Summary
이 절차는 마우스에서 번역 가능한 프로그레시브 로드 러닝 휠 저항 훈련 모델을 설명합니다. 이 저항 훈련 모델의 주요 장점은 전적으로 자발적이므로 동물의 스트레스와 연구원의 부담을 줄인다는 것입니다.
Abstract
시너지 절제, 전기 자극, 가중 사다리 등반, 그리고 가장 최근에는 가중 썰매 당기기를 포함하여 이전에 개발 된 설치류 저항 기반 운동 모델은 골격근 적응을 유도하는 비대 자극을 제공하는 데 매우 효과적입니다. 이러한 모델은 골격근 연구에 매우 중요한 것으로 입증되었지만 침습적이거나 비자발적이며 노동 집약적입니다. 다행히도 많은 설치류 균주는 달리는 바퀴에 접근 할 수있을 때 자발적으로 장거리를 달립니다. 설치류의 로드 휠 러닝(LWR) 모델은 근육량 증가 및 섬유 비대, 근육 단백질 합성 자극과 같은 인간의 저항 훈련에서 일반적으로 관찰되는 적응을 유도할 수 있습니다. 그러나 적당한 휠 하중을 추가하면 마우스가 먼 거리를 달리는 것을 막지 못하거나 지구력 / 저항 훈련 모델을 더 잘 반영하거나 마우스가 하중 적용 방법으로 인해 거의 완전히 달리기를 중단합니다. 따라서 외부 저항이 적용되고 점진적으로 증가하는 마우스를 위해 새로운 고하중 휠 주행 모델(HLWR)이 개발되어 마우스가 이전에 활용된 것보다 훨씬 더 높은 하중으로 계속 달릴 수 있습니다. 이 새로운 HLWR 모델의 예비 결과는 9 주 훈련 프로토콜 동안 비대 적응을 유도하기에 충분한 자극을 제공한다는 것을 시사합니다. 본 명세서에서는 마우스에서 간단하면서도 저렴한 점진적 저항 기반 운동 훈련 모델을 실행하기 위한 구체적인 절차가 설명된다.
Introduction
골격근 질량은 성인 인간의 체질량의 약 40 %를 차지합니다. 따라서 평생 동안 골격근을 유지하는 것이 중요합니다. 골격근 질량은 에너지 대사, 심부 체온 유지 및 포도당 항상성1에 필수적인 역할을 합니다. 골격근의 유지는 단백질 합성과 단백질 분해 사이의 균형이지만 이러한 과정을 주도하는 복잡한 분자 메커니즘에 대한 이해에는 여전히 많은 격차가 존재합니다. 근육량의 유지와 성장을 조절하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 인간 피험자의 연구 모델은 기계적 자극이 골격근 질량 조절에 필수적인 역할을하기 때문에 종종 저항 운동 기반 개입을 사용합니다. 인간 피험자 연구는 성공적이었지만 침습적 절차(즉, 근육 생검)에 대한 적응 및 윤리적 문제를 나타내는 데 필요한 시간은 얻을 수 있는 데이터의 양을 제한합니다. 저항 운동에 대한 적응은 포유류 종에 걸쳐 상당히 유비쿼터스이지만, 동물 모델은식이 요법과 운동 요법을 정확하게 제어 할 수있는 이점을 제공하는 동시에 뇌, 간, 심장 및 골격근과 같은 몸 전체의 전체 조직을 수집 할 수 있습니다.
설치류에 사용하기 위해 많은 저항 훈련 모델이 개발되었습니다 : 상승 적 절제2, 전기 자극3,4, 가중 사다리 등반5, 가중 썰매 당기기6 및 캔버스 쪼그리고 앉기7. 이러한 모든 모델이 올바르게 수행되면 비대와 같은 골격근 적응을 유도하는 효과적인 모델이 될 수 있음이 분명합니다. 그러나 이러한 모델의 단점은 대부분 비자발적이며 정상적인 설치류 행동의 일부가 아니며 시간 / 노동 집약적이며 침습적이라는 것입니다.
다행히도 많은 마우스와 쥐 균주는 달리는 바퀴에 접근 할 수있을 때 자발적으로 장거리를 달립니다. 또한, 자유 달리기 휠 (FWR) 운동 모델은 운동이나 근육 활동을 강요하기 위해 광범위한 컨디셔닝, 긍정적 / 부정적 강화 또는 마취에 의존하지 않습니다 8,9. 달리기 활동은 마우스 긴장, 성별, 연령 및 개인에 따라 크게 달라집니다. Lightfoot et al. 15 개의 다른 마우스 균주의 달리기 활동을 비교 한 결과 일일 달리기 거리는 2.93km에서 7.93km 사이이며 C57BL / 6 마우스는 성별에 관계없이 가장 멀리 달리는 것으로 나타났습니다10. FWR은 일반적으로 골격 및 심장 근육에서 지구력 적응을 유도하기위한 우수한 모델로 받아 들여집니다 11,12,13,14,15,16; 그러나 저항 훈련 모델에서 휠 러닝을 활용하는 것은 덜 일반적으로 조사됩니다.
의심할 수 있듯이, 휠 러닝의 비대 효과는 로드 휠 러닝(LWR)이라고 하는 러닝 휠에 저항을 추가하여 증가할 수 있으므로 저항 훈련을 보다 가깝게 모방하기 위해 휠에서 달리는 데 더 많은 노력이 필요합니다. 다양한 하중 적용 방법을 사용하여 이전 연구에서는 쥐와 생쥐를 활용한 LWR 모델이 일상적으로 5-30주 만에 6%-8%의 사지 근육량 증가를 나타냄을 보여주었습니다 17,18,19,20,21. 또한, D'hulst 등은 LWR의 단일 시합이 FWR22에 비해 단백질 합성 신호 전달 경로의 활성화를 50% 더 크게 증가시킨다는 것을 입증했습니다. 휠 저항은 마찰 기반의 일정한 하중 방법에 의해 가장 일반적으로 적용되었으며, 이에 따라 마그네틱 브레이크 또는 텐션 볼트를 사용하여 휠 저항 12,19,23,24를 적용합니다. 마찰 기반의 일정한 하중 방법의 한 가지주의 사항은 중간에서 높은 저항이 적용될 때 동물이 높은 저항을 극복하여 바퀴의 움직임을 시작할 수 없어 효과적으로 훈련을 중단한다는 것입니다. 가장 중요한 것은 설치류 주행 휠 모델에 사용되는 많은 케이지 및 휠 시스템이 비용이 많이 들고 특수 장비가 필요하다는 것입니다.
최근 Dungan 등은 휠의 한 측면에 부착 된 외부 질량을 통해 비대칭 적으로 휠에 하중을 가하는 점진적 가중 휠 러닝 (PoWeR) 모델을 개발했습니다. PoWeR 모델의 불균형 휠 하중 및 가변 저항은 지속적인 달리기 활동을 장려하고 마우스에서 적재 된 휠 달리기의 더 짧은 파열을 촉진하여 저항 훈련17로 수행 된 세트 및 반복을보다 밀접하게 모방하는 것으로 생각됩니다. 평균 달리기 거리가 하루 10-12km임에도 불구하고 PoWeR 모델은 발바닥근 습윤 질량과 섬유 단면적(CSA)이 각각 16% 및 17% 증가했습니다. 많은 실용적인 이점에도 불구하고 LWR의 PoWeR 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 저자가 인식한 바와 같이, PoWeR 모델은 보다 엄격한 저항 운동 기반 모델과 달리 혼합된 지구력/저항 운동 모델(즉, 인간에 대한 동시 훈련)을 반영하는 대용량 "하이브리드" 자극으로, 잠재적으로 간섭 효과를 도입하고 덜 뚜렷한 비대 또는 비대가 유도되는 다른 메커니즘에 기여합니다.25 . 저항 운동 훈련 모델로 의도 된 것에서 동시 훈련 현상이 발생하지 않도록하는 것이 필수적입니다. 따라서 PoWeR 모델은 저항 훈련 모델과 더 유사하게 이전에 사용된 것보다 더 높은 부하를 활용하는 LWR 모델을 개발하도록 수정되었습니다. 본원에서, C57BL/6 마우스에서의 간단하고 저렴한 9주 진행적 저항 훈련 LWR 모델에 대한 세부사항이 제공된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구는 애팔래치아 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(#22-05)의 승인을 받았습니다.
1. 동물
- 사내 마우스 콜로니에서 C57BL/6 마우스를 조달합니다.
참고: 연구 시작 시 5-8개월령의 수컷 마우스를 사용했습니다. 일일 달리기 활동은26세에 약 9-10주에 최고조에 달하고 정체됩니다. 이전 연구에 따르면 늙은 쥐 (22-24 개월)도로드 된 휠 러닝27을 수행 할 것입니다. - 철사 뚜껑이 있는 표준 설치류 케이지에 마우스를 개별적으로 수용하고 케이지를 통제된 환경(20:24 h 빛:어두운 주기로 12-12 °C)에 보관하십시오.
- 표준 설치류 차우 와 물을 자유롭게 제공하십시오.
2. 러닝 휠 장치
- 러닝 휠 설정:
알림: 러닝 휠은 1g 또는 2.5g 하중 자석을 추가하는 것을 제외하고 모든 실행 프로토콜에 대해 유사하게 조립/설정됩니다.- 단일 1g 센서 자석을 주행 휠의 바깥쪽 중간 둘레에 붙입니다(그림 1).
- 이 휠을 단일 1g 센서 자석과 함께 사용하여 휠 적응 첫 주 동안만 사용하십시오.
- 로드된 휠 실행(LWR, PoWeR17과 동일한 로딩 프로토콜): 2.1.4-2.1.6단계를 따릅니다.
- LWR의 2주차에는 2g의 부하가 필요합니다(표 1 참조).
- 두 개의 1g 자석을 휠의 외부 원주에 나란히 붙입니다(그림 2A).
알림: 여기에서는 접착제가 단단히 마를 때까지 테이프를 사용하여 자석을 제자리에 고정하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 센서 자석에 끌려 빠질 수 있습니다. - 이미 존재하는 자석 중 하나 위에 다른 1g 자석을 놓아 3, 4, 6주에 추가 하중을 가합니다.
알림: 자석이 서로 단단히 부착되므로 접착제가 필요하지 않습니다. 예를 들어, 6주차에 6g의 하중이 가해지면 자석은 각각 3개 높이로 쌓이게 됩니다(그림 2B). - 고부하 휠 러닝(HLWR): 2.1.8-2.1.11단계를 따릅니다.
알림: HLWR 프로토콜에는 세 세트의 휠이 필요합니다. 다른 바퀴 세트를 조립하면 연구자가 바퀴를 철저히 청소하고 소독하면 다른 마우스의 바퀴 설정을 재사용할 수 있습니다(각 세트의 수는 코호트/그룹 크기에 따라 연구원이 결정해야 함). - 첫 번째 휠 세트(2주차에만 필요)에는 단일 2.5g 자석이 있습니다. 접착제(아래 참고 사항 참조) 2.5g 자석을 휠의 외부 둘레에 꽂습니다(그림 3A).
- 두 번째 휠 세트(3주차에만 필요)에는 2.5g 자석 2개가 있습니다. 접착제(아래 참고 사항 참조) 2.5g 자석 2개를 휠의 바깥쪽 둘레에 나란히 놓습니다(그림 3B).
- 세 번째 휠 세트(4주차 이상에 필요)에는 3개의 2.5g 자석이 나란히 있습니다. 접착제(아래 참고 사항 참조) 2.5g 자석 3개를 휠의 외주에 나란히 놓습니다(그림 3C).
- 이미 존재하는 자석 중 하나 위에 다른 2.5g 자석을 놓아 6주와 8주에 추가 하중을 가합니다(그림 3D, E).
그림 1: 휠의 중간 외주에 단일 1g 센서 자석이 접착된 기본 러닝 휠. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 센서 자석과 1g 하중 자석이 있는 적재 러닝 휠(LWR). (A) 2g의 하중의 예, 휠의 바깥쪽 가장자리에 나란히 접착된 2개의 1g 자석; (B) 6g의 하중의 예, 2개의 1g 자석이 추가로 4g의 하중이 가해진 상태에서 휠의 바깥쪽 가장자리에 나란히 접착됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 센서 자석과 2.5g 하중 자석이 있는 고하중 주행 휠(HLWR). (A) 2.5g 하중의 예, 휠의 바깥쪽 가장자리에 접착된 2.5g 자석 1개; (b) 5g의 하중의 예, 휠의 바깥쪽 가장자리에 나란히 접착된 2개의 2.5g 자석; (c) 7.5g의 하중, 휠의 바깥쪽 가장자리에 나란히 접착된 3개의 2.5g 자석의 예; (D) 10g의 하중, 3개의 2.5g 자석이 휠의 바깥쪽 가장자리에 나란히 접착되고 추가로 2.5g의 하중이 가해지는 예; (E) 12.5g의 하중의 예, 3개의 2.5g 자석이 휠의 바깥쪽 가장자리에 나란히 접착되고 추가로 5g의 하중이 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 케이지 조립
- 디지털 자전거 컴퓨터가 장착된 케이지를 사용하여 러닝 휠을 조립하여 운동 시간(h)과 이동 거리(km)를 모니터링합니다. 평균 속도(km/h)는 산술적으로 파생됩니다.
- 조립하기 전에 새 배터리가 자전거 컴퓨터에 삽입되었는지 확인하십시오.
- 초기 자전거 컴퓨터 프로그래밍 중에 휠 크기를 설정하십시오 (제조업체 지침 참조). 주행 휠의 외주를 측정함으로써 회전 당 거리를 계산한다(예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 휠 타입의 경우 3,580mm).
- 자전거 컴퓨터 센서를 케이지 덮개 외부의 단단한 표면, 바퀴의 센서 자석이 있는 위치 바로 위에 놓습니다. 모든 컴퓨터 및 센서 구성 요소가 케이지 외부의 단단한 장벽 내에 포함되어 있는지 확인하여 마우스가 구성 요소를 씹지 않도록하십시오.
- 마그네틱 자전거 센서가 상주할 수 있도록 작은 직사각형이 잘린 빈 피펫 팁 상자의 뚜껑과 상자의 주요 부분(팁 랙 그리드가 제거된 상태)을 활용하여 자전거 컴퓨터와 와이어를 고정합니다(그림 4A).
- 단단한 표면의 모서리에 두 개의 구멍을 뚫어 마그네틱 자전거 센서와 러닝 휠 스탠드를 케이지 외부의 제자리에 고정합니다(그림 4A).
- 케이지 뚜껑의 틈새를 통해 러닝 휠 베이스를 거꾸로 삽입하되 3.2단계에서 설명한 단단한 표면 위에 삽입합니다(그림 4B).
- 휠 베이스와 컴퓨터 센서를 하드웨어로 케이지 상단에 고정합니다(그림 4C, D).
- 바퀴 움직임을 적절하게 기록할 수 있도록 센서 자석과 컴퓨터 센서가 1cm 이상 떨어져 있지 않은지 확인하십시오(대부분의 표준 자전거 컴퓨터 센서는 양방향이며 양쪽 회전 방향에서 양의 바퀴 움직임을 기록합니다).
- 케이지 덮개 내부에서 휠베이스에 적절한 주행 휠 (위에서 설명한대로)을 부착하고 덮개를 케이지에 단단히 놓습니다 (그림 4E, F).
- 휠을 케이지 뚜껑에 매달아 케이지 바닥에서 최소 2.5cm의 간격을 두십시오. 케이지에 최소한의 침구 재료를 넣어 바퀴가 자유롭게 회전하지만 침구가 쌓여서 방해받지 않도록하십시오.
- 실험 중에 정확한 활동 모니터링을 보장하기 위해 일관된 간격 일정으로 자전거 컴퓨터의 데이터를 기록하십시오.
- 생쥐는 야행성 종이라는 것을 인식하십시오. 따라서 대부분의 자연 케이지 활동 (휠 러닝 포함)은 빛주기의 어두운 시간 동안 수행됩니다.
그림 4: 러닝 휠 케이지 어셈블리. (A) 단단한 표면/트레이에 놓인 자전거 컴퓨터 및 자기 센서; (B) 단단한 표면/트레이 및 센서 상단에 배치된 거꾸로 된 휠 베이스(평면도, 하드웨어로 베이스를 케이지 리드에 고정하기 위한 센서 표면/트레이의 두 구멍 참고), (C) 하드웨어가 조립된 거꾸로 된 휠 베이스(하단 뷰); (D) 하드웨어가 조립된 역 휠 베이스(평면도); (E) 전체 케이지 조립체 (평면도); 및 (F) 전체 케이지 어셈블리 (측면도). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 운동 훈련 로딩 프로토콜
- 개별적으로 앉아있는(SED) 마우스를 임의의 달리기를 방지하기 위해 잠긴 달리기 바퀴를 함유하는 케이지에 9주 동안 집한다.
참고: 표 1은 실험 설계에 사용된 LWR(PoWeR) 및 HLWR 프로토콜에 대한 로드 일정을 제공합니다. - 필요한 경우 LWR 및 HLWR 그룹에 대한 부하를 줄여 마우스가 전체 9주 프로토콜 동안 계속 운동할 수 있도록 합니다.
| 주 | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | ||
| LWR (n = 4) | 하중 (g) | 0.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 5.0 | 6.0 | 6.0 | 6.0 |
| %BM | -- | 8% | 11% | 15% | 19% | 19% | 23% | 23% | 23% | |
| HLWR (n = 7) | 하중 (g) | 0.0 | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 7.5 | 10.0 | 10.0 | 12.5 | 12.5 |
| %BM | -- | 10% | 19% | 28% | 28% | 38% | 38% | 48% | 48% | |
표 1. 로드된 휠 실행 프로토콜
5. 현장 근육 기능 테스트, 조직 수확 및 조직 분석
- 9주간의 훈련 중재 후, 흡입된 이소플루란(4% 유도, 2% 유지)을 사용하여 마우스를 보충 산소로 마취시키고 절차 전반에 걸쳐 적절한 마취 평면 모니터링을 보장합니다.
- 등척성 근력을 테스트하기 위해 비복근, 족저근, 솔레우스(GPS) 복합체에 대한 현장 근육 기능 테스트를 수행합니다28. 1-300Hz 사이의 11개의 오름차순 주파수에서 27G 전극 바늘로 좌골 신경을 직접 자극하여 힘-주파수 곡선을 설정하고 파상풍 수축은 약 100-150hz29에서 발생합니다.
- 근육 기능 검사 직후 자궁 경부 탈구를 통해 마우스를 안락사시키고 심장을 제거하여 안락사를 확인합니다. 발바닥과 솔레 우스 근육을 조심스럽게 절제하고 젖은 조직 덩어리를 기록하십시오.
- 각 근육 샘플을 매립 매체(OCT)에 코팅하고 코르크에 장착합니다. 액체 질소 냉각 이소 펜탄에 동결시키고 근육 조직 섹션 (80μm 두께)에 대해 추가 면역 조직 화학 (IHC) 분석이 수행 될 때까지 -10 ° C에서 보관하십시오.
- 라미닌에 대한 면역 형광법을 사용하여 근육 섬유 CSA를 분석합니다. 자동 이미지 정량화 플랫폼(30)을 사용하여 광섬유 CSA를 측정합니다.
6. 통계 분석
- 모든 데이터를 SD± 평균으로 표현합니다.
- 유의성이 p ≤ 0.05로 설정된 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
- 휠 달리기 및 훈련 볼륨 데이터를 반복 측정 양방향 분산 분석과 비교합니다.
- 체질량, 조직 질량, CSA 및 근육 기능을 일원 분산 분석과 비교합니다. 유의한 F-비율이 발견되면 Fisher LSD 사후 분석을 사용하여 그룹 내 차이를 비교합니다.
- 효과 크기를 계산한 다음 소형, 중형 및 대형 효과 크기에 대해 각각 0.01, 0.06 및 0.14로 해석합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 연구에서, 24마리의 C57BL/6 마우스(이 연구 시작 시 6.3 ± 0.7개월)를 좌식(SED), 로드휠 러닝(LWR; Dungan et al.17에 의해 기술된 PoWeR과 동일) 또는 높은 LWR(HLWR)의 세 가지 치료 그룹 중 하나에 무작위로 할당한 다음, 각각의 9주 프로토콜을 완료했습니다. 적응 주(1주차) 이후에는 달리기 거리 또는 훈련량에 그룹 또는 그룹 x 시간 차이가 없었습니다(그림 5).
그림 5: LWR(녹색으로 채워진 사각형) 및 HLWR(빨간색으로 채워진 삼각형) 그룹의 러닝 휠 특성. (A) 평균 일일 주행 거리 (km); (B) 일일 주행 거리(km/일)에 일일 휠 하중(g)을 곱한 값으로 표시되는 평균 훈련량(km/일∙g). 데이터는 그룹 평균 ± SD로서 표현된다. LWR, n=4; HLWR, n = 7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
정규화된 솔레우스 질량은 섬유 CSA의 차이가 없음에도 불구하고 SED 그룹(p < 0.001)보다 HLWR 그룹에서 0.536% 더 컸습니다(그림 6A). 족저근과 평균 섬유 CSA는 통계적으로 유의미한 차이를 나타내지 않았지만(각각 p = 0.573 및 p=0.111), SED 및 LWR에 비해 HLWR의 발바닥에서 CSA가 더 큰 섬유의 비율에 변화가 있는 것으로 보입니다(그림 6B). 현장 근육 기능 테스트로 측정한 그룹 간의 GPS 복합체의 경련 또는 피크 힘에는 유의미한 차이가 없었습니다(표 2).
그림 6: 섬유 단면적 비율. (A) SED (검은 색으로 채워진 원), LWR (녹색으로 채워진 사각형) 및 HLWR (빨간색으로 채워진 삼각형) 그룹 (n = 3-4 / 그룹)의 단면적에 의한 Soleus 및 (B) 발바닥 근육 섬유 비율 (%). 솔레 우스 근육은 모든 그룹에서 유사한 섬유 CSA 비율을 포함합니다. HLWR 그룹의 족저근은 SED 및 LWR 그룹에 비해 CSA가 더 큰 섬유 비율이 더 높은 것으로 보입니다. 데이터는 각 섬유 크기 카테고리에 대한 그룹 평균으로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 그룹 | |||||
| 증권 시세 표시기 | 증권 시세 표시기 | 증권 시세 표시기 | p-값 | 효과 크기(ƞ2) | |
| 사전 훈련 체질량 (g) | 26.35 ± 2.12 | 28.07 ± 3.42 | 2.22± 25.71 | 0.299 | 0.324 |
| 훈련 후 체질량 (g) | 26.82 ± 1.96 | 28.91 ± 2.80 | 27.43 ± 2.07 | 0.251 | 0.341 |
| 솔레 우스 질량 (밀리그램 / g BM) | 0.28 ± 0.03 | 0.31 ± 0.02 | 0.34 ± 0.03# | 0.003 | 0.611 |
| 플란타리스 질량 (밀리그램/g BM) | 0.61 ± 0.06 | 0.64 ± 0.03 | 0.63 ± 0.06 | 0.573 | 0.239 |
| 솔레우스 CSA (μm²) | 2042년 ± 320개 | 1964년 ± 357년 | 1800 ± 206 | 0.536 | 0.130 |
| 플란타리스 CSA (μm²) | 2032년 ± 159개 | 2483 ± 579 | 2754 ± 109 | 0.111 | 0.519 |
| 트위치 포스 (N/g GPS) | 2.96 ± 0.47 | 3.19 ± 0.58 | 3.42 ± 0.78 | 0.254 | 0.340 |
| 최대 파상풍력 (N / g GPS) | 11.43 ± 1.77 | 13.04 ± 2.87 | 13.13 ± 1.70 | 0.136 | 0.395 |
| # - SED와 현저히 다른 것을 나타냅니다. 효과 크기 (ƞ2) : 작음 = 0.01; 중간 = 0.06; 큼 = 0.140 | |||||
표 2. 동물의 특성, 조직 질량, 근력 및 섬유 단면적
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
설치류의 기존 저항 운동 모델은 골격근 연구에 매우 귀중한 것으로 입증되었습니다. 그러나 이러한 모델 중 상당수는 침습적, 비자발적 및/또는 시간 및 노동 집약적입니다. LWR은 잘 받아 들여지는 다른 저항 운동 훈련 모델에서 관찰 된 것과 유사한 근육 적응을 유도 할뿐만 아니라 연구자의 최소한의 시간 / 노동 투입으로 동물에게 만성적이고 스트레스가 적은 운동 자극을 제공하는 우수한 모델입니다. 또한 LWR 모델은 연구자의 직접적인 개입을 최소화해야하기 때문에 단기 또는 장기 개입 연구를 위해 전체 마우스 코호트를 동시에 쉽게 운동 훈련시킬 수 있습니다. 그러나 적당한 휠 하중의 적용은 마우스가 먼 거리를 달리는 것을 막지 못하거나 (너무 적은 저항) 마우스는 하중 적용 방법 (너무 많은 저항)으로 인해 거의 완전히 달리기를 중단합니다. Dungan et al. (2019)17 에 의해 개발된 점진적 가중 휠 러닝(PoWeR) LWR 모델은 섬유 비대와 같은 상당한 근육 적응을 산출하지만 보다 산화적인 표현형으로의 전환을 촉진합니다. 진정한 "저항 기반" 모델로서의 PoWeR의 한계는 저항과 지구력 자극의 조합을 제공하는 하이브리드 훈련 요법을 더 잘 반영하여 더 높은 볼륨(거리) 및 더 낮은 부하(저항) 자극을 유도한다는 것입니다. 따라서 PoWeR 모델을 수정하여 외부 부하가 가해지고 점진적으로 증가하는 저항 편향 자극을 더 많이 제공하는 마우스를 위해 새로운 HLWR(고부하 휠 주행) 모델이 개발되어 마우스가 계속 달릴 수 있지만 이전에 사용된 것보다 훨씬 높은 부하에서. 우리 모델은 PoWeR 모델과 동일한 불균형 휠 로딩 개념을 사용했지만 더 간단하고 저렴한 시스템을 사용했습니다. 마우스의 "정상적인" 산발적(켜기 및 끄기) 실행 휠 동작 외에도, 불균형한 휠 로딩은 마우스가 중단된 "스퍼트"로 실행되도록 합니다. 이는 마우스가 회전의 전반부 동안 하중을 휠의 상단(반대 중력)으로 당겨야 하고, 회전 후반부 동안 하중이 중력과 함께 바닥으로 떨어질 때만 "해안" 또는 "자유 휠"로 당겨야 하기 때문입니다.
9 주간의 훈련 후, HLWR 마우스의 단독 근육은 근육량이 21.4 % 증가했지만 섬유 CSA에는 차이가 없었습니다. HLWR 마우스의 발바닥 근육은 근육량의 유의 한 증가를 나타내지 않은 반면, CSA가 큰 섬유의 비율은 증가하는 것으로 나타났습니다. Konhilas et al. 및 Soffe et al. 낮은 저항과 높은 저항 휠 달리기19,23 사이의 근육 성장에 차이가 없음을 관찰했습니다. 그러나 현재 연구에서 솔레 우스 질량은 LWR 및 HLWR 그룹에서 각각 ~ 10 % 및 ~ 20 % 증가했습니다. 신규한 HLWR 저항 훈련 모델에 반응하는 근육 비대는 근육 및 섬유 유형 특이적일 수 있는 것으로 보인다; 그러나이 개념을 확인하려면 추가 조사가 필요합니다. 현장 근육 기능 시험은 안락사 및 조직 수집 직전인 9주 프로토콜이 끝날 때 마우스의 오른쪽 사지에서만 단일 급성 세션으로 수행되었습니다. 여기에 보고된 근육량(체질량으로 정규화된 젖은 질량)은 오른쪽 사지 근육의 젖은 질량을 변화시킬 수 있는 수술 절차로 인한 상당한 부기/부종이 있기 때문에 마우스의 왼쪽 사지에서만 발생합니다.
이 새로운 HLWR 모델의 중요성은 마우스가 바퀴에 상대적으로 높은 하중을 가하면서 계속 달릴 것임을 보여준다는 것입니다. C57BL/6 마우스의 평균 체질량(% BM)과 관련된 휠 하중은 이 프로젝트에 사용된 마우스의 평균 체질량(~26g)을 기준으로 합니다. 평균 마우스 체중은 균주, 연령 및 성별에 따라 달라집니다. HLWR 모델에서 10-12.5g의 최고 하중(마우스 체질량의 ~40%-50%에 해당)은 PoWeR 모델(최대 = 6g)보다 상당히 높거나 휠 저항의 약 두 배입니다. 통계적으로 유의하지는 않지만 HLWR 모델의 7.5주차 이상에서 휠 하중이 6g을 초과하여 진행됨에 따라 주행 거리가 급격히 감소한 것으로 보이며 LWR은 나머지 9주 프로토콜 동안 일정한 평균 주행 거리를 유지했습니다. HLWR 모델에서 높은 휠 하중이 주행 거리를 크게 감쇠시키지 못하는 것은 이러한 결과의 한계입니다. 그러나 이는 그룹 내에서 실행 성능에 매우 높은 변동성이 있었기 때문에 더 큰 코호트 크기로 완화될 수 있습니다.
휠 러닝에 적응한 후 첫 주 이내에 지속적으로 달리는 마우스의 성향을 평가하는 것은 어려울 수 있습니다. 일부 마우스는 근육 적응을 유도하기에 충분히 달리지 않기 때문에 휠 달리기 그룹에 특정 마우스를 계속 포함시키기 위한 최소 임계값 컷오프를 구현하는 것이 좋습니다. 최소 임계값 컷오프는 적응 첫 주 동안 최소 1km/일의 평균 주행 거리여야 합니다. 마우스가 첫 주 동안 평균 1km / 일 이상 달리지 않으면 마우스가 적응이 발생하도록 상당한 자극을 제공하기 위해 나머지 9 주 프로토콜 동안 달리기 거리를 크게 늘릴 가능성은 거의 없습니다. 이 경우 특정 마우스가 첫 번째 적응 주 후 최소 임계값인 1km/일을 충족하지 못하면 휠을 잠그고 해당 마우스를 앉아있는 그룹에 다시 할당하십시오. 이 최소 임계 값 컷오프를 구현하면 달리기 통계의 변동성이 줄어들고 마우스가 9 주 프로토콜 동안 적절한 훈련 자극을 얻을 수 있습니다. 이것은 동물 연구의 세 가지 "R", 특히 감소의 정신입니다. 둘째, 높은 휠 하중이 가해질 때 마우스가 특정 거리를 달리지 못하는 경우 기본 제공 비상 계획을 갖는 것이 중요합니다. 쥐가 전체 9 주 프로토콜 동안 계속 운동하도록하려면 달리기 거리가 0.25 일 연속 3km / 일 아래로 떨어지면 부하를 이전 주 부하로 줄여야합니다. 이 경우 특정 마우스가 부하를 추가한 후 연속 3일 동안 평균 0.25km 이상을 달리지 않으면 마우스가 나머지 9주 프로토콜 동안 훈련을 계속할 수 있도록 휠 부하를 이전 부하로 다시 줄여야 할 수 있습니다. 이 연구에서 대부분의 마우스는 HLWR 프로토콜에서 가장 높은 하중 (12.5g)에서도 0.25km / 일 > 거리를 계속 달릴 수 있음이 관찰되었습니다 (그림 5A). 그러나이 비상 계획은 HLWR 그룹의 7 마리의 마우스 중 3 마리에 대해 구현되었으며, 이에 따라 10 주 훈련 프로토콜 동안 한 지점에서 부하를 7.5g 또는 9g으로 줄여야했습니다. 마우스가 프로토콜의 대부분을 성공적으로 실행한 것은 매우 높은 휠 하중에서 다음 단계에 도달할 수 없기 때문에 연구에서 제거되는 것은 불행한 일입니다. 지속적인 주행을 보장하기 위해 부하를 약간 줄이면 복지를 손상시키지 않으면 서 개별 동물의 사용을 극대화 할 수 있습니다. 마지막으로, 생쥐가 증가 된 신체 활동을 보상하기에 충분한 음식을 섭취하고 있는지 확인하기 위해 매일 (또는 적어도 매주) 음식 섭취량을 추적하는 것도 중요합니다. 이것은 마우스가 개별적으로 수용 될 때 비교적 간단합니다. 앉아있는 쥐에 비해 ~ 20 %의 음식 섭취량 증가를 기대하십시오31.
이러한 결과(예: 달리기 거리)를 PoWeR 모델에 대해 원래 게시된 결과와 직접 비교하는 것은 어렵습니다. Dungan et al. 하루에 ~ 10-12km의 달리기 거리를보고했습니다17, LWR 프로토콜을 수행 한 현재 프로토콜의 마우스는 하루에 ~ 5-6km를 달렸습니다. 뚜렷한 불일치는 Dungan et al.이 사용하는 암컷 마우스와 비교하여 현재 프로토콜에 사용 된 수컷 마우스에 기인 할 수 있는데, 암컷 마우스가 ~ 20 % -40 % 더 멀리 달리는 것으로 관찰 되었기 때문입니다10,32. 또한 Dungan et al. 금속 막대 주행 표면이 있는 금속 휠을 사용했는데, 이는 현재 프로토콜에 사용되는 플라스틱 러닝 휠에 비해 더 나은 주행 성능으로 이어질 수 있습니다. 젊은 암컷 C57BL/6 마우스가 동일한 플라스틱 러닝 휠 셋업(33)에서 하루 평균 8-10km를 달렸다고 이전에 보고되었다. 따라서 변형, 성별, 바퀴 유형 및 개인차와 같은 요인으로 인해 마우스의 실행 성능을 결정하기 위해 개별 실험실 설정에 대해 파일럿 테스트를 수행하는 것이 좋습니다.
여기에 설명 된 고 하중 저항 휠 주행 모델의 주요 장점은 값 비싼 특수 장비가 필요한 다른 모델보다 훨씬 비용 효율적이라는 것입니다. 이 러닝 휠 설정을 위한 장비는 상용 공급업체에서 제공하는 특수 러닝 휠 장치의 일부입니다. 마지막으로,로드 된 휠 러닝 모델은 동물 연구 개선의 세 가지 "R"중 하나를 충족합니다. 휠 러닝은 전적으로 자발적인 자극이기 때문에 이러한 모델은 다른 비대 모델, 특히 상승 작용 절제 또는 며칠 또는 몇 주간의 조작적 컨디셔닝이 필요한 다른 모델에 비해 비침습적이며 마우스에 대한 스트레스가 훨씬 적습니다. 향후 연구에서는 HLWR 모델이 LWR 모델의 혼합 지구력/저항 자극에 비해 더 큰 비대 자극을 제공한다는 것을 확인해야 합니다. 결론적으로, 올바르게 수행된다면, 이 새롭고 진보적인 고하중 저항 휠 달리기 모델의 잠재적인 적용은 마우스를 위한 간단하면서도 저렴하고 처리량이 높으며 스트레스가 적은 저항 운동 개입입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트를 지원하기 위해 자금을 제공한 애팔래치아 주립 대학의 대학원 학생회, 학생 연구실 및 건강 및 운동 과학부에 감사드립니다. 또한 동물 연구 시설의 일상적인 운영을 감독 한 Monique Eckerd와 Therin Williams-Frey에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND018-6 | Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading |
| 2.5 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND022 | Used for 2.5 g increments of wheel loading |
| 8-32 x 1" stainless steel screws | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 | |
| 8-32 Wing Nuts | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07YYWW2SB/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| 10 µL pipette tip box (empty) | Thermo Scientific | 2140 | We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice |
| Extreme Liquid Glue | Loctite | ||
| Laminin primary antibody | Novus Biologicals | NB300-144AF647 | primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum |
| Lithium 3 V battery | n/a | CR2032 | |
| M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| MyoVision: Automated Image Quantification Platform | Wen et al. (2017) | v1.0 | https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision |
| Polycarbonate rodent cage (430 mm L x 290 mm W x 201 mm H), with narrow width stainless steel wired bar lid | Orchid Scientific | Polycarbonate Rat Cage Type II | https://orchidscientific.com/product/rat-cage/ - 1519974600758-c29bc1c5-6dfa |
| Sigma Sport 509 Bike Computer | Sigma Sport | Does not need to be this model in particular, but must have distance and time monitoring capabilities | |
| Silent Spinner Running Wheel (mini 11.4 cm) | Kaytee | SKU# 100079369 | https://www.kaytee.com/all-products/small-animal/silent-spinner-wheel |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Goldberg, A. L. Protein synthesis during work-induced growth of skeletal muscle. Journal of Cell Biology. 36 (3), 653-658 (1968).
- Baar, K., Esser, K. Phosphorylation of p70S6k correlates with increased skeletal muscle mass following resistance exercise. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 276 (1), 120-127 (1999).
- Wong, T. S., Booth, F. W. Skeletal muscle enlargement with weight-lifting exercise by rats. Journal of Applied Physiology. 65 (2), 950-954 (1988).
- Hornberger Jr, T. A., Farrar, R. P. Physiological hypertrophy of the FHL muscle following 8 weeks of progressive resistance exercise in the rat. Canadian Journal of Applied Physiology. 29 (1), 16-31 (2004).
- Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
- Tamaki, T., Uchiyama, S., Nakano, S. A weight-lifting exercise model for inducing hypertrophy in the hindlimb muscles of rats. Medicine and Science in Sports and Exercise. 24 (8), 881-886 (1992).
- De Bono, J. P., Adlam, D., Paterson, D. J., Channon, K. M. Novel quantitative phenotypes of exercise training in mouse models. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 290 (4), 926-934 (2006).
- Goh, J., Ladiges, W.
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Daves, M., Vordermark, A., Kleeberger, S. R. Genetic influence on daily wheel running activity level. Physiological Genomics. 19 (3), 270-276 (2004).
- Allen, D. L., et al. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. Journal of Applied Physiology. 90 (5), 1900-1908 (2001).
- Ishihara, A., et al. Effects of running exercise with increasing loads on tibialis anterior muscle fibres in mice. Experimental Physiology. 87 (2), 113-116 (2002).
- Kurosaka, M., et al. Effects of voluntary wheel running on satellite cells in the rat plantaris muscle. Journal of Sports Science and Medicine. 8 (1), 51-57 (2009).
- Lambert, M. I., Noakes, T. D. Spontaneous running increases VO2max and running performance in rats. Journal of Applied Physiology. 68 (1), 400-403 (1990).
- Rodnick, K. J., Reaven, G. M., Haskell, W. L., Sims, C. R., Mondon, C. E. Variations in running activity and enzymatic adaptations in voluntary running rats. Journal of Applied Physiology. 66 (3), 1250-1257 (1989).
- Sexton, W. L. Vascular adaptations in rat hindlimb skeletal muscle after voluntary running-wheel exercise. Journal of Applied Physiology. 79 (1), 287-296 (1995).
- Dungan, C. M., et al. Elevated myonuclear density during skeletal muscle hypertrophy in response to training is reversed during detraining. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 316 (5), 649-654 (2019).
- Ishihara, A., Roy, R. R., Ohira, Y., Ibata, Y., Edgerton, V. R. Hypertrophy of rat plantaris muscle fibers after voluntary running with increasing loads. Journal of Applied Physiology. 84 (6), 2183-2189 (1998).
- Konhilas, J. P., et al. Loaded wheel running and muscle adaptation in the mouse. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (1), 455-465 (2005).
- Legerlotz, K., Elliott, B., Guillemin, B., Smith, H. K. Voluntary resistance running wheel activity pattern and skeletal muscle growth in rats: Wheel running activity pattern and muscle growth. Experimental Physiology. 93 (6), 754-762 (2008).
- Mobley, C. B., et al. Progressive resistance-loaded voluntary wheel running increases hypertrophy and differentially affects muscle protein synthesis, ribosome biogenesis, and proteolytic markers in rat muscle. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 102 (1), 317-329 (2018).
- D'Hulst, G., Palmer, A. S., Masschelein, E., Bar-Nur, O., De Bock, K. Voluntary resistance running as a model to induce mTOR activation in mouse skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 10, 1271 (2019).
- Soffe, Z., Radley-Crabb, H. G., McMahon, C., Grounds, M. D., Shavlakadze, T. Effects of loaded voluntary wheel exercise on performance and muscle hypertrophy in young and old male C57Bl/6J mice: Exercise and muscle hypertrophy in old mice. Scandinavian Journal of Medicine and Science in Sports. 26 (2), 172-188 (2016).
- White, Z., et al. Voluntary resistance wheel exercise from mid-life prevents sarcopenia and increases markers of mitochondrial function and autophagy in muscles of old male and female C57BL/6J mice. Skeletal Muscle. 6 (1), 45 (2016).
- Murach, K. A., McCarthy, J. J., Peterson, C. A., Dungan, C. M. Making mice mighty: Recent advances in translational models of load-induced muscle hypertrophy. Journal of Applied Physiology. 129 (3), 516-521 (2020).
- Swallow, J. G., Garland, T., Carter, P. A., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C. Effects of voluntary activity and genetic selection on aerobic capacity in house mice (Mus domesticus). Journal of Applied Physiology. 84 (1), 69-76 (1998).
- Murach, K. A., et al. Late-life exercise mitigates skeletal muscle epigenetic aging. Aging Cell. 21 (1), 13527 (2022).
- Mackay, A. D., Marchant, E. D., Louw, M., Thomson, D. M., Hancock, C. R. Exercise, but not metformin prevents loss of muscle function due to doxorubicin in mice using an in situ method. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9163 (2021).
- Godwin, J. S., Hodgman, C. F., Needle, A. R., Zwetsloot, K. A., Andrew, R. Whole-body heat shock accelerates recovery from impact- induced skeletal muscle damage in mice. Conditioning Medicine. 2 (4), 184-191 (2020).
- Wen, Y., et al. MyoVision: Software for automated high-content analysis of skeletal muscle immunohistochemistry. Journal of Applied Physiology. 124 (1), 40-51 (2018).
- Manzanares, G., Brito-da-Silva, G., Gandra, P. G. Voluntary wheel running: Patterns and physiological effects in mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 52 (1), 7830 (2019).
- Bartling, B., et al. Sex-related differences in the wheel-running activity of mice decline with increasing age. Experimental Gerontology. 87, 139-147 (2017).
- Zwetsloot, K. A., Westerkamp, L. M., Holmes, B. F., Gavin, T. P. AMPK regulates basal skeletal muscle capillarization and VEGF expression, but is not necessary for the angiogenic response to exercise: AMPK and the skeletal muscle angiogenic response to exercise. The Journal of Physiology. 586 (24), 6021-6035 (2008).
