ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Представлен метод выделения эндотелиальных клеток и ядер из просвета сонных артерий мышей, подвергающихся воздействию стабильных или нарушенных условий течения для проведения экспериментов с одноклеточной омикой.
Abstract
Атеросклероз – это воспалительное заболевание артериальных областей, подверженных нарушенному кровотоку (d-потоку). D-поток регулирует экспрессию генов в эндотелии на транскриптомном и эпигеномном уровнях, что приводит к проатерогенным реакциям. Недавно были проведены исследования секвенирования одноклеточной РНК (scRNAseq) и одноклеточного анализа для транспозазного секвенирования хроматина (scATACseq) для определения изменений доступности транскриптома и хроматина при одноклеточном разрешении с использованием модели частичного лигирования сонной артерии мыши (PCL). Поскольку эндотелиальные клетки (ЭК) представляют собой незначительную долю от общего количества клеточных популяций в стенке артерии, для получения одноклеточных препаратов, обогащенных ЭК, был использован метод люминального сбраживания. Для этого исследования мышей подвергали операции PCL, чтобы индуцировать d-поток в левой сонной артерии (LCA) при использовании правой сонной артерии (RCA) в качестве контроля. Сонные артерии были рассечены через два дня или две недели после операции PCL. Просвет каждой сонной артерии подвергали перевариванию коллагеназы, и получали обогащенные эндотелием одиночные клетки или одиночные ядра. Эти одноклеточные и одноядерные препараты были впоследствии штрих-кодированы с использованием 10-кратной микрофлюидной установки Genomics. Штрих-кодированные одиночные клетки и одноядерные ядра затем использовались для подготовки РНК, генерации библиотеки и секвенирования на высокопроизводительном секвенаторе ДНК. После обработки биоинформатики наборы данных scRNAseq и scATACseq идентифицировали различные типы клеток из просветного пищеварения, в основном состоящие из ЭК. Гладкомышечные клетки, фибробласты и иммунные клетки также присутствовали. Этот метод обогащения EC помог понять влияние кровотока на эндотелий, что могло быть затруднено при методе полного переваривания артерий. Метод одноклеточного препарата, обогащенный ЕС, может быть использован для проведения одноклеточных омических исследований у EC-нокаутов и трансгенных мышей, где влияние кровотока на эти гены не изучалось. Важно отметить, что этот метод может быть адаптирован для выделения обогащенных ЕС одиночных клеток из эксплантов артерий человека для выполнения аналогичных механистических исследований.
Introduction
Эта лаборатория ранее продемонстрировала, что индукция d-потока приводит к быстрому и бурному развитию атеросклероза у гиперлипидемических мышей 1,2. Новая мышиная модель d-потока-индуцированного атеросклероза была возможна с использованием операции частичного перевязки сонной артерии (PCL) 3. Хирургия PCL вызывает низкое и колебательное состояние кровотока или d-потока в перевязанной левой сонной артерии (LCA). Напротив, контралатеральная правая сонная артерия (RCA) продолжает сталкиваться со стабильным ламинарным потоком (s-flow). Ранее, чтобы понять влияние d-потока на эндотелиальные клетки, сонные артерии были рассечены после операции частичной перевязки и промыты фенолом и гуанидином изотиоцианатным агентом (метод промывки люминальной РНК / ДНК)2,4, который обеспечивал обогащенные эндотелием «объединенные объемные» РНК или ДНК. Эти объединенные объемные РНК или ДНК затем обрабатывались для транскриптомных исследований или эпигеномных исследований метилома ДНК, соответственно 4,5,6. Эти исследования помогли обнаружить множественные чувствительные к потоку гены и микроРНК, роль которых в эндотелиальной биологии и атеросклерозе была широко исследована 4,6,7.
Однако, несмотря на обогащение эндотелия, эти объемные исследования РНК/ДНК не смогли различить конкретную роль каждого типа клеток в стенке артерии при d-поток-индуцированном атеросклерозе. Для преодоления этогоограничения были проведены исследования обогащенной эндотелиалом одноклеточной (sc) изоляции и секвенирования scRNA и scATAC. Для этого мышей C57Bl6 подвергали операции PCL, чтобы индуцировать d-поток в LCA при использовании RCA, подвергающейся воздействию s-потока, в качестве контроля. Через два дня или две недели после операции PCL мышей приносили в жертву, а сонные артерии рассекали и очищали. Просвет как LCA, так и RCA был наполнен коллагеназой, а люминальные коллагеназы перевариваются, содержащие EC в виде значительной фракции и другие артериальные клетки. Одноклеточную суспензию (scRNAseq) или одноядерную суспензию (scATACseq) готовили и штрих-кодировали уникальными идентификаторами для каждой клетки или ядра с использованием 10-кратной установки геномики. РНК подвергали подготовке и секвенированию библиотеки кДНК.
Наборы данных scRNAseq и scATACseq были обработаны с использованием программного обеспечения Cell Ranger Single-Cell и дополнительно проанализированы пакетами Seurat и Signac R 9,10. Каждой клетке и ядру был присвоен тип клеток из этих анализов и сгруппирован в тип клеток на основе маркерных генов и уникальных паттернов экспрессии генов. Результаты scRNAseq и scATACseq показали, что эти одноклеточные препараты обогащены ЭК, а также содержат гладкомышечные клетки (SMC), фибробласты и иммунные клетки.
Дальнейший анализ показал, что популяция ЕС в просветном пищеварении сильно расходится и пластична (8 различных кластеров ЕС) и реагирует на кровоток. Самое главное, что эти результаты показали, что d-flow перепрограммирует EC от атеро-защищенного противовоспалительного фенотипа к проатерогенным фенотипам, включая провоспалительный, эндотелиальный переход в мезенхимальный переход, эндотелиальный стволовый / предшественник клеточный переход и, что самое удивительное, эндотелиальный клеточный переход. Кроме того, данные scATACseq показывают новые изменения доступности хроматина, зависящие от потока, и сайты связывания транскрипционного фактора в масштабах всего генома, которые составляют основу нескольких новых гипотез. Методология и протокол подготовки одиночных эндотелиальных клеток для одноклеточных мультиомических исследований из сонных артерий мышей подробно описаны ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных, описанные ниже, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Эмори. Негиперхолестеринемические, соответствующие возрасту и полу мыши C57BL/6 использовались для смягчения половых вариаций и компенсации любых осложнений гиперхолестеринемических состояний.
1. Частичная перевязка сонной артерии (PCL)
ПРИМЕЧАНИЕ: Частичное перевязывание Сонной артерии LCA проводили, как описано ранее и продемонстрировано3.
- Обезболивать мышь путем вдыхания изофлурана (5% изофторана в кислороде для индукции и 1,5% после этого для поддержания) на протяжении всей процедуры с использованием анестетика испарителя. Поместите мышь лежа на изотермической прокладке Deltaphase, чтобы предотвратить потерю тепла тела во время операции.
- Нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить экспозиционный кератит, и подтвердите глубину анестезии отсутствием реакции на защемление пальцев ног.
- Вводят бупренорфин 0,05 мг/кг подкожно для упреждающего лечения боли. Продезинфицируйте эпилированную область путем нанесения и очистки раствором бетадина и изопропанола три раза. Убедитесь, что бетадин является последним шагом для стерилизации области операции, начиная от центра и заканчивая по бокам.
- Используя асептические методы, сделайте вентральный разрез средней линии (~ 1 см) в области шеи и обнажите точку ветви LCA тупым рассечением.
- Облизывание левой внутренней сонной, наружной сонной и затылочной артерий 6-0 шелковым швом; оставьте верхнюю щитовидную артерию нетронутой.
- Приблизитесь к коже и закройте разрез тканевым клеем и/или швами.
- Перенесите мышь в предварительно нагретую восстановительную клетку (поддерживаемую при 37 °C) и поместите ее на чистое полотенце на срок до 1 ч, чтобы избежать послеоперационного переохлаждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, упреждающей однократной дозы бупренорфина (0,05 мг/кг) обычно достаточно для лечения боли после операции. Повторная доза Бупренорфина может быть введена, если животное находится в бедственном положении после первых 24 часов. При правильном выполнении нет смертности, связанной с этой процедурой, а послеоперационный стресс для мыши минимален. Мышей возвращают в соответствующие клетки и ежедневно контролируют после операции. - Подготовьте установку перфузии.
- Используйте 0,9% NaCl (обычный физиологический раствор), содержащий 10 Ед/мл гепарина в внутривенном пакете. Зацепите iv мешок на 244-274 см (8-9 футов) от земли или примерно на 122-152 см (4-5 футов) выше, чем расслоение. Прикрепите иглу бабочки к концу солевой линии и смывайте любые пузырьки воздуха из линии IV.
2. Изоляция сонных артерий после жертвоприношения
- Приносите в жертву мышей путем вдыханияCO2 в соответствии с институциональным протоколом IACUC.
- Распылите 70% этанола на кожу мыши и поместите его в лежачее положение на рассечении, содержащем адсорбирующие бумажные полотенца. Прикрепите лапы мыши к адсорбирующим полотенцам на рассеченной доске с помощью клейкой ленты или иглы 21 g.
- Используя пару стерильных ножниц, удалите кожу мыши, начиная с живота и вплоть до верхней части грудной клетки.
- Используйте ножницы, чтобы открыть брюшную стенку ниже грудной клетки тупым рассечением.
- Используя ножницы, осторожно сделайте разрез по длине диафрагмы и продолжайте через ребра с обеих сторон грудной клетки до тех пор, пока грудина не будет поднята. Осторожно отнимите грудину парой щипцов; после этого снимите грудную клетку, чтобы обнажить сердце.
- Осторожно удалите тимус и любую соединительную ткань над сердцем, чтобы визуализировать основные сосуды.
- Разрежьте полую вену ножницами, чтобы кровь вышла из замкнутого кровообращения.
- Вставьте иглу бабочки весом 21 г, соединенную с линией IV через верхушку сердца, в левый желудочек и допустите ретроградную перфузию в течение 2-3 мин с нормальным физиологическим раствором при комнатной температуре. Убедитесь, что постоянный расход нормального физиологического раствора поддерживается, сохраняя солевой мешок на высоте 8-9 футов от земли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Легкие и печень становятся бледными, что указывает на оптимальную перфузию. Приблизительно 20 мл перфузионного буфера используется для каждой мыши. - Удалите кожу из области шеи и удалите весь жир, мышцы и соединительные ткани, чтобы обнажить сонные артерии (рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Остальная часть процедуры проводится под рассекающим микроскопом. - Настройте поле зрения, чтобы найти места перевязки. Используя 10-миллиметровые ножницы для микродиссекции, сделайте небольшой разрез ниже места перевязки в LCA, чтобы обеспечить перфузию.
- Снова перфьюируйте в течение дополнительного 1 мина через левый желудочек и убедитесь, что LCA хорошо перфузирован и свободен от каких-либо видимых следов крови.
- Используйте тонкие щипцы и небольшие пружинные ножницы, чтобы аккуратно удалить периадвенциальные ткани, окружающие сонные артерии, в то время как сонная артерия прикреплена к телу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте предельно осторожны, чтобы не сжимать и не растягивать сонные артерии во время этого этапа очистки, так как это может увеличить количество нежизнеспособных клеток. При правильном выполнении жизнеспособность клеток в конечной клеточной суспензии обычно составляет >93%.
3. Обогащенная эндотелиальными клетками одноклеточная изоляция из каротид мышей
ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты, описанные ниже, могут быть приготовлены заранее и храниться при 4°C до использования: 1x и 0,1x одноядерные лизисные буферы с реагентами, перечисленными в таблице 1; одноядерный промывочный буфер с реагентами, перечисленными в таблице 1; рецепт одноядерного буфера ядер с реагентами, перечисленными в таблице 1. Рабочие запасы этих буферов должны быть подготовлены в соответствии с протоколом завода-изготовителя. Буферный состав для пищеварения: коллагеназа типа II 600 Ед/мл и ДНКаза I 60 Ед/мл в 0,5% фетальной бычьей сыворотке (FBS), содержащей фосфат-буферный физиологический раствор (PBS).
- В то время как сонные артерии все еще прикреплены, промывайте внешнюю часть сонных артерий нормальным физиологическим раствором, чтобы смыть любые следы крови.
- Используя инсулиновый шприц, оснащенный иглой 29 г, введите ~ 50 мкл буфера пищеварения в просвет дистального конца левой сонной артерии. Когда буфер пищеварения начнет заполнять сонную артерию, зажмите проксимальный конец сонной артерии микрозажимом (рисунок 1B). Введите дополнительные 15-20 мкл буфера пищеварения в просвет и обрежьте дистальный конец, чтобы избежать высвобождения буфера пищеварения.
- Осторожно эксплантируют сонные артерии у мыши (рисунок 1B,C) и помещают их в 35-миллиметровые чашки, содержащие теплый (при 37 °C) буферизованный солевым раствором.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что оба зажима надежно размещены. Если зажим становится рыхлым, раствор для пищеварения может вытекать из просвета и влиять на полученное количество клеток. Если это произойдет, добавьте дополнительный ферментативный раствор с помощью инсулинового шприца, снабженного иглой 29 Г от открытого конца сонной артерии, и снова закрепите зажим (рисунок 1D). Если ферментный буферный раствор снова протекает, вполне вероятно, что каротид разрывается во время процесса эксплантации. В этом случае отбросьте сонную артерию и исключите образец из исследования. Повторное грубое обращение с сонной артерией снизит жизнеспособность клеток и качество одноклеточной подготовки. Позаботьтесь о том, чтобы идентифицировать и правильно маркировать левую и правую сонные артерии. - Инкубировать эксплантированные сонные артерии в течение 45 мин при 37 °C с прерывистым раскачиванием.
4. Промывка сонных артерий
- После завершения просветного ферментативного пищеварения удалите сонную артерию вместе с зажимами из 35-миллиметровой чашки. Осторожно снимите каждый зажим, следя за тем, чтобы буфер пищеварения не протекал.
- Осторожно удерживайте один конец сонной артерии тонкими щипцами поверх трубки микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Другой рукой вставьте в просвет иглу весом 29 г, оснащенную инсулиновым шприцем, содержащим 100 мкл теплого буфера пищеварения (37 °C) (рисунок 1D).
- Быстро смывают просвет сонной артерии в трубку микроцентрифуги. Блокируют ферментативную реакцию, добавляя 0,3 мл FBS в пробирку объемом 1,5 мл. Поместите трубку на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка содержит клетки из просветного ферментативного пищеварения. Добавление FBS и снижение температуры останавливает процесс ферментативного пищеварения. Если количество клеток в препарате велико и содержит мусор или жировую ткань, настоятельно рекомендуется использовать клеточный сетчатый фильтр 50 или 70 мкм для фильтрации нежелательного мусора тканей. Чтобы увеличить количество одноклеточных клеток, рекомендуется промывка нескольких сонных артерий. Здесь, чтобы получить по меньшей мере 5000 клеток, 10-12 сонных артерий были промыты и объединены в один образец. - Центрифугирование ячеек при 500 × g в течение 5 мин при 4 °C с помощью центрифуги, оснащенной ротором с фиксированным углом наклона (см. Таблицу материалов).
- Откажитесь от надосадочного вещества и повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере пищеварения, содержащем клеточный диссоциационный реагент (см. Таблицу материалов) в течение 5 мин при 37 °C для разделения всех клеток на отдельные клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество клеток в препарате низкое, увеличьте скорость центрифуги до 2000-3000 × г для вращения клеток. Кроме того, использование 0,5 мл центрифужных трубок облегчает лучшую визуализацию ячейки гранулы в нижней части трубки. - Блокируют ферментативную реакцию, добавляя 0,15 мл FBS в пробирку объемом 0,5 мл.
- Центрифуга одноэлементной суспензии при 500 × g в течение 5 мин при 4 °C используется центрифуга, оснащенная ротором с фиксированным углом наклона, как на этапе 4.4.
- Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 100 мкл ледяного 1% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS в микроцентрифужной пробирке объемом 0,2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование центрифужных трубок объемом 0,2 мл улучшает визуализацию одноэлементной гранулы в нижней части трубки.
5. Одноклеточный и одноядерный анализы
- Повторно суспендировать и представить одноклеточный препарат для scRNAseq.
- Повторно суспендировать одноэлементную гранулу со 100 мкл ледяного 1% BSA в PBS в пробирке объемом 0,2 мл.
- После повторного использования клеток для одноклеточной инкапсуляции немедленно приступайте к одноклеточной инкапсуляции и штрих-кодированию с использованием одноклеточной системы секционирования и штрихкодирования на основе микрофлюидики (см. Таблицу материалов).
- Перед отправкой образцов в Genomics Core подсчитайте и осмотрите одноклеточные препараты; обеспечить отсутствие клеточных агрегатов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Агрегация отдельных ячеек может быть дополнительно сведена к минимуму путем увеличения количества BSA до 2%.
- Повторно суспендировать и представить одноклеточный препарат для scATACseq.
- Повторно суспендируют ячейку гранулы в 100 мкл 0,04% BSA в ледяном 1x PBS и центрифугируют одноэлементную суспензию при 500 × г при 4 °C.
- Слизируйте одноклеточную суспензию с ледяным 0,1-кратным лизизным буфером (табл. 1) и инкубируйте в течение 5 мин на льду.
- Смешайте лизат 10 раз с пипеткой P-20 и инкубируйте в течение дополнительных 10 минут.
- Добавьте 500 мкл охлажденного промывочного буфера (таблица 1) к лизированным ячейкам и перемешайте 5 раз с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте клеточный сетчатый фильтр 70 мкм для фильтрации любого мусора из клеточной суспензии и переноса их в трубку объемом 2 мл. - Центрифугируют лизат при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте ядра-гранулы в разбавленном буфере ядер (150 мкл) (см. Таблицу материалов и Таблицу 1). Подсчитайте и осмотрите одноядерные препараты с помощью гемоцитометра11.
- Отправьте образец одноядерного ядра в Genomics Core для транспозиции одноядер, секционирования ядер, подготовки библиотеки и секвенирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если начальное число клеток низкое, обычно наблюдаются обломки вдоль ядер. Поэтому рекомендуется начинать с высокого номера ячейки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Операции частичной перевязки сонной артерии были выполнены на 44 мышах, и начало d-потока в LCA было подтверждено путем выполнения ультрасонографии через один день после операции частичной перевязки. Успешная операция частичной перевязки вызывает снижение скорости кровотока и обращает вспять кровоток (нарушенный поток) в LCA3. Сонные артерии рассечены либо через два дня, либо через две недели после перевязки. Просвет каждой сонной артерии подвергали перевариванию коллагеназы, и получали обогащенные эндотелием одноклеточные или одноядерные суспензии. Одноклеточные суспензии были объединены из 10 RCA и LCA для увеличения выхода клеток. Подготовленные клетки/ядра впоследствии были штрих-кодированы и секвенированы. Для исследования sc-RNAseq количество полученных одиночных клеток составило ~ 9 700. Распределение клеток из 4 образцов показано в таблице 2.
Аналогичным образом, для исследования scATACseq отдельные клетки были выделены из 12 RCA и LCA, которые были приготовлены, подвергнуты транспозазной обработке, штрих-кодированы и секвенированы. Секвенирование проводили для 18 324 одиночных ядер, которые были объединены из 1 291 (2-дневный RCA [2D-R]), 5 351 (2-дневный LCA [2D-L]), 5 826 (2-недельный RCA [2W-R]) и 5 856 (2-недельный LCA [2W-L]) (таблица 2). Репрезентативные одноклеточные и одноядерные препараты, визуализированные с помощью ярко-полевой микроскопии и фазово-контрастной микроскопии, показаны на рисунке 2A,B. Эффективность одноядерного препарата из одноклеточной суспензии показана на фиг.2С.
Ядра (~7000 каждый) из образцов 2D (RCA и LCA) и 2W (RCA и LCA) инкубировали с транспозиционной смесью (фермент транспозазы Tn5 и буфер) см. Таблицу материалов) в течение 60 мин при 37 °C в соответствии с протоколом производителя. Основываясь на рекомендации производителя, мягкое моющее состояние помогло сохранить ядра нетронутыми во время маркировки. Мастер-микс, состоящий из реагента штрихкодирования, восстановителя B и фермента штрихкодирования, затем загружали на платформу инкапсуляции микрофлюидных клеток/ядер для получения одноядерных гелевых эмульсий с штрихкодированием в соответствии с инструкциями производителя.
Пакет программного обеспечения Cell Ranger Single-Cell Software использовался для демультиплексирования, выравнивания обработки штрих-кодов и первоначальной кластеризации необработанных профилей scATACseq и scRNaseq. Для исследования scRNAseq распределение генов на клетку, уникальный молекулярный идентификатор (UMI) на клетку, чтение митохондрий на клетку и информация о насыщении секвенирования показаны на рисунке 3A-C. Аналогичным образом, для исследования scATACseq метрики контроля качества, показывающие распределение размеров вставки (паттерн полос нуклеосом) и нормализованный показатель обогащения TSS, показаны на рисунке 3D-F. Кроме того, процентное считывание фрагментов в пиках, фрагменты пиковой области, оценка обогащения TSS, соотношение считываний в геномных сайтах черного списка и отношение сигнала нуклеосом показаны на рисунке 3G-K.
Обогащение эндотелия количественно оценивали путем сравнения этого метода с ферментативным перевариванием всей сонной артерии12. Количество эндотелиальных клеток от полного переваривания сонной артерии составляло 3-5% от общего количества полученных клеток, тогда как этот метод позволил обогатить эндотелиальные клетки до >50% 8. Аналогичным образом, другое одноклеточное исследование, в котором использовалась вся аорта мыши, показало, что эндотелиальная фракция составляла <7% от общего количества клеток. Для углубленного анализа одноклеточных RNAseq и одноклеточных ATACseq читателям предлагается обратиться к 8.
Рисунок 1: Выделение сонных артерий для одноклеточного препарата. (A) Анатомический взгляд на сонные артерии у мышей. Красные стрелки и вставка показывают изолированную левую сонную артерию после очистки периадвентициального жира. Для схемы анатомии сонной артерии и лигирования обратитесь к рисунку 1 в Nam et al3 (B) Изображение показывает расположение микрозажимов после заполнения сонной артерии буфером пищеварения. (C) Эксплантированная сонная артерия, содержащая буфер пищеварения. Масштаб: расстояние между черными линиями = 1 мм. (D) Игла 29 G в просвете сонной артерии мыши. Этот шаг помогает пополнить сонную артерию буфером пищеварения, если это необходимо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Одноклеточный и одноядерный препарат из просветного ферментативного сбраживания сонной артерии мыши. (А) Репрезентативные одноклеточные и одноядерные препараты. Шкала полос = 0,25 мм (B) Репрезентативные фазоконтрастные и gel-Red изображения одноядерных препов. Шкала стержней = 0,25 мм. (C) Эффективность одноядерной подготовки в левой колонке показывает количество одиночных клеток в начале, а в правой колонке показано количество одиночных ядер после обработки буфером выделения ядер на разных этапах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Стандартные метрики контроля качества для исследования scRNAseq и scATACseq. Скрипичные графики показывают (A) распределение генов на клетку (nFeature RNA), (B) UMI на клетку (nCount_RNA), (C) митохондриальные показания на клетку (процент mt) для данных scRNAseq. (D и E) показывают паттерн полос нуклеосом для исследования scATACseq. Гистограмма размеров фрагментов ДНК демонстрирует сильный паттерн нуклеосомной полосы, соответствующий длине ДНК, обернутой вокруг одной нуклеосомы. F) Нормализованный показатель обогащения СТШ в каждой позиции относительно СТШ. Графики рассеяния/скрипки показывают (G) процентное считывание фрагментов в пиках, меру глубины секвенирования, (H) фрагменты пиковой области, показывающие количество фрагментов, перекрывающих пики, (I) оценку обогащения TSS, отношение между совокупным распределением считываний, сосредоточенных на TSS, и тем, что фланкирует соответствующий TSS, (J) отношение черного списка, отношение чтения в геномных сайтах черного списка, и (K) сигнал нуклеосомы, отношение мононуклеосомных фрагментов к фрагментам, свободным от нуклеосом. Сокращения: scRNAseq = секвенирование одноклеточной РНК; scATACseq = одноклеточный анализ для транспозазного секвенирования хроматина; QC = контроль качества; UMI = уникальный молекулярный идентификатор; TSS = стартовый сайт транскрипции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Состав одноядерных буферов лизиса и промывки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Количество одноклеточных и одноядерных соединений при переваривании просвета сонной артерии мыши. В таблице также показаны значения считывания/клетка и количество генов/клеток для данных scRNAseq. Для данных scATACseq показано8 средних фрагментов/ячейка и общее количество считываний, полученных на образец. Сокращения: scRNAseq = секвенирование одноклеточной РНК; scATACseq = одноклеточный анализ для транспозазного секвенирования хроматина; 2D = 2 дня; 2W = 2 недели; R/RCA = правая сонная артерия; L/LCA = левая сонная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье представлен подробный протокол выделения одноклеточных препаратов из сонных артерий мыши. Влияние d-потока на эндотелиальные клетки может быть точно изучено, если операция PCL выполнена правильно. Крайне важно правильно идентифицировать ветви общей сонной артерии, такие как наружная сонная, внутренняя сонная, затылочная артерия и верхняя щитовидная артерия. Валидация моделей потока с помощью ультрасонографии дополнительно подтверждает успешное наступление условий d-потока . Хотя операция PCL может быть выполнена на мышах независимо от их возраста, предпочтительный возраст составляет 10 ± 2 недели. Старые мыши и мыши с гиперхолестеринемическим фоном, как правило, имеют больше периадвентиционного жира и более жесткую кожу.
Важно тщательно рассечь обогащенные эндотелием сонной артерии одноклеточные препараты, свободные от окружающих тканей и периадвентициального жира. Просвет сонных артерий должен быть тщательно перфузирован, чтобы избежать загрязнения клеток крови в одноклеточных препаратах. Неправильная идентификация тканей и маркировка могут привести к высокому стандартному отклонению. Для этого протокола требуется тщательное планирование и управление временем. Опытному хирургу и оператору может потребоваться 15-20 минут, чтобы выполнить одну операцию PCL. Жертвоприношение, выделение сонной артерии и переваривание просветной ферментативности у каждой мыши займет дополнительно 35-40 минут. Время практической обработки от промывки эндотелиальных клеток до подготовки к одноклеточной/одноядерной подготовке составляет дополнительные 2 ч. Тщательное планирование и командная работа настоятельно рекомендуются.
Как и в случае с любым экспериментальным протоколом, следует учитывать некоторые недостатки и ограничения. Текущий протокол не включает в себя шаги, чтобы избежать артефактной активации немедленного раннего ответа во время диссоциации просветной ткани. В литературе сообщалось, что ферментативное пищеварение может привести к сигнальным событиям стресса, таким как воспаление и апоптоз. Это может быть решено путем включения соответствующих контрольных групп в экспериментальный проект. Кроме того, влажные лабораторные методы, которые могут минимизировать артефактную активацию немедленного ответа во время ферментативного пищеварения, такие как холодно-активные протеазы, следует считать13,14.
Этот протокол может быть использован для любого штамма мыши, независимо от его генетического фона. Тем не менее, препараты, обогащенные эндотелием, могут наилучшим образом ответить на исследовательские вопросы, касающиеся изменений в эндотелии, и поэтому хорошо подходят для EC-специфических нокаутов и EC-специфических трансгенных мышей. Этот метод одноклеточной изоляции может быть адаптирован для выполнения одноклеточных многоомных исследований и других анализов на основе проточной цитометрии, таких как визуализационная проточная цитометрия. Подход к люминальному пищеварению может быть использован для свежеприобретенных аорт мышей, артерий крупных животных (кроликов и свиней), а также для свежеприобретенных сосудистых эксплантов человека. В совокупности этот метод позволил бы нам полностью понять точную роль кровотока в функции эндотелия и перепрограммировании с одноклеточным разрешением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
HJ является основателем FloKines Pharma. У других авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансированием грантов Национальных институтов здравоохранения HL119798, HL095070 и HL139757 для HJ. HJ также поддерживается профессорской кафедрой Уоллеса Х. Култера. Услуги, предоставляемые Emory Integrated Genomics Core (EIGC), субсидировались Медицинской школой Университета Эмори, а также частично поддерживались Альянсом клинических и трансляционных наук Джорджии Национальных институтов здравоохранения под номером премии. УЛ1ТР002378. Содержание, представленное выше, является исключительной ответственностью авторов и не отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 Silk Suture Sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution,sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | or equivalent |
| ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| Bovine Serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| Buprenorphine | Med-Vet International | RXBUPRENOR5-V | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 | 10X Genomics | 1000121 | |
| Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1 | 10X Genomics | 1000175 | |
| Collagenase II | MP Biomedicals | 2100502.5 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| Centrifuge (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co | RS-5675 | |
| Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ files | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | https://www.r-project.org | |
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
References
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).
- Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
- Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).
- Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).
- Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
- Stuart, T., et al.
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
Tags
Биология Выпуск 176 Клетки артерий Эндотелиальные клетки Одноклеточный RNAseq Одноклеточный ATACseq АтеросклерозErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 06/22/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
