Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Primer Dismenore Olan Sıçanlarda Sıvı Kromatografi-Tandem Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Ham ve İşlenmiş Siperi Rizom Örneklerinin Analizi

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

Summary

Burada, ham ve işlenmiş Cyperi rizoma (CR) örneklerinin karşılaştırmalı bir analizi, primer dismenore olan sıçanlarda ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometresi (UPLC-MS / MS) kullanılarak sunulmuştur. Metabolitlerin ve örnek bileşenlerinin kan düzeylerindeki değişiklikler, CR ile tedavi edilen sıçanlar ve sirke (CRV) ile işlenmiş CR arasında incelendi.

Abstract

Cyperi rizomu (CR) jinekolojide yaygın olarak kullanılmaktadır ve Çin'deki kadın hastalıklarının tedavisinde kullanılan genel bir ilaçtır. Sirke ile işlendikten sonra CR'nin analjezik etkisi arttığından, sirke ile işlenen CR (CRV) genellikle klinik olarak kullanılır. Bununla birlikte, analjezik etkinin sirke işleme ile arttırıldığı mekanizma belirsizdir. Bu çalışmada, dismenore ile CR ile tedavi edilen ve CRV ile tedavi edilen sıçanlar arasındaki eksojen bileşenlerin ve metabolitlerin kan düzeylerindeki değişiklikleri incelemek için ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografitandem kütle spektrometresi (UPLC-MS / MS) tekniği kullanılmıştır. Sonuçlar, bu sıçanların kanında 15 bileşenin ve iki metabolitin farklı seviyelerini ortaya çıkardı. Bunlar arasında, CRV grubundaki (-)-myrtenol ve [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroksi-1,4,7,7-tetrametilbisiklo [2.2.1]hept-2-yl]asetik asit seviyeleri CR grubundan oldukça yüksekti. CRV, proinflamatuar, trombosit agregasyonu ve vazokonstriksiyon aktiviteleri ile 2 seri prostanoidlerin ve 4 seri lökotrienlerin seviyesini azaltmış ve arakidonik asit ve linoleik asit metabolizmasını ve doymamış yağ asitlerinin biyosentezini modüle ederek analjezik etkiler sağlamıştır. Bu çalışma, sirke işlemenin CR'nin analjezik etkisini arttırdığını ve CRV'nin etki mekanizmasını anlamamıza katkıda bulunduğunu ortaya koymuştur.

Introduction

Primer dismenore (PD) klinik jinekolojide en sık görülen durumdur. Üreme sisteminde pelvik patoloji olmadan adet öncesi veya sırasında sırt ağrısı, şişlik, karın ağrısı veya rahatsızlık ile karakterizedir1. Prevalansı ile ilgili bir rapor, öğrencilerin% 85.7'sinin PD2'den muzdarip olduğunu göstermiştir. Düşük doz oral kontraseptifler standart tedavidir, ancak derin ven trombozu gibi yan etkileri giderek daha fazla dikkat çekmektedir3. Oral kontraseptif kullanıcılar arasında derin ven trombozu prevalansı 1.000 kadında >1'dir ve risk ilk 6-12 ay boyunca ve 40 yaşından büyük kullanıcılarda en yüksektir4.

Geleneksel Çin tıbbında (TCM) uzun süredir kullanılan Cyperi rizomu (CR), Cyperaceae familyasından Cyperus rotundus L.'nin kurutulmuş köksapından türetilmiştir. CR adet bozukluklarını düzenler ve depresyon ve ağrıyı hafifletir5. CR jinekolojide yaygın olarak kullanılır ve kadın hastalıklarını tedavi etmek için genel bir ilaç olarak kabul edilir6. Sirke (CRV) ile işlenen CR tipik olarak klinik olarak kullanılır. CR ile karşılaştırıldığında, CRV menstrüasyonun ve ağrının giderilmesinde gelişmiş düzenleme gösterir. Modern çalışmalar, CR'nin siklooksijenaz-2'yi (COX-2) ve ardından prostaglandinlerin (PG'ler) sentezini inhibe ettiğini ve böylece bir anti-enflamatuar etki elde ettiğini göstermiştir. Bu arada, CR yan etkileri olmayan analjezik bir etki gösterir7, bu da CR'yi dismenore hastaları için iyi bir seçim haline getirir. Bununla birlikte, menstrüasyonun düzenlenmesinin ve CRV ile ağrı kesici sağlanmasının altında yatan mekanizma belirsizdir. CR araştırması esas olarak aktif kimyasal bileşenlerindeki ve anti-enflamatuar, antidepresan ve analjezik etkileri gibi farmakolojik aktivitelerindeki değişikliklere odaklanmıştır 8,9,10,11,12.

TCM'nin bileşenleri karmaşık olmasına rağmen, kana emilirler ve etkili olmaları için belirli bir kan konsantrasyonuna ulaşmaları gerekir13. TCM'nin aktif bileşenlerinin taranmasının kapsamı, kanda bileşen belirleme stratejisi kullanılarak daraltılabilir. Kimyasal bileşenlerin in vitro olarak incelenmesinde körlükten kaçınılabilir ve bireysel bileşenlerin incelenmesinde tek taraflılıktan kaçınılabilir14. Kandaki CR ve CRV bileşimlerini karşılaştırarak, işlenmiş CR'nin aktif bileşenlerindeki değişiklikler etkili ve hızlı bir şekilde tespit edilebilir. İlaç etkinliği, bir ilacın vücudu etkilediği süreçtir. İlacın etki mekanizması ile ilişkili olabilecek vücudun metabolik tepkisine bağlı olarak ilaç bileşenlerindeki değişiklikler metabonomiklerle belirlenebilir. Metabonomik, geleneksel Çin tıbbının genel etkinliğini belirlemekle tutarlı olan genel ve dinamik metabolik yanıtları ölçmeyi amaçlamaktadır15. Ayrıca, metabolitler, fenotip16 ile en yakından ilişkili olan gen ekspresyonunun nihai ürünüdür. Bu nedenle, metabonomikler PD tedavisinde CR ve CRV arasındaki metabolik yolaklardaki farklılıkları araştırmak için uygun olabilir. sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometrisi (LC-MS / MS) tabanlı hedefsiz metabolomik, yüksek verim, yüksek hassasiyet ve yüksek çözünürlük ile karakterizedir ve birçok farklı küçük moleküler bileşeni ölçmek için kullanılabilir17,18 . Bu yöntem aynı anda kana emilen endojen metabolitleri ve eksojen bileşenleri belirleyebilir. Metabonomik, TCM19, ilaç toksikolojisi 20, sağlık yönetimi21, spor22, gıda23 ve diğer alanlardaki çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

Bu çalışmada, CRV'nin analjezik etkilerinin mekanizmalarını ortaya çıkarmak için LC-MS/MS bazlı hedefsiz metabolomikler kullanılarak CR ile tedavi edilen dismenore model sıçanlar arasında kana emilen ekzojen bileşenler ile endojen metabolitlerdeki farklılıklar ölçülmüştür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanlarla ilgili tüm deneyler, TCM Chongqing Enstitüsü Deney Etik Komitesi'nin onayıyla gerçekleştirildi. Bu deneyde 8-10 haftalık ve 200 g ± 20 g ağırlığında yirmi dört dişi Sprague Dawley sıçanı (SD) kullanılmıştır.

1. Ekstraksiyonun hazırlanması

  1. Hesaplama
    1. CR veya CRV ekstraktını 3 gün boyunca altı Sprague-Dawley sıçanından (10 g / [kg ∙ gün]) oluşan bir tedavi grubuna uygulamayı planlayın. 1 g / mL'lik bir CR veya CRV ekstrakt konsantrasyonu kullanın (ekstraktın 1 mL'si 1 g bitkiden elde edilir).
      NOT: CR dozu 6-10 g'dır. Bu çalışmada dozaj olarak maksimum 10 g doz kullanılmıştır. Yetişkin bir kişinin ortalama ağırlığı 60 kg olduğundan, yetişkin dozu 0.1667 g / kg'dır. Ağırlık dönüştürme algoritması24'e göre, insanlar ve sıçanlar arasındaki doz dönüşüm katsayısı 6.3 olduğundan, sıçanlar için dozaj 1.05 g / kg'dır. İlaç dozu, sıçanlar için 10 kat artarak 10.5 g / kg'a yükseltildi. Dozaj, hesaplama kolaylığı ve gerçek deney için 10 g / kg olarak ayarlanmıştır. Örneğin, hesaplamaya göre, toplam 36 g CR veya CRV'ye ihtiyaç duyulursa, Çin bitkisel ilacı en az iki kez hazırlanmalıdır. Böylece, 200 g CR gerekli olmuştur - CR olarak 100 g CR kullanılmış ve 100 g CR CRV'ye işlenmiştir.
    2. Denklemi kullanarak sıçan başına uygulanacak CR veya CRV hacmini hesaplayın (1):
      V = 10 g/(kg∙gün) × 200 g/(1 g/mL) = 2 mL (1)
  2. CRV'nin işlenmesi
    1. 100 g CR ve 20 g sirke (>5.5 g asetik asit / 100 mL) iyice karıştırın ve 12 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: CR'nin iç kısmının 12 saat sonra sirke ile nemlendirilmesini sağlamak için, CR ve sirke karıştırıldı, iyice karıştırıldı ve daha sonra iç kısım nemli olana kadar tekrar karıştırıldı.
    2. Karışımı bir demir tavada 110-120 ° C'de 10 dakika karıştırın-kızartın. Ardından, karışımı çıkarın ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
      NOT: CR'nin kavurmasını önlemek için, ısıtma sırasında sürekli karıştırmak gerekir. İşlenen CRV çok ıslaksa, 60 ° C'de kurutulabilir. CR'nin yüzeyi sepya olduğunda, kızartma durdurulabilir.
  3. Çıkarma
    1. CR özü
      1. CR'ye 10 kez (CR miktarı) saf su ekleyin ve 2 saat bekletin. Islatma sırasında tıbbi malzemelerin sıvı seviyesinin altında olduğundan emin olun.
        NOT: CR'nin ekstraksiyondan önce sadece ikiye bölünmesi gerekir. Islatmanın amacı, aktif bileşenleri daha etkili bir şekilde çıkarmaktır. Islatma işlemi esastır.
      2. Su ve ilaç karışımını yüksek ateşte kaynatın ve 20 dakika kısık ateşte kaynatın. Bir filtre bezi (100 ağ) ile filtreleyin ve filtreyi toplayın.
        NOT: Kaynatma sırasında, kaynatmadan önce yüksek bir ısı kullanılmış ve kaynamayı korumak için düşük bir ısı kullanılmıştır.
      3. Adım 1.3.1.2'yi bir kez tekrarlayın ve filtratları birleştirin.
      4. Ekstraktı döner bir buharlaştırıcı ile 1 g / mL'ye konsantre edin (orijinal ilaca dayanarak, konsantrasyon sıcaklığı 60 ° C'nin altında olmalıdır).
        NOT: CR'deki aktif bileşenler uçucudur, bu nedenle konsantrasyon sıcaklığı 60 °C'den yüksek olmamalıdır.
    2. CRV özü
      1. CR ayıklama yöntemiyle aynı adımları (1.3.1.1-1.3.1.3) gerçekleştirin.
    3. Test için CR özü
      1. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 500 μL CR ekstraktı ve 500 μL metanol pipet ve karıştırmak için 30 sn boyunca girdap.
        NOT: Metanol ve su karışımı, aktif bileşenleri daha iyi ekstrakte eder. Ekstrakt, test için doğrudan filtrelenmemelidir.
      2. Her numuneyi 4 °C'de 1.6502 × g'da 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı filtreleyin ve ardından test için numune şişesine aktarın.
        NOT: Metanol ve ekstrakt karışımının yüksek hızlı santrifüjlenmesinden sonra, süpernatant, filtrasyon olmadan belirlenmek üzere doğrudan numune şişesine aktarılabilir. Santrifüjleme işlemi tarafından üretilen ısı nedeniyle, kriyojenik bir santrifüj kullanılması tercih edilir.
    4. Test için CRV özü
      1. CRV özetini sınamaya hazırlamak için 1.3.3.1-1.3.3.2 adımlarını gerçekleştirin.

2. Hayvanlar

  1. Hesaplama
    1. 50 mg östradiol benzoat alın ve 50 mg / mL'lik bir çözelti hazırlamak için 1 mL zeytinyağına ekleyin. 50 mg oksitosin alın ve 1 mg / mL'lik bir çözelti hazırlamak için 50 mL normal saline ekleyin.
      NOT: Estradiol benzoat ve oksitosinin intraperitoneal enjeksiyonunun dozu 10 mg / (kg ∙ gün) 'dür. Estradiol benzoat zeytinyağında çözülür ve oksitosin normal salin içinde çözülür. Estradiol benzoatın zeytinyağında çözünmesi kolay değildir ve çözünmeyi hızlandırmak için ultrasonla tedavi edilebilir. Hem östradiol benzoat hem de oksitosin çözeltileri günlük olarak hazırlanmalıdır.
    2. Sıçan başına uygulanacak östradiol benzoat çözeltisinin hacmini hesaplayın (yani, V = 10 mg / [kg ∙ gün] × 200 g / [1 g / mL] = 2 mL). Sıçan başına uygulanacak oksitosin çözeltisinin hacmini hesaplayın (yani, V = 10 mg / [kg ∙ gün] × 200 g / [1 g / mL] = 2 mL).
  2. Hayvan gruplama ve yönetimi
    NOT: Yönetim içinon gün süre verilmiştir 25,26. Tedavi sırasında, sıçanların standart chow ve suya sınırsız erişimi vardı. Oksitosin uygulamasından sonraki 30 dakika içinde, her sıçanın kıvranma aktivitesi izlendi. PD sıçan modeli, model sıçanların uterus kasılması, bir uzuv rotasyonu, arka ekstremite uzantısı, içi boş bir gövde ve abdominal kasılması26'yı içeren büküm tepkileriyle kanıtlandığı gibi, başarıyla geliştirilmiştir.
    1. 24 dişi Sprague-Dawley sıçanını (SD sıçanlar, 8-10 haftalık, 200 g ± 20 g ağırlığında) rastgele kontrol, model, CR ve CRV'de dört gruba ayırın ve 7 gün boyunca besleyin.
    2. Hayvan yönetimi
      1. Model, CR ve CRV gruplarındaki sıçanlara her gün 2 mL östradiol benzoat çözeltisi enjekte ederek intraperitoneal olarak enjekte edilir. Kontrol grubundaki sıçanlara intraperitoneal olarak 2 mL normal salin enjekte edin.
      2. 8. günden itibaren 2.2.2.1 adımını tamamlayın. Daha sonra, CRV grubundaki sıçanlara intragastrik olarak 2 mL CRV ekstresi, CR grubundaki sıçanlara 2 mL CR ekstresi ve kontrol ve model gruplarındaki sıçanlara 2 mL normal salin uygulayın.
      3. 10. günde, 2.2.2.2 adımını tamamlayın. Daha sonra, model, CR ve CRV gruplarındaki sıçanlara 2 mL oksitosin çözeltisi ve kontrol grubundaki sıçanlara 2 mL normal salin ile intraperitoneal olarak enjekte edin.
    3. Oksitosin enjeksiyonundan sonraki 30 dakika içinde sıçanların kıvrılma sürelerini kaydedin.
  3. Örnek toplama
    1. Abdominal aort kan örneklerini toplayın, uterusu hızlı ve tamamen çıkarın ve uterus duvarına yapışan bağ dokusunu ve yağları dikkatlice ayırın.
      NOT: Kan, son dozdan sonra 1 saat içinde toplandı.
    2. Rahim dokusunu korumak ve sıvı azota aktarmak için mikrosantrifüj tüpleri kullanın. Doku örneklerini -80 °C'de saklayın.
    3. Kan örneklerini 4.125 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin. Serum içeren süpernatanı çıkarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.502 × g'da santrifüj yapın. Serumu santrifüj edin ve daha sonra depolama için tüpte -80 ° C'de tutun.
      NOT: Kan örnekleri yeniden işlenmek üzere oda sıcaklığında 1 saat bekletilmelidir.
  4. Numune işleme
    1. Serum örnekleri
      1. Bir mikrosantrifüj tüpüne 400 μL metanol ve 200 μL serum koyun ve karıştırmak için 30 s boyunca vorteks koyun. Her numuneyi 4 °C'de 16.502 × g'da 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Toplama ve filtrelemeden sonra numune şişelerini süpernatantla doldurun. Test için kalite kontrol numuneleri hazırlamak üzere her numunedeki tüm süpernatantları aynı hacimle karıştırın.
    2. Rahim dokusu örnekleri
      1. İpsilateral segmentten 100 mg uterus dokusu alın ve dokuz kat normal salin hacmi ile öğütün. Homojenatı 4.125 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı toplayın. Süpernatantı test için 4 ° C'de veya aynı gün test edilmeyecek ise -80 ° C'de bir buzdolabına yerleştirin.
      2. Normal salin, doku ve çelik bilyeleri 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, mikrosantrifüj tüpünü 3-5 s boyunca sıvı azot içine koyun ve ardından dokuyu taşlama için bir doku öğütücüye koyun.
  5. Numune testi
    1. Sıçan örneklerinin uterus dokularındaki PGF2α ve PGE2 içeriğini ölçmek için enzime bağlı bir immünosorbent testi (ELISA) kullanın.
      NOT: PGE 2 içeriğini ölçmek için sıçan PGE2 ELISA kiti kullanıldı ve PGF 2α seviyesini ölçmek için sıçan PGF2α ELISA kiti kullanıldı. Ayrıntılı adımlar üreticinin talimatlarında bulunabilir. Kitin detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.
    2. Serum örneğini, CR ekstraktını ve CRV ekstraktını UPLC-MS/MS kullanarak değerlendirin.
      1. UPLC için, bir C18 sütunu (2.6 μm, 2.1 mm x 100 mm) ve% 0.1 formik asit içeren mobil faz A ve asetonitril içeren mobil faz B ile ikili gradyan yöntemi kullanın. Elüsyon gradyanını aşağıdaki gibi ayarlayın: 0 dakikadan 1 dakikaya,% 15 B; 1 dakika ila 8,5 dakika,% 15 ila% 85 B; 8,5 dakikadan 11,5 dakikaya,% 85 B; 11,5 dakika ila 11,6 dakika,% 99 ila% 1 B; ve 11,6 dakika ila 15 dakika arasında,% 15 B. Akış hızını 0,35 mL / dak ve enjeksiyon hacmini 2 μL'ye ayarlayın.
      2. MS için sıcaklığı 600 °C'ye, perde gazı (CUR) akış hızını 0,17 MPa'ya ve hem kılıf hem de yardımcı gaz akış hızlarını 0,38 MPa'ya ayarlayın. Pozitif iyon modunun ve negatif iyon modunun iyon püskürtme voltajını sırasıyla 5,5 kV ve -4,5 kV, kümelenme potansiyeli (DP) voltajını 80 V veya -80 V, çarpışma enerjisini (CE) 40 eV veya -25 eV ve çarpışma enerjisi süperpozisyonu (CES) 35 eV ± 15 eV olarak ayarlayın.
      3. UPLC-MS/MS kullanarak üreticinin protokolünü izleyerek testi gerçekleştirin. MS'i 50-1.000 m/z kütle aralığında gerçekleştirin.
      4. UPLC-MS/MS sonuçlarını, algılama modunun bilgiye bağımlı alımı, çoklu kütle hatası filtresi ve dinamik arka plan çıkarımı ile birlikte eşleşen iş istasyonu programını kullanarak elde edin. Geleneksel yaklaşımı doğrulamak amacıyla UPLC-MS/MS ekipmanının tekrarlanabilirliğini ve kararlılığını test etmek için havuzlanmış serumun kalite kontrol örneklerini kullanın. Araştırma numunelerinden önce, art arda dört çalışma için kalite kontrol numunelerini enjekte edin ve ardından her beş serum örneğinden sonra enjekte edin.

3. Veri işleme

  1. Veri hazırlama
    1. Ham verileri mzXML biçimine dönüştürmek için dönüştürme yazılımı kullanın. Her numunenin toplam iyon akımı (TIC) verilerini normalleştirin.
      NOT: XCMS üzerine kurulu dahili bir R tabanlı uygulama (www.lims2.com), entegrasyon, hizalama, ayıklama ve tepe algılama bilgilerini analiz etmek içinkullanılmıştır 27.
    2. Özel bir MS2 veritabanı (www.lims2.com) kullanarak metabolit ek açıklaması gerçekleştirin. Ek açıklama eşiğini 0,328 olarak ayarlayın.
      NOT: Endojen metabolitler her grupta tanımlandı.
  2. Ana bileşen analizi ve ortogonal kısmi en küçük kare diskriminant analizi
    1. Ana bileşen analizini (PCA) ve modellemeyi gerçekleştirmek için analiz yazılımını kullanın. Metabolitlerin standartlaştırılmış verilerini analiz yazılımına aktarın. Ardından, analiz modelini oluşturmak için otomatik sığdırmayı kullanın. Son olarak, PCA'nın skor dağılım grafiğini elde etmek için skoru kullanın.
      NOT: Her grubun kümelenmesi PCA'nın skor dağılım grafiği ile elde edilmiştir. PCA, esas olarak numuneleri müdahale etmeden boyut küçültme yoluyla gruplandıran denetimsiz bir analiz modudur.
    2. Ortogonal kısmi en küçük kare diskriminant analizini (OPLS-DA) gerçekleştirmek için analiz yazılımını kullanın.
      1. CR ve CRV gruplarındaki metabolitlerle ilgili standartlaştırılmış verileri analiz yazılımına aktarın.
      2. Verileri CR grubundan oluşturulan CR grubuna alın ve verileri CRV grubundan oluşturulan CRV grubuna alın.
        NOT: OPLS-DA denetimli bir analiz modudur ve örneklerin gruplandırılması gereklidir.
      3. Ardından, analiz modelini oluşturmak için otomatik sığdırmayı kullanın ve OPLS-DA'nın puan dağılım grafiğini elde etmek için puanı kullanın. Son olarak, OPLS-DA'daki projeksiyon (VIP) değerindeki değişken anlamlılığı elde etmek için VIP'yi kullanın.
        NOT: CR ve CRV gruplarındaki metabolitlerin projeksiyon (VIP) değerlerindeki değişken anlamlılık OPLS-DA aracılığıyla elde edilmiştir.
  3. Potansiyel diferansiyel metabolitlerin tanımlanması
    1. Adım 3.2.2.3'te VIP değerleri 1'den büyük olan metabolitleri eleyin.
    2. Öğrencinin t-testi tarafından adım 3.3.1'de taranan metabolitlerin P değerini hesaplamak için istatistiksel yazılım kullanın.
      NOT: CR ve CRV gruplarındaki potansiyel diferansiyel metabolitlerdeki anlamlı farklılıklar bir Student'ın t-testi ile belirlendi. Potansiyel diferansiyel metabolitler, bir Student'ın t-testi p-değeri 0.05 < ve projeksiyonda (VIP) 1'den büyük değişken bir öneme sahip olanlardı. Temsil, volkanik bir arsa kullanılarak gerçekleştirildi.
  4. Diferansiyel metabolitlerin tanımlanması
    1. Adım 3.3'te potansiyel diferansiyel metabolitleri inceleyin. Bu diferansiyel metabolitleri tanımlamak için adım 3.1.2'nin sonuçlarını kullanın.
      NOT: Az sayıda potansiyel diferansiyel metabolit tanımlanmıştır ve bunlar aday diferansiyel metabolitler haline gelmiştir.
    2. KEGG veritabanında eşleştirilecek diferansiyel metabolitleri eleyin. CR ve CRV gruplarındaki diferansiyel metabolitlerdeki değişiklikleri bir ısı haritası çizerek gösterin.
      NOT: Az sayıda aday diferansiyel metabolit eşleştirildi ve bunlar diferansiyel metabolitler haline geldi.
  5. Potansiyel metabolik yolakların incelenmesi
    1. Farklı metabolitleri Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca) veritabanına yükleyin.
    2. Potansiyel metabolik yolları elde etmek için Yol Analizi'ni kullanın.
      NOT: Potansiyel metabolik yollar CR ve CRV gruplarında elde edildi. P değeri ve etki değeri, kritik yolların seçiminde çok önemli iki göstergeydi. P değeri, etki değerinden daha önemliydi. Anlamlılık, 0.05 < bir P değeri ile tanımlandı; Daha büyük etki değerleri daha iyi korelasyonlarla ilişkilendirildi.
    3. Farklı metabolitleri KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) veritabanına yükleyerek potansiyel metabolik yolları analiz edin.
      NOT: Metabolik yolun fonksiyonu ile PD arasındaki ilişki de göz önünde bulundurulmalıdır. Kritik metabolik yolaklar elde edildi.
  6. Kana emilen bileşenlerin tanımlanması
    1. Şirket içi MS2 veritabanı (www.lims2.com), İnsan Metabolom Veritabanı (HMDB) ve Massbank ve Chemspider veritabanlarını kullanarak CR ve CRV ekstraktlarındaki kimyasal bileşenleri tanımlayın.
    2. CR ve CRV gruplarında kana emilen bileşenleri belirleyin ve CR ve CRV grupları arasındaki bileşenleri karşılaştırın.
      NOT: Kana emilen bileşenler CR veya CRV gruplarında tespit edilmelidir, ancak kontrol grubunda tespit edilemez.
  7. İstatistiksel analiz
    1. Tek değişkenli analiz (UVA) ve varyans analizi (ANOVA) ve Öğrencinin t-testi dahil olmak üzere çok değişkenli istatistiksel yöntemleri kullanarak verileri analiz edin.
      NOT: Deneysel bilgiler ortalama ± standart sapma (±SD) olarak istatistiksel yazılım kullanılarak sunulmuştur. P < 0.01 oldukça anlamlı bir fark olarak kabul edildi ve P < 0.05 anlamlı bir farkı temsil etti28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dismenore modeli deneyinin analizi
Kontrol grubunda 30 dakika içinde kıvranan bir yanıt yoktu, çünkü bu sıçanlara ağrıya neden olmak için intraperitoneal olarak oksitosin ve östradiol benzoat enjekte edilmedi. Model, CR ve CRV gruplarındaki sıçanlar, oksitosin enjeksiyonunu takiben önemli kıvranma reaksiyonları gösterdi. Bu sonuçlar, dismenoreyi indüklemek için östradiol benzoat ve oksitosin kombinasyonunun etkinliğini göstermektedir. Model ve kontrol grupları arasındaki PGF 2α, PGE 2 ve PGF2α/PGE 2 düzeylerindeki farklılıklar anlamlı bulunmuştur (P < 0.001, P < 0.05), modelin etkinliğini göstermiştir (Şekil 1).

Figure 1
Şekil 1: Rahim dokusundaki PGF 2 α ve PGE2 içeriği ve her gruptaki kıvranma sayısı. (A) PGF2α her gruptaki uterus dokusundaki içeriktir. (B) Her grupta uterus dokusundaki PGE2 içeriği. (C) Her gruptaki uterus dokusundaki PGF 2 α/PGE2 içeriği. (D) Her gruptaki kıvranan sayı. Sütunlar, dört gruptan (grup başına altı fare) ortalama ± SEM'i temsil eder. * P < 0.05 veya ** P < 0.01, model grubuna kıyasla anlamlı bir farkı temsil eder ve Δ P < 0.05 veya ΔΔ P < 0.01, CR grubuna kıyasla anlamlı bir farkı temsil eder. Model, CR ve CRV gruplarındaki sıçanlar, oksitosin enjeksiyonunu takiben önemli bir kıvrılma reaksiyonu gösterdi. Kısaltmalar: PG = prostaglandin; CR = Cyperi köksapı; CRV = Sirke ile işlenmiş CR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

PGF 2α ve PGF2α/PGE2 konsantrasyonları CRV ve CR gruplarında azalmış, CRV grubunda ise bu azalma daha belirgin bulunmuştur. CRV ve CR grupları arasında PGF2α ve PGF2α/PGE2 konsantrasyonlarında anlamlı (P < 0.001 ve P < 0.05) farklılıklar da vardı. Model grupla karşılaştırıldığında, PGE2 konsantrasyonu CRV ve CR gruplarında (P < 0.001) anlamlı olarak daha yüksekti ve seviye CRV grubunda en fazla artmıştır.

Kalite kontrol
BPC kromatografik piklerinin tutma süreleri ile kalite kontrol numunelerindeki sinyal yoğunlukları arasında iyi bir korelasyon gözlenmiş, bu da yüksek düzeyde cihaz stabilitesi ve dikkat çekici derecede tutarlı veri kalitesi göstermiştir (Ek Dosya 1-Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2). Ayrıca, tüm kalite kontrol numuneleri ±2 standart sapma içinde (Şekil 2A,B) ve kalite kontrol numuneleri arasındaki korelasyon 0,7'den büyüktü (Şekil 2C,D). Bu sonuçlar, prosedürün güvenilir olduğunu ve sonuçların güvenilir olduğunu göstermektedir.

Figure 2
Şekil 2: Kalite kontrol numunelerinin PCA-X tek boyutlu dağılımı. (A) Pozitif mod, (B) negatif mod; (C) pozitif modda ve (D) negatif modda kalite kontrol numunelerinin korelasyon analizi. Tüm kalite kontrol numuneleri ±2 standart sapma içerisindeydi ve kalite kontrol numuneleri arasındaki korelasyonlar 0.7'den büyüktü. Bu sonuçlar, prosedürün güvenilir olduğunu ve bilgilerin güvenilir olduğunu göstermiştir. Kısaltmalar: PC = ana bileşen; PCA = ana bileşen analizi; kalite kontrol; CR = Cyperi köksapı; CRV = Sirke ile işlenmiş CR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ana bileşen analizi
Şekil 3'te gösterildiği gibi, apsis PC (1) ilk ana bileşenlerin puanlarını gösterirken, ordinat PC (2) ikinci ana bileşenlerin puanlarını göstermiştir. Şekilde, yeşil daire kontrol grubunu, kırmızı daire model grubunu, mavi daire CR grubunu, beyaz daire CRV grubunu ve pembe daire kalite kontrol grubunu gösterir.

Figure 3
Şekil 3: PCA'nın skor dağılım grafiği . (A) Pozitif mod ve (B) negatif mod. Kalite kontrol numuneleri üst üste biner, bu da cihazın çok kararlı olduğunu gösterir. Her grup kendi alanında dağıtılır, yalnızca CR grubu ve CRV grubunun yolları zaman zaman kesişir. Kısaltmalar: PC = ana bileşen; PCA = ana bileşen analizi; QC = kalite kontrol; CR = Cyperi köksapı; CRV = Sirke ile işlenmiş CR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

PCA analiz sonuçları, CR ve model gruplarının kümelerinin hem pozitif hem de negatif iyon modlarında anlamlı olarak ayrıldığını göstermiştir. Kümeler, CRV ve model grupları arasında pozitif ve negatif iyon modlarında anlamlı olarak ayrıldı. Kalite kontrol, model ve kontrol grupları diğer tedavi gruplarından (CR, CRV) ayrıldı. CR ve CRV grupları zaman zaman pozitif iyon modunda çakıştı. Negatif iyon modunda, her grup önemli ölçüde ayrıldı.

Ortogonal kısmi en küçük kareler yöntemi diskriminant analizi
OPLS-DA, metabolik farklılıkları taramak için kullanıldı. OPLS-DA dağılım grafiği, tüm örneklerin %95 güven aralığında (Hotelling'in T-kare elipsi) olduğunu gösterdi. Şekil 4A,C, CR ve CRV gruplarının ayrıldığını göstermektedir. Model aşırı uyumu, permütasyon testi (n = 200) kullanılarak test edildi ve modelin istatistiksel anlamlılığı değerlendirildi. Şekil 4B, D'de, ordinatR2Y değerini veya Q2 değerini gösterir ve apsis, değiştirme tutma değerini gösterir. R2Y yeşil noktayla, Q2 mavi kare noktayla ve iki kesikli çizgi karşılık gelen regresyon çizgileriyle temsil edilir. Pozitif ve negatif modlarda,R2Y değerleri sırasıyla 0.8 ve 0.84 ve Q2 değerleri sırasıyla -0.59 ve -0.57 idi. Bu, modelin yüksek güvenilirliğini ve aşırı donanımın olmadığını gösterir.

Figure 4
Şekil 4: CRV grubuna karşı CR grubu için OPLS-DA modelleri. (A) pozitif modda ve (C) negatif modda dağılım grafiğini puanlayın. CR grubu için OPLS-DA modelinin (B) pozitif modda ve (D) negatif modda CRV grubuna karşı permütasyon testi. R 2Y, pozitif ve negatif modlarda sırasıyla 0.8 ve 0.84 ve Q2 sırasıyla -0.59 ve -0.57 idi. Bu, modelin yüksek güvenilirliğini ve aşırı uyma davranışının olmadığını gösterir. Kısaltmalar: OPLS-DA = ortogonal kısmi en küçük kareler diskriminant analizi; CR = Cyperi köksapı; CRV = Sirke ile işlenmiş CR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tek değişkenli istatistiksel analiz
Metabolik varyasyonları tanımlamak için tek değişkenli istatistiksel analizler yapıldı. VIP > 1 ve P < 0.05 standart taraması altında, pozitif ve negatif iyon modlarında sırasıyla 339 ve 394 potansiyel diferansiyel metabolitler tespit edildi. Şekil 5'te her noktanın farklı bir metabolite karşılık geldiği bir volkan grafiği gösterilmiştir. Ordinat, Öğrencinin t-testinin P değerini gösterir ve apsis, gruptaki her molekülün seviyesindeki çoklu değişiklikleri yansıtır. Dağılım boyutu, OPLS-DA modelinin VIP değerini temsil eder; VIP değeri, scatter'ın boyutuyla birlikte artar. Kırmızı noktalar bir artışı, mavi noktalar bir düşüşü ve gri önemli bir farkı göstermez.

Aday diferansiyel metabolitlerin kalitatif analizi, sekonder kütle spektrometrisi kullanılarak yapıldı. Pozitif moddaki 63 metabolitte (Ek Dosya 1-Ek Tablo 1) ve negatif moddaki 30 metabolitte (Ek Dosya 1-Ek Tablo 2) anlamlı değişiklikler gözlendi. Diferansiyel metabolitler KEGG ve HDMB veritabanları kullanılarak belirlendi. Doğru şekilde eşleşen bileşikler diferansiyel metabolitler olarak tanımlanmıştır ve bunlar Tablo 3 ve Tablo 4'te listelenmiştir.

Figure 5
Şekil 5: CRV grubuna karşı CR grubu için volkan grafiği. (A) Pozitif mod ve (B) negatif mod. Temsil edilen volkan grafiğinde, her nokta farklı bir metabolite karşılık gelir. Ordinat, Öğrencinin t-testinin P değerini gösterir ve apsis, gruptaki her maddedeki çoklu değişiklikleri yansıtır. Dağılım boyutu, OPLS-DA modelinin VIP değerini temsil eder. VIP değeri, scatter'ın boyutuyla birlikte artar. Kırmızı noktalar artışları, mavi noktalar düşüşleri ve gri önemli bir fark olmadığını gösterir. Kısaltmalar: OPLS-DA = ortogonal kısmi en küçük kareler diskriminant analizi; VIP = projeksiyonda değişken anlamlılık; CR = Cyperi köksapı; CRV = Sirke ile işlenmiş CR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Metabolit karşılaştırmaları
CR ve CRV grupları arasındaki diferansiyel metabolitlerin kantitatif değerlerinin Öklid mesafe matrisi hesaplandı ve diferansiyel metabolitler kapsamlı bir korelasyon yaklaşımı kullanılarak kümelendi.

Apsis farklı deney gruplarını temsil ederken, ordinat Şekil 6'daki göreceli seviyeyi temsil eder. Renk yamalarının yerleştirilmesi, her metabolitin diğerlerine göre nasıl ifade edildiğini gösterir. Pozitif iyon modunda, CR grubuyla karşılaştırıldığında, CRV grubundaki dört diferansiyel metabolitin seviyeleri artarken, 11 diferansiyel metabolitin seviyeleri azalmıştır. Negatif iyon modunda, CR grubuyla karşılaştırıldığında, CRV grubundaki dört diferansiyel metabolitin seviyeleri artmış ve 7 diferansiyel metabolitin seviyeleri azalmıştır.

Figure 6
Şekil 6: CRV grubu ile CR grubu arasındaki ısı haritası analizi . (A) Pozitif mod ve (B) negatif mod. Apsis, farklı deney gruplarını temsil eder ve ordinat göreceli ifade seviyelerini temsil eder. Renk yamalarının yerleştirilmesi, her metabolitin diğerlerine göre nasıl ifade edildiğini gösterir. Kısaltmalar: CR = Cyperi rhizome; CRV = Sirke ile işlenmiş CR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

CR grubu ile karşılaştırıldığında, CRV grubunda artmış metabolitler sfengozin 1-fosfat, nobiletin, gliserofosfokolin, lizopc (18: 1 (9z)), 2-hidroksi-6-pentadesilbenzoik asit, 9,10-epoksioktadesenoik asit, 13s-hidroksioktadekadienoik asit ve 2-metoksiestron iken, azalmış olanlar kortikosteron, indolasetik asit, glikolik asit, berberin, dibütil ftalat, retinol, lökotrien B4, prostaglandin J2, 21-hidroksipregnenolon, zeranol, homosistein, propynoik asit, stearik asit, dokosaheksaenoik asit, fenilasetilglisin, L-fenilalanin, estron glukuronid ve sitrik asit (Şekil 7).

Figure 7
Şekil 7: CRV ve CR gruplarındaki potansiyel metabolitlerin göreceli seviye eğilimleri . (A) Pozitif mod ve (B) negatif mod. Pozitif modda, CR grubuyla karşılaştırıldığında, CRV grubunda dört diferansiyel metabolitin seviyeleri artmış ve 11 seviyeleri azalmıştır. Negatif modda, CRV grubunda dört diferansiyel metabolitin seviyeleri artmış ve yedi diferansiyel metabolitin seviyeleri azalmıştır. Sütunlar, dört gruptan (grup başına altı fare) ortalama ± SEM'i temsil eder. * P < 0.05, ** P < 0.01 veya *** P < 0.01, CRV ve CR grupları arasında anlamlı bir farkı temsil eder. Kısaltmalar: CR = Cyperi rhizome; CRV = Sirke ile işlenmiş CR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

KEGG yol analizi
Diferansiyel metabolitlere açıklama eklendi ve KEGG yolları analiz edildi. Sonuçlar, diferansiyel metabolitlerin sırasıyla pozitif ve negatif modlarda dokuz yolla ilişkili olduğunu göstermiştir (Tablo 1 ve Tablo 2). Şekil 8'de, metabolik yolakların her biri kabarcık grafiğinde bir kabarcık ile temsil edilir ve daha önemli bir ölçek daha büyük bir etki faktörünü gösterir. Topoloji analizindeki faktörleri etkileyen yolun boyutu, kabarcık grafiğinin apsisi ve kabarcık boyutu ile temsil edilir. Kabarcık grafiğinin sırası ve kabarcık rengi, zenginleştirme analizinin P değerini gösterir (negatif doğal logaritmayı alarak, yani -ln (p)). Zenginleştirme derecesi daha önemlidir, P değeri daha küçüktür, ordinat değeri daha belirgindir ve renk daha koyu. P değeri ve etki değeri, kritik yolların seçiminde çok önemli iki göstergedir. Genel olarak, P değeri etki değerinden daha önemlidir.

Figure 8
Şekil 8: CRV grubu ile CR grubu arasındaki yol analizi . (A) Pozitif mod ve (B) negatif mod. Metabolik yolakların her biri kabarcık grafiğinde bir kabarcık ile temsil edilir. Kabarcık grafiğinin apsisi ve kabarcık boyutu, topoloji analizinde yolu etkileyen faktörlerin boyutunu gösterir. Kabarcık grafiğinin sırası ve kabarcık rengi, zenginleştirme analizinin P değerini gösterir. Anahtar metabolik yollar, doymamış yağ asitlerinin biyosentezini ve linoleik asit metabolizmasını içerir. Kısaltmalar: CR = Cyperi rhizome; CRV = Sirke ile işlenmiş CR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3 ve Tablo 4, fenilalanin metabolizması ve linoleik asit metabolizmasının yanı sıra doymamış yağ asitleri, fenilalanin, tirozin ve triptofanın biyosentezinin yanı sıra önemli farklılıklara sahip metabolik yolları göstermektedir. Metabolik yollar steroid hormon biyosentezi, sfingolipid ve arakidonik asit metabolizmasını içermesine rağmen, dismenore ile ilişkili anlamlı bir fark yoktu. Sonuçlar, linoleik asit metabolizmasının ve doymamış yağ asitlerinin biyosentezinin, CRV'nin artmış etkinliği ile ilişkili kritik metabolik yollar olduğunu göstermiştir.

Kana emilen bileşenler
CR ve CRV gruplarında sıçan serumunda CRV ve CR ekstraktlarından on beş bileşen ve iki metabolizma ürünü tespit edildi (Tablo 5). 17 bileşenin tümü pozitif iyon modunda bulundu.

İki grubun kan örneklerindeki göreceli bileşen seviyeleri, Student'ın t-testi kullanılarak karşılaştırıldı. Şekil 9'daki apsis, çeşitli deney gruplarını göstermektedir; ordinat, kütle spektrumunun tepki değerini temsil eder. Önemli farklılıklara sahip iki bileşen vardı. Analiz, bu iki bileşenin seviyelerinin CRV grubunda CR grubuna kıyasla yükseldiğini, 15 elementin seviyelerinin ise anlamlı bir değişiklik göstermediğini göstermiştir.

Figure 9
Şekil 9: CRV grubuna karşı CRV grubu için kana emilen bileşenler . CR ve CRV gruplarında sıçan serumunda CRV ve CR ekstraktlarından 15 bileşen ve iki metabolizma ürünü vardı. Analiz, CRV grubunda iki bileşenin kan düzeylerinin CR grubuna kıyasla arttığını, 15 bileşenin kan düzeylerinin ise anlamlı bir değişiklik göstermediğini göstermiştir. Bunlar arasında, CRV grubundaki (-)-myrtenol ve [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroksi-1,4,7,7-tetrametilbisiklo [2.2.1]hept-2-yl]asetik asit seviyesi CR grubundan oldukça yüksekti. * P < 0.05 veya ** P < 0.01, CRV grubu ile CR grubu arasında anlamlı bir farkı temsil eder. Kısaltmalar: CR = Cyperi rhizome; CRV = Sirke ile işlenmiş CR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Pozitif moddaki metabolik farklılıklar. Kısaltmalar: KEGG = Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi; VIP = projeksiyonda değişken anlamlılık; RT = bekletme süresi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: Negatif moddaki metabolik farklılıklar. Kısaltmalar: KEGG = Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi; VIP = projeksiyonda değişken anlamlılık; RT = bekletme süresi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: Pozitif modda metabolik yol analizi. Kısaltma: KEGG = Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 4 Negatif modda metabolik yol analizi. Kısaltma: KEGG = Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 5: Sıçan serumunda prototip bileşenlerin ve metabolitlerin tanımlanması. Not: M1 ve M2 metabolitlerdir; diğer bileşenler prototip bileşenlerdir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: BPC diyagramları ve çıplak farelerin kanına emilen bileşenlerin MS2 kromatogramı. Pozitif ve negatif modlarda tüm kalite kontrol numunelerinin BPC diyagramları; Sıçanların kanına emilen 17 bileşenin MS 2 kromatogramı: D-kafen, (-)-mirtenol, etilparaben, kalamenen, α-siperon, (+)-nootkaton, (1R,2S,3R,4R)-3-hidroksi-1,4,7,7-tetrametilbisiklo [2.2.1]hept-2-il]asetik asit, 4-(2-(2.2.1)-bisikloheptilmetil)benzoik asit, 10,12-peroksikalamenen, (1aS,10aR)-1a,5,9-trimetil-1a,3,6,10a-tetrahidrooksireno[4,5]siklodeka[1,2-b ]furan-10(2H)-bir, pterosin D, terresklik asit, Sugeonil asetat, 3-asetil-13-deoksifomenom, izokurcumenol, ligusiperonol, procurcumadiol. İkincil kütle spektrometrisi ile tanımlanan diferansiyel metabolitlerin yanı sıra pozitif ve negatif iyon modlarında HDMB ve KEGG veritabanları da dahil edilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TCM'lerin çok çeşitli ve farklı doğası nedeniyle, bu otlar bazen klinik uygulamada çalışmaz ve bu, TCM'lerin uygun olmayan şekilde işlenmesi ve kaynatılmasından kaynaklanabilir. TCM'nin mekanizmaları çağdaş bilim ve teknolojinin kullanımı ile daha belirgin hale gelmektedir29,30. Bu çalışma, PD model sıçanlarda hem CR hem de CRV'nin terapötik etkilere sahip olduğunu ve CRV'nin terapötik etkisinin daha önemli olduğunu göstermektedir. CRV'nin etki mekanizması, sirke işlemenin kana emilen CR bileşenlerini etkileyebileceği ve linoleik asit metabolizması ve doymamış yağ asitlerinin biyosentezi ile ilişkili olabileceği gerçeğiyle ilişkili olabilir. Şekil 10, CRV'nin ağrı kesici eyleminin potansiyel yollarını göstermektedir.

Figure 10
Şekil 10: CRV'nin artmış analjezik etkisinin mekanizmaları. Sonuçlar, kanda 15 bileşen ve iki metabolitin bulunduğunu gösterdi. Bunlar arasında, CRV grubunda (-)-myrtenol ve [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroksi-1,4,7,7-tetrametilbisiklo[2.2.1]hept-2-yl]asetik asit seviyeleri CR grubuna göre oldukça yüksekti. CRV, ARA'dan yapılan 2 serisi prostanoidlerin ve 4 serisi lökotrienlerin seviyesini azaltabilir ve arakidonik asit metabolizmasının modülasyonu, doymamış yağ asitlerinin biyosentezi ve linoleik asit metabolizması yoluyla analjezik etkiler elde edebilir. Kısaltmalar: ARA = arakidonik asit; COX = siklooksijenaz; LA = linoleik asit; PUFA = çoklu doymamış yağ asitleri; GLA = γ-linolenik asit; DGLA = dihomo-γ-linolenik; PD = primer dismenore; PG = prostaglandin; LT = lökotrienler; TX = tromboksan; SDA = stearidonik asit; ETA = eikosatetraenoik asit; EPA = eikosapentaenoik asit; CR = Cyperi köksapı; CRV = Sirke ile işlenmiş CR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Deney sırasında alınacak önlemler
CR'nin etkili bileşeninin yağı uçucu olduğundan, CR'nin ekstraksiyon süresi 20 dakikayı geçmemeli ve kaynadığında, konsantrasyon sırasında 60 ° C'yi aşmayan bir sıcaklıkta düşük bir ateşte olmalıdır. Etkili bileşenlerin başarılı bir şekilde ekstraksiyonunu sağlamak için, otlar kaynatmadan önce en az 2 saat suya batırılmalıdır, böylece ıslatma tamamlandığında otlar ıslak olur. CR işlemi sırasında, sirke bitkilerle iyice karıştırılmalıdır, böylece sirke tamamen içine nüfuz edebilir. Sirke hacmi bitkileri iyice ıslatmak için çok düşükse, sirkeyi seyreltmek için az miktarda su eklenebilir ve daha sonra sirke bitkilerle tamamen karıştırılabilir. Karıştırma tamamlandığında, otlar tüm sirkeyi emer. Sirke asetik asit içerdiğinden, kimyasal reaksiyondan kaçınmak için karışım demir ile temas etmemelidir.

Sıçan deneyinde, östradiol benzoatın ilk intraperitoneal enjeksiyonu 10. günde verilir, daha sonra CR veya CRV ekstraktının intragastrik uygulaması verilir ve son olarak oksitosinin intraperitoneal enjeksiyonu uygulanır. İntraperitoneal oksitosin enjeksiyonundan sonra, hayvan 30 dakika boyunca gözlenir ve hemen kan alınır. Genellikle, kan konsantrasyonu, intragastrik uygulama13'ten sonra 1 saat içinde zirveye ulaşır, bu da kan almak için en iyi zamandır.

Ekstrakt ve serum numuneleri LC-MS/MS ile belirlenirken, aynı bileşenin farklı numunelerde bekletme süresinin tutarlı olmasını sağlamak için aynı partide belirlenmelidir. Bu deneyde, bileşenlerin tanımlanması zor bir noktaydı. Endojen metabolitler için nispeten olgun bir veri tabanı kullanılabilmesine rağmen, kana emilen bileşenleri tanımlamak için eşleşen bir veritabanı yoktu, bu nedenle tanımlamada daha fazla özen gösterilmelidir.

CR ve CRV grupları arasında kana emilen bileşenlerdeki farklılıklar
CR'nin aktif bileşenini belirlemek için, bu deney dismenore model sıçanlarda kana emilen bileşenleri araştırdı. Bu deneyde, kandaki 15 bileşenin ve iki metabolitin CR ve CRV grupları arasında farklılık gösterdiği bulunmuştur. Bunlar arasında, CRV grubundaki (-)-myrtenol ve [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroksi-1,4,7,7-tetrametilbisiklo [2.2.1]hept-2-yl]asetik asit seviyeleri CR grubundan önemli ölçüde daha yüksekti, ancak diğer bileşenlerin seviyeleri önemli ölçüde farklı değildi. (-)-Myrtenol ve [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroksi-1,4,7,7-tetrametilbisiklo [2.2.1]hept-2-il] asetik asit terpenoidlerdir ve CRV'nin etkili bileşenleri olarak kabul edilirler.

Ligucyperonol ve procurcumadiol, sırasıyla α-siperon ve izokurcumenolün oksidasyonu ile üretilir ve α-siperon güçlü bir analjezik etkiye sahiptir. Önerilen etki mekanizması, NF-kB sinyallemesi31'in negatif regülasyonu yoluyla LPS kaynaklı COX-2 ekspresyonunu ve PGE2 sentezini azaltabilir. (+)-Nootkatone ayrıca COX-2 aktivitesiniinhibe eder 32,33. İzokukümenol, dismenore3 tedavisinde Curcumae rizomasının temel bileşenidir ve metaboliti procurcumadiol analjezik bir etkiye sahip olabilir. CR grubu ile karşılaştırıldığında, CRV grubu, analjezik bir etkiye sahip olan (-)-myrtenol'ün önemli ölçüde daha yüksek seviyelerini göstermiştir34. Olası etki mekanizması, COX-2 35 ekspresyonundaki değişikliklerin anti-enflamatuar sitokin seviyelerini (IL-10, IFN-γ) arttırması ve pro-inflamatuar sitokinlerin (TNF-α, IL-1β) seviyelerini azaltması olabilir36. Sirke ile işleme, kandaki aktif bileşenlerin seviyelerini iyileştirir, bu nedenle sirke ile üretilen ürünler daha etkilidir.

CR ve CRV grupları arasındaki metabolik yolaklardaki farklılıklar
Yol analizi, CR ve CRV grupları arasında, fenilalanin metabolizması, doymamış yağ asitlerinin biyosentezi, fenilalanin, tirozin ve triptofan biyosentezi ve linoleik asit metabolizması dahil olmak üzere önemli ölçüde farklı metabolik yollar göstermiştir. Bununla birlikte, fenilalanin metabolizmasının metabolik yolları ve fenilalanin, tirozin ve triptofan biyosentezi PD ile ilişkili değildir. Bu sonuçlar, CRV'nin artmış etkinliği ile ilişkili metabolik yolakların linoleik asit metabolizması ve doymamış yağ asitlerinin biyosentezi olduğunu göstermektedir.

Doymamış yağ asitleri iki tip içerir: omega-3 ve omega-637. Eikosapentaenoik asit dahil olmak üzere üç mediatör öncüsü (20:5ω3; EPA), dokosaheksaenoik asit (22:5ω3; DHA) ve arakidonik asit (20:5ω6; ARA), doymamış yağ asitlerinin biyosentezinde rol oynar37,38 yolağı. EPA ve ARA metabolizmasının her ikisi de COX'un etkisi altında prostaglandinler ve lökotrienler üretir. ARA, PGF 2 α, PGE 2, PGI 2 ve tromboksan (TXA 2, TXB 2) dahil olmak üzere 2 serisi prostanoidler ve lökotrien A 4 (LTA 4) lökotrien B 4 (LTB 4), lökotrien C 4 (LTC 4) ve lökotrien D 4 (LTD 4) dahil olmak üzere 4 serisi lökotrienler üretir. 3 serisi prostanoidler arasında prostaglandin E 3 (PGE 3), prostasiklin I 3 (PGI 3) ve tromboksanA2 (TXA 3) bulunur ve 5 serisi lökotrienler arasında büyük ölçüde EPA tarafından üretilen lökotrien A 5 (LTA 5) lökotrien B 5 (LTB 5), lökotrien C 5 (LTC 5) ve lökotrien D 5 (LTD 5) bulunur.

EPA'nın dönüşüm süreci ARA ile aynıdır ve benzer enzimler39 tarafından aracılık edilir. 2 serisi prostanoidler ve 4 serisi lökotrienler esas olarak pro-enflamatuar, trombosit agregasyonu ve vazokonstriksiyon etkilerine sahiptir. Buna karşılık, 3 serisi prostanoidler ve 5 serisi lökotrienler anti-enflamatuar, antiplatelet ve vazodilatatör etkiler gösterir38. TXA 2 ve TXB2, ARA'dan üretilir ve kan damarlarının daralmasına neden olur. EPA türevi PGI 3, PGE 3 ve TXA3 sadece vazodilatörler 38,40 olarak işlev görür. EPA ve ARA, COX enzimi tarafından PG'lere dönüşüm için rekabet eder. Membran EPA / AA oranı arttırıldığında, agregasyonu teşvik eden eikosanoidler PGI 2 ve TXA2, anti-agregasyonu teşvik eden TXA 3 ve PGI3'e dönüştürülebilir, bu da anti-enflamatuar ve anti-agregatör etkilerle sonuçlanır40. Ek olarak, EPA, DHA ve linoleik asidin kombine kullanımı (C18: 2ω6; LIN) sığır endometriyumunda PGF2α ve PGE2 salınımınıazaltabilir ve trofoblastlar 41,42.

PD muhtemelen PG'lerin ve lökotrienlerin 43,44,45, özellikle PG'lerin 46'sının üretiminden kaynaklanır. Bu arada, vazopressin, β-endorfinler, östrojen, progesteron, nörotransmitterler, IL, ET-1 ve NO'daki dengesizlik de dismenore47 ile ilişkili olabilir. ELISA sonuçlarına göre CRV grubunda PGF 2α ve PGF2α/PGE 2 düzeyleri azalırken, PGE 2 düzeyleri CR grubuna göre artmıştır. Ek olarak, lökotrienB4 (C02165) ve prostaglandin J2 (C05957) CRV grubunda daha düşüktü. Bu, CRV grubunda, dismenore için en önemli faktör olan PGF2α da dahil olmak üzere ARA'dan yapılan 2 serisi prostanoidlerin daha düşük seviyeleri olduğunu göstermektedir. PGE 2 ile yüksek konsantrasyonlarda tedavi kan damarlarını genişletir ve PGE2 düşük konsantrasyonlarda vazokonstriksiyona neden olur48. Bu nedenle, uterus vazodilatasyon ile gevşetilir ve dismenore rahatlatılır.

İnsan vücudu yeterli miktarda C18 doymamış yağ asidi sentezleyemediğinden, C18 doymamış yağ asitlerinin tek kaynağı olan linoleik asit ve α-linolenik asit çok önemlidir38. Linoleik asit ve α-linolenik asit, sırasıyla omega-6 ve omega-3 doymamış yağ asidi metabolizmasının kaynağıdır. Özellikle, prostaglandin sentezinin öncüsü ARA'dır ve ARA, linoleik asit49'dan sentezlenir. Linoleik asit bir öncüldür ve ARA, prostaglandinler (PGF 2 α, PGE 2), prostasiklin (PGI 2) ve tromboksan (TXA 2) dahil olmak üzere bir dizi metabolit sentezlenir 50. Linoleik asit, CRV'nin artmış analjezik etkisi ile yakından ilişkilidir. Ayrıca, steroid hormonu biyosentezinin metabolik yolu, sfingolipid metabolizmasının metabolik yolu tarafından üretilen, COX-2'yi indükleyen ve TNF 54,55,56,57 ile PGE2 üreten progesteron 51,52,53 ve sfengosin-1-fosfat (C06124) üretebilir. Bunlar PD ile de ilişkili olabilir.

Protokolde bazı sınırlamalar vardır. Sadece bileşenlerin göreceli seviyeleri karşılaştırıldı ve standart örnek, bitkideki bileşenleri ve kana emilenlerin miktarını belirlemek için kullanılmadı. Sıçanların dışkısı ve idrarı hayvan deneylerinde toplanmadı, bu da in vivo olarak daha az CR metabolitinin keşfedilmesine neden oldu. Doğrulama deneyleri, metabonomik analiz tarafından keşfedilen mekanizmayı daha da doğrulamalıdır.

Bu çalışmada kullanılan strateji ve protokol, in vitro kimyasal bileşenlerin incelenmesinde ve in vivo olarak bireysel bileşenlerin tek taraflı çalışmasında körlüğü önlemiştir. Bu nedenle, mekanizma araştırması için çok uygundu. Strateji çok fazla zaman ve iş tasarrufu sağlayabilir ve terapötik etkinlik için kritik bileşenleri ve mekanizmayı doğru bir şekilde tanımlayabilir.

Bu çalışmada kanda 15 bileşen ve iki metabolit olduğu bulunmuştur. Bunlar arasında, (-)-myrtenol ve [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroksi-1,4,7,7-tetrametilbisiklo [2.2.1]hept-2-il]asetik asit seviyeleri, CRV grubunda CR grubuna kıyasla önemli ölçüde artmıştır, bu da sirke ile işlemenin kandaki aktif bileşenlerin seviyelerini artırabileceğini göstermiştir. CR sirke ile işlendikten sonra, pro-enflamatuar, trombosit agregasyonu ve vazokonstriksiyon özelliklerine sahip 2 seri prostanoidlerin ve 4 serisi lökotrienlerin seviyeleri, PGF2α, lökotrienB4 ve prostaglandin J2 dahil olmak üzere azalmıştır. Bu, CRV'nin gelişmiş bir analjezik etki gösterdiği mekanizma olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma, Chongqing Belediye Sağlık ve Aile Planlaması Komisyonu Çin Tıbbı Bilim ve Teknoloji Projesi (Proje Numarası: ZY201802297), Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı'nın Genel Projesi (Proje Numarası: cstc2019jcyj-msxmX065), Chongqing Modern Dağ Alanı Karakteristik Yüksek Verimli Tarım Teknolojisi Sistemi İnovasyon Ekibi Bina Planı 2022 [10] ve Çin Materia'nın Chongqing Belediye Sağlık Komisyonu Anahtar Disiplin İnşaat Projesi tarafından desteklenmiştir Medica İşleme.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile  Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20 Beckman Coulter, Inc. MRZ15K047
Estradiol benzoate Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd C10042616
formic acid Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 177799
LC 30A system Shimadzu, Kyoto, Japan 228-45162-46
Olive oil Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd H25A11P111909
Oxytocin synthetic Zhejiang peptide biology Co., Ltd  2019092001
Rat PGF2α ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd 202101
Rat PGFE2 ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
Triple TOF 4600 system SCIEX, Framingham, MA, USA BK20641402
water Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 152720

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009 (2021).
  2. Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
  3. Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558 (2021).
  4. Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
  5. Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962 (2021).
  6. Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832 (2022).
  7. Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867 (2021).
  8. El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
  9. Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709 (2020).
  10. Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
  11. Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
  12. Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
  13. Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238 (2017).
  14. Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
  15. Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773 (2020).
  16. Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
  17. Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
  18. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  19. Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
  20. Zhao, L., Hartung, T. Metabonomics and toxicology. Methods in Molecular Biology. 1277, 209-231 (2015).
  21. Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
  22. Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
  23. Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
  24. Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
  25. Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763 (2021).
  26. Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642 (2021).
  27. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
  28. Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233 (2021).
  29. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  30. Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768 (2020).
  31. Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
  32. Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181 (2020).
  33. Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119 (2021).
  34. Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448 (2020).
  35. Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
  36. Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
  37. Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
  38. Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
  39. Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966 (2019).
  40. Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
  41. Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
  42. Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
  43. Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F. Adolescent dysmenorrhea. Endocrine Development. 22, 171-180 (2012).
  44. Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
  45. Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N. Prostaglandin level of primary dysmenorrhea pain sufferers. Enfermería Clínica. 30, 5-9 (2020).
  46. Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
  47. Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191 (2020).
  48. Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683 (2019).
  49. Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628 (2020).
  50. Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
  51. Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
  52. Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
  53. Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555 (2018).
  54. Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
  55. Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
  56. Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
  57. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).

Tags

Geri Çekme Sayı 190
Primer Dismenore Olan Sıçanlarda Sıvı Kromatografi-Tandem Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Ham ve İşlenmiş Siperi Rizom Örneklerinin Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., … More

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., Chu, R., Li, S. Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea. J. Vis. Exp. (190), e64691, doi:10.3791/64691 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter