각 ~ 7,000 개)을 제조업체의 프로토콜에 따라 37 ° C에서 60 분 동안 전치 믹스 (Tn5 트랜스포아제 효소 및 완충액) 재료 표 참조)와 함께 배양했습니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 중성 세제 상태는 태깅 중에 핵을 손상시키지 않는 데 도움이 되었습니다. 그런 다음 바코드 시약, 환원제 B 및 바코드 효소로 구성된 마스터 믹스를 미세유체 세포/핵 캡슐화 플랫폼에 로드하여 제조업체의 지침에 따라 바코드가 있는 단일 핵 겔 에멀젼을 제조했습니다.
시퀀싱 후, Cell Ranger 단일 셀 소프트웨어 제품군은 디멀티플렉싱, 바코드 처리 정렬 및 원시 scATACseq 및 scRNaseq 프로파일의 초기 클러스터링에 사용되었습니다. scRNAseq 연구의 경우, 세포당 유전자의 분포, 세포당 고유 분자 식별자(UMI), 세포당 미토콘드리아 판독 및 시퀀싱 포화 정보가 도 3A-C에 도시되어 있다. 마찬가지로, scATACseq 연구의 경우, 삽입 크기 분포(뉴클레오솜 밴딩 패턴) 및 정규화된 TSS 농축 점수를 보여주는 품질 관리 메트릭이 그림 3D-F에 나와 있습니다. 추가적으로, 피크에서의 단편 판독 백분율, 피크 영역 단편, TSS 농축 점수, 블랙리스트 게놈 부위에서의 판독의 비율, 및 뉴클레오솜 신호 비율을 도 3G-K에 나타내었다.
내피 농축은 이 방법을 전체 경동맥의 효소적 소화의 방법과 비교하여 정량화하였다12. 완전한 경동맥 소화로부터의 내피 세포 수는 수득 된 총 세포의 3-5 % 인 반면,이 방법은 내피 세포의 농축을 >50 % 8로 허용했다. 유사하게, 전체 마우스 대동맥을 사용한 또 다른 단일 세포 연구에 따르면 내피 분획은 전체 세포 수의 <7%였습니다. 심층적인 단일 세포 RNAseq 및 단일 세포 ATACseq 분석을 위해 독자는 8을 참조해야 합니다.
그림 1: 단세포 준비를 위한 경동맥 분리. (A) 생쥐의 경동맥의 해부학적 보기. 빨간색 화살표와 삽입물은 외막 주위 지방을 제거한 후 격리 된 왼쪽 경동맥을 보여줍니다. 경동맥 해부학 및 결찰의 개략도는 Nam et al3의 그림 1을 참조하십시오 (B) 이미지는 경동맥을 소화 완충액으로 채운 후 마이크로 클립의 위치를 보여줍니다. (c) 소화 완충액을 함유하는 이식된 경동맥. 스케일 : 검은 선 사이의 거리 = 1mm. (D) 마우스 경동맥 내강에있는 29G 바늘. 이 단계는 필요한 경우 경동맥에 소화 완충액을 보충하는 데 도움이 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마우스 경동맥의 내강 효소 소화를 통한 단일 세포 및 단일 핵 준비. (A) 대표적인 단일 세포 및 단일 핵 제제. 스케일 바 = 0.25 mm (B) 단일 핵 준비의 대표적인 위상차 및 Gel-Red 이미지. 스케일 바 = 0.25mm. (C) 단일 핵 준비의 효율성 왼쪽 열은 시작 부분의 단일 세포 수를 표시하고 오른쪽 열은 다른 단계의 핵 분리 완충액으로 처리 한 후 단일 핵의 수를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: scRNAseq 및 scATACseq 연구를 위한 표준 QC 메트릭. 바이올린 플롯은 scRNAseq 데이터에 대한 (A) 세포당 유전자 분포(nFeature RNA), (B) 세포당 UMI(nCount_RNA), (C) 세포당 미토콘드리아 판독값(mt 백분율)을 보여줍니다. (D 및 E)는 scATACseq 연구를 위한 뉴클레오솜 밴딩 패턴을 나타낸다. DNA 단편 크기의 히스토그램은 단일 뉴클레오솜 주위를 감싸는 DNA의 길이에 상응하는 강력한 뉴클레오솜 밴딩 패턴을 나타낸다. (F) TSS에 대한 각 위치에서의 정규화된 TSS 농축 점수. 산란/바이올린 플롯은 (G) 피크의 단편 판독 비율, 시퀀싱 깊이의 척도, (H) 피크와 겹치는 단편의 수를 보여주는 피크 영역 단편, (I) TSS 농축 점수, TSS를 중심으로 한 판독의 집계 분포와 해당 TSS 측면의 읽기 분포 간의 비율, (J) 블랙리스트 비율, 블랙리스트 게놈 사이트의 판독 비율, 및 (K) 뉴클레오솜 신호, 단핵소체 대 뉴클레오솜이 없는 단편의 비율. 약어: scRNAseq = 단일 세포 RNA 시퀀싱; scATACseq = 트랜스포아제 접근 가능한 염색질 시퀀싱을 위한 단일 세포 분석; QC = 품질 관리; UMI = 고유 분자 식별자; TSS = 전사 시작 사이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 단핵 용해 및 세척 완충액의 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 마우스 경동맥 내강 소화로부터의 단일 세포 및 단일 핵 수. 이 표는 또한 scRNAseq 데이터에 대한 평균 판독/세포 및 유전자/세포 수를 보여줍니다. scATACseq 데이터의 경우 샘플 당 평균 단편 / 셀 및 총 판독값이 8로 표시됩니다. 약어: scRNAseq = 단일 세포 RNA 시퀀싱; scATACseq = 트랜스포아제 접근 가능한 염색질 시퀀싱을 위한 단일 세포 분석; 2D = 2 일; 2W = 2주; R / RCA = 오른쪽 경동맥; L / LCA = 왼쪽 경동맥. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문은 마우스 경동맥에서 단일 세포 제제를 분리하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. PCL 수술이 올바르게 수행되면 내피 세포에 대한 d-flow 의 영향을 정확하게 연구 할 수 있습니다. 외경동맥, 내경동맥, 후두동맥 및 상갑상선동맥과 같은 총경동맥의 가지를 정확하게 식별하는 것이 중요합니다. 초음파 검사에 의한 유동 패턴의 검증은 d-flow 조건의 성공적인 시작을 더욱 검증합니다. PCL 수술은 연령에 관계없이 마우스에서 수행 할 수 있지만 선호되는 연령은 10 ± 2 주입니다. 나이가 많은 생쥐와 고 콜레스테롤 혈증 배경을 가진 생쥐는 일반적으로 외막 주위 지방이 더 많고 피부가 뻣뻣한 경향이 있습니다.
경동맥 내피가 풍부한 단일 세포 제제를 주변 조직과 외막 주위 지방이없는 조심스럽게 해부하는 것이 필수적입니다. 경동맥의 내강은 단일 세포 제제에서 혈액 세포를 오염시키지 않도록 철저히 관류되어야합니다. 부적절한 조직 식별 및 라벨링은 높은 표준 편차를 초래할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 신중한 계획과 시간 관리가 필요합니다. 숙련 된 외과 의사와 수술자는 PCL 수술을 한 번 수행하는 데 15-20 분이 걸릴 수 있습니다. 각 마우스의 희생, 경동맥 분리 및 내강 효소 소화에는 추가로 35-40분이 소요됩니다. 내피 세포 플러싱에서 단일 세포/단일 핵 준비까지의 실습 처리 시간은 추가로 2시간입니다. 세심한 계획과 팀워크를 적극 권장합니다.
모든 실험 프로토콜과 마찬가지로 몇 가지 단점과 제한 사항을 고려해야 합니다. 현재 프로토콜은 내강 조직 해리 동안 즉각적인 조기 반응의 인공물 활성화를 피하기 위한 단계를 통합하지 않습니다. 효소 소화가 염증 및 세포 사멸과 같은 스트레스 신호 전달 사건을 유발할 수 있다는 것이 문헌에보고되었습니다. 이것은 실험 설계에 적절한 대조군을 통합함으로써 해결할 수 있습니다. 또한, 저온 활성 프로테아제와 같은 효소 소화 중 즉각적인 반응의 인공물 활성화를 최소화 할 수있는 습식 실험실 방법을 고려해야합니다13,14.
이 프로토콜은 유전 적 배경에 관계없이 모든 마우스 균주에 사용할 수 있습니다. 그러나 내피가 풍부한 제제는 내피의 변화와 관련된 연구 질문에 가장 잘 답할 수 있으므로 EC 특이적 녹아웃 및 EC 특이적 형질전환 마우스에 매우 적합합니다. 이 단일 세포 분리 방법은 단일 세포 다중 오믹스 연구 및 이미징 유세포분석과 같은 기타 유세포분석 기반 분석을 수행하는 데 적용할 수 있습니다. 내강 소화 접근법은 새로 얻은 마우스 대동맥, 큰 동물 (토끼 및 돼지)의 동맥 및 새로 얻은 인간 혈관 외식편에 사용될 수 있습니다. 종합적으로,이 방법을 통해 우리는 내피 기능에 대한 혈류의 정확한 역할과 단일 세포 분해능에서의 재 프로그래밍을 완전히 이해할 수 있습니다.
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Disclosures
HJ는 FloKines Pharma의 설립자입니다. 다른 저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 국립 보건원 보조금 HL119798, HL095070 및 HL139757에서 HJ에 대한 자금으로 지원되었습니다. HJ는 또한 Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship의 지원을 받고 있습니다. Emory Integrated Genomics Core (EIGC)가 제공 한 서비스는 Emory University School of Medicine의 보조금을 받았으며 National Institutes of Health의 Georgia Clinical and Translational Science Alliance에서도 부분적으로 지원되었습니다. UL1TR002378. 위에 제공된 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 보건원의 공식 견해를 반영하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
References
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al.
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
Tags
생물학 이슈 176 동맥 세포 내피 세포 단일 세포 RNAseq 단일 세포 ATACseq 죽상 동맥 경화증Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 06/22/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
