Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ניתוח דגימות Rhizoma Cyperi גולמיות ומעובדות באמצעות ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית-טנדם בחולדות עם דיסמנוריאה ראשונית

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

Summary

כאן, ניתוח השוואתי של דגימות ריזומה גולמית ומעובדת של Cyperi rhizoma (CR) מוצג באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד - ספקטרומטריית מסה טנדם ברזולוציה גבוהה (UPLC-MS/MS) בחולדות עם דיסמנוריאה ראשונית. השינויים ברמות המטבוליטים בדם ומרכיבי הדגימה נבדקו בין חולדות שטופלו ב-CR ו-CR שעובדו בחומץ (CRV).

Abstract

Cyperi rhizoma (CR) נמצא בשימוש נרחב בגינקולוגיה והוא רפואה כללית לטיפול במחלות נשים בסין. מאז ההשפעה משכך כאבים של CR משופר לאחר עיבוד עם חומץ, CR מעובד עם חומץ (CRV) משמש בדרך כלל מבחינה קלינית. עם זאת, המנגנון שבו אפקט משכך כאבים משופר על ידי עיבוד חומץ אינו ברור. במחקר זה, טכניקת ספקטרומטריית המסה של כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה במיוחד (UPLC-MS/MS) שימשה לבחינת שינויים ברמות הדם של המרכיבים האקסוגניים והמטבוליטים בין חולדות שטופלו ב-CRV לבין חולדות שטופלו ב-CRV עם דיסמנוריאה. התוצאות חשפו רמות שונות של 15 מרכיבים ושני מטבוליטים בדמן של חולדות אלה. ביניהם, הרמות של (-)-myrtenol ו-[(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl] חומצה אצטית בקבוצת CRV היו גבוהות במידה ניכרת מאשר בקבוצת CR. CRV הפחית את הרמה של פרוסטנואידים מסדרה 2 ולויקוטריאנים מסדרה 4 עם פעילויות פרו-דלקתיות, צבירת טסיות דם והתכווצות כלי דם וסיפק השפעות משככות כאבים על ידי ויסות מטבוליזם של חומצה ארכידונית וחומצה לינולאית וביוסינתזה של חומצות שומן בלתי רוויות. מחקר זה גילה כי עיבוד חומץ משפר את אפקט משכך הכאבים של CR ותורם להבנתנו את מנגנון הפעולה של CRV.

Introduction

דיסמנוריאה ראשונית (PD) היא המצב השכיח ביותר בגינקולוגיה קלינית. הוא מאופיין בכאבי גב, נפיחות, כאבי בטן או אי נוחות לפני או במהלך הווסת ללא פתולוגיה של האגן במערכת הרבייה1. דו"ח על שכיחותה הראה כי 85.7% מהתלמידים סובלים מפרקינסון2. גלולות למניעת הריון במינון נמוך הן הטיפול הסטנדרטי, אך תופעות הלוואי השליליות שלהן, כגון פקקת ורידים עמוקים, משכו תשומת לב גוברת3. השכיחות של פקקת ורידים עמוקים בקרב משתמשים בגלולות למניעת הריון היא >1 ל-1,000 נשים, והסיכון הוא הגבוה ביותר במהלך 6-12 החודשים הראשונים ובמשתמשות מעל גיל 404.

בשימוש ארוך ברפואה הסינית המסורתית (TCM), קנה שורש Cyperi (CR) נגזר מקנה השורש המיובש של Cyperus rotundus L. ממשפחת Cyperaceae. CR מסדיר הפרעות מחזור ומקל על דיכאון וכאב5. CR נמצא בשימוש נרחב בגינקולוגיה ונחשב לרפואה כללית לטיפול במחלות נשים6. CR מעובד עם חומץ (CRV) משמש בדרך כלל מבחינה קלינית. בהשוואה ל- CR, CRV מראה ויסות משופר של הווסת והקלה על כאבים. מחקרים מודרניים הראו כי CR מעכב cyclooxygenase-2 (COX-2) ואת הסינתזה הבאה של prostaglandins (PGs), ובכך להשיג השפעה אנטי דלקתית. בינתיים, CR מציג אפקט משכך כאבים ללא תופעות לוואי7, מה שהופך את CR לבחירה טובה עבור חולי דיסמנוריאה. עם זאת, המנגנון העומד בבסיס ויסות הווסת ומתן הקלה בכאב על ידי CRV אינו ברור. מחקר CR התמקד בעיקר בשינויים ברכיבים הכימיים הפעילים שלו ובפעילויות הפרמקולוגיות שלו, כגון ההשפעות האנטי דלקתיות, נוגדות הדיכאון ומשככי הכאביםשלו 8,9,10,11,12.

למרות המרכיבים של TCM הם מורכבים, הם נספגים לתוך הדם חייב להגיע ריכוז דם מסוים כדי להיות יעיל13. ניתן לצמצם את היקף בדיקת החומרים הפעילים של TCM על ידי שימוש באסטרטגיה של קביעת המרכיבים בדם. ניתן להימנע מעיוורון בחקר המרכיבים הכימיים במבחנה, ומחד-צדדיות בחקר המרכיבים הבודדים14. על ידי השוואת הרכבים של CR ו- CRV בדם, ניתן לזהות שינויים בחומרים הפעילים של CR המעובד ביעילות ובמהירות. יעילות התרופה היא התהליך שבו תרופה משפיעה על הגוף. שינויים במרכיבי התרופה עקב התגובה המטבולית של הגוף, אשר עשויים להיות קשורים למנגנון הפעולה של התרופה, ניתן לקבוע עם metabonomics. Metabonomics שואפת למדוד את התגובות המטבוליות הכוללות והדינמיות, אשר עולה בקנה אחד עם קביעת היעילות הכוללת של הרפואה הסינית המסורתית15. יתר על כן, מטבוליטים הם התוצר הסופי של ביטוי גנים, אשר קרוב ביותר לפנוטיפים16. לפיכך, מטבונומיה עשויה להתאים לחקר ההבדלים במסלולים המטבוליים בין CR ו- CRV בטיפול בפרקינסון. כרומטוגרפיה נוזלית - ספקטרומטריית מסה טנדם ברזולוציה גבוהה (LC-MS/MS) - מבוססת מטבולומיקה לא ממוקדת מאופיינת בתפוקה גבוהה, רגישות גבוהה ורזולוציה גבוהה וניתן להשתמש בה למדידת רכיבים מולקולריים קטנים רבים ושונים17,18 . שיטה זו יכולה לקבוע בו זמנית את המטבוליטים האנדוגניים והמרכיבים האקסוגניים הנספגים בדם. Metabonomics כבר בשימוש נרחב במחקרים על TCM19, טוקסיקולוגיה סמים20, ניהול בריאות21, ספורט22, מזון23, ותחומים אחרים.

במחקר זה, ההבדלים בין המרכיבים האקסוגניים שנספגו בדם לבין המטבוליטים האנדוגניים נמדדו בין חולדות מודל דיסמנוריאה שטופלו ב-CRV לבין חולדות מודל דיסמנוריאה שטופלו ב-CRV באמצעות מטבולומיקה לא ממוקדת מבוססת LC-MS/MS כדי לחשוף את מנגנוני ההשפעות משככות הכאבים של CRV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים הקשורים בבעלי חיים נערכו באישור ועדת האתיקה של הניסויים של מכון צ'ונגצ'ינג לרפואה סינית מסורתית. בניסוי זה נעשה שימוש בעשרים וארבע נקבות חולדות מסוג Sprague Dawley (SD) שהיו בנות 8-10 שבועות ושקלו 200 גרם ±-20 גרם.

1. הכנת המיצוי

  1. חישוב
    1. תכננו לתת את תמצית CR או CRV לקבוצת טיפול של שש חולדות Sprague-Dawley (10 גרם / [kg∙day]) במשך 3 ימים. השתמש בריכוז תמצית CR או CRV של 1 גרם/מ"ל (1 מ"ל של תמצית מתקבל מ 1 גרם של עשבי תיבול).
      הערה: המינון של CR הוא 6-10 גרם. במחקר זה, המינון המרבי של 10 גרם שימש כמינון. מכיוון שהמשקל הממוצע של אדם מבוגר הוא 60 ק"ג, המינון למבוגרים הוא 0.1667 גרם / ק"ג. על פי אלגוריתם המרת המשקל24, מכיוון שמקדם המרת המינון בין בני אדם לחולדות הוא 6.3, המינון לחולדות הוא 1.05 גרם לק"ג. מינון התרופה הוגדל פי 10 ל-10.5 גרם לק"ג עבור חולדות. המינון נקבע כ-10 גרם/ק"ג לנוחות החישוב והניסוי עצמו. לדוגמה, על פי החישוב, אם יש צורך בסך הכל 36 גרם של CR או CRV, יש להכין את צמחי המרפא הסיניים לפחות פעמיים. לפיכך, נדרשו 200 גרם CR - 100 גרם CR שימשו כ- CR, ו- 100 גרם CR עובדו ל- CRV.
    2. חשב את נפח CR או CRV שיוחל לכל חולדה באמצעות משוואה (1):
      V = 10 גרם/(kg∙day) × 200 g/(1 g/mL) = 2 מ"ל (1)
  2. עיבוד של CRV
    1. מערבבים היטב 100 גרם CR ו-20 גרם חומץ (>5.5 גרם חומצה אצטית/100 מ"ל) ודגרים במשך 12 שעות.
      הערה: כדי להבטיח שהחלק הפנימי של CR נרטב בחומץ לאחר 12 שעות, ה-CR והחומץ עורבבו, עורבבו היטב ואז ערבבו שוב עד שהחלק הפנימי היה לח.
    2. מקפיצים את התערובת במחבת ברזל במשך 10 דקות בחום של 110-120 מעלות. לאחר מכן, מוציאים את התערובת, ומניחים לה להתקרר בטמפרטורת החדר.
      הערה: כדי למנוע חריכה של CR, יש צורך לערבב ברציפות בזמן החימום. אם ה-CRV המעובד רטוב מדי, ניתן לייבש אותו ב-60°C. כאשר פני השטח של CR הם ספיה, ניתן להפסיק את ההקפצה.
  3. חילוץ
    1. תמצית CR
      1. מוסיפים 10 פעמים (כמות CR) מים טהורים ל-CR, ומשרים למשך שעתיים. יש לוודא כי החומרים הרפואיים נמצאים מתחת לרמה הנוזלית בעת ההשריה.
        הערה: יש לחתוך את ה-CR רק לשניים לפני החילוץ. מטרת ההשריה היא לחלץ את המרכיבים הפעילים בצורה יעילה יותר. תהליך ההשריה הוא חיוני.
      2. מביאים את תערובת המים והתרופות לרתיחה על אש גבוהה, ושומרים אותה רותחת על אש נמוכה למשך 20 דקות. מסננים עם מטלית פילטר (100 רשת), ואוספים את התסנין.
        הערה: בעת מרתח השתמשו בחום גבוה לפני הרתיחה, ובחום נמוך השתמשו כדי לשמור על הרתיחה.
      3. חזור על שלב 1.3.1.2 פעם אחת, ושלב את התסנין.
      4. רכז את התמצית עם מאייד סיבובי ל 1 גרם / מ"ל (מבוסס על התרופה המקורית, טמפרטורת הריכוז חייבת להיות מתחת 60 ° C).
        הערה: הרכיבים הפעילים ב-CR הם נדיפים, ולכן טמפרטורת הריכוז לא צריכה להיות גבוהה מ-60°C.
    2. תמצית CRV
      1. בצע את אותם שלבים (1.3.1.1-1.3.1.3) כמו בשיטת חילוץ CR.
    3. תמצית CR לבדיקה
      1. פיפטה 500 μL של תמצית CR ו 500 μL של מתנול לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל, ומערבולת במשך 30 s כדי לערבב.
        הערה: תערובת של מתנול ומים מחלצת טוב יותר את המרכיבים הפעילים. אין לסנן את התמצית ישירות לבדיקה.
      2. צנטריפוגה כל דגימה במשך 15 דקות ב 1,6502 × גרם ב 4 ° C. סנן את supernatant, ולאחר מכן להעביר אותו בקבוקון הדגימה לבדיקה.
        הערה: לאחר הצנטריפוגה המהירה של תערובת מתנול ותמצית, ניתן להעביר את הסופרנאטנט ישירות לבקבוק הדגימה לקביעה ללא סינון. בשל החום שנוצר בתהליך הצנטריפוגה, עדיף להשתמש בצנטריפוגה קריוגנית.
    4. תמצית CRV לבדיקה
      1. בצע את שלבים 1.3.3.1-1.3.3.2 כדי להכין את תמצית CRV לבדיקה.

2. בעלי חיים

  1. חישוב
    1. קח 50 מ"ג של אסטרדיול בנזואט, ולהוסיף אותו 50 מ"ל של שמן זית כדי להכין 1 מ"ג / מ"ל פתרון. קח 50 מ"ג של אוקסיטוצין, והוסף אותו ל 50 מ"ל של מלוחים רגילים כדי להכין תמיסת 1 מ"ג / מ"ל.
      הערה: המינון של הזרקה intraperitoneal של אסטרדיול בנזואט ואוקסיטוצין הוא 10 מ"ג / (kg∙day). אסטרדיול בנזואט מומס בשמן זית, ואוקסיטוצין מומס במי מלח רגילים. אסטרדיול בנזואט אינו קל להתמוסס בשמן זית וניתן לטפל בו באמצעות אולטרסאונד כדי להאיץ את ההתמוססות. הן אסטרדיול בנזואט והן אוקסיטוצין פתרונות חייב להיות מוכן מדי יום.
    2. חשב את נפח תמיסת אסטרדיול בנזואט שיש ליישם לכל חולדה (כלומר, V = 10 מ"ג / [kg∙day] × 200 גרם / [1 גרם / מ"ל] = 2 מ"ל). חשב את נפח תמיסת האוקסיטוצין שיש ליישם לכל חולדה (כלומר, V = 10 מ"ג / [kg∙day] × 200 גרם / [1 גרם / מ"ל] = 2 מ"ל).
  2. קיבוץ ואדמיניסטרציה של בעלי חיים
    הערה: עשרה ימים הוקצו לניהול25,26. במהלך הטיפול, לחולדות הייתה גישה בלתי מוגבלת לצ'או רגיל ולמים. בתוך 30 דקות ממתן אוקסיטוצין, בוצע מעקב אחר פעילות ההתפתלות של כל חולדה. מודל חולדות הפרקינסון פותח בהצלחה, כפי שמעידות תגובות הפיתול של חולדות המודל, שכללו התכווצות הרחם, סיבוב גפה אחת, הארכת גפה אחורית, גזע חלול והתכווצות בטן26.
    1. הקצו 24 נקבות חולדות Sprague-Dawley (חולדות SD, בנות 8-10 שבועות, במשקל 200 גרם ±-20 גרם) לארבע קבוצות בקבוצת ביקורת אקראית, מודל, CR ו-CRV – והאכילו אותן במשך 7 ימים.
    2. ניהול בעלי חיים
      1. הזרקה תוך-צפקית של חולדות בקבוצות המודל, CR ו-CRV עם 2 מ"ל של תמיסת אסטרדיול בנזואט מדי יום. תוך צפקית להזריק את החולדות בקבוצת הביקורת עם 2 מ"ל של מלוחים רגילים.
      2. מהיום השמיני, השלם את שלב 2.2.2.1. לאחר מכן, יש לתת באופן תוך-גסטרי 2 מ"ל תמצית CRV לחולדות בקבוצת CRV, 2 מ"ל תמצית CR לחולדות בקבוצת CR, ו-2 מ"ל מלח רגיל לחולדות בקבוצת הביקורת ובקבוצת המודל.
      3. ביום העשירי, השלם את שלב 2.2.2.2. לאחר מכן, הזריקו תוך צפקית את החולדות בקבוצות המודל, CR ו-CRV עם 2 מ"ל של תמיסת אוקסיטוצין ואת החולדות בקבוצת הביקורת עם 2 מ"ל של תמיסת מלח רגילה.
    3. תעד את זמני ההתפתלות של החולדות בתוך 30 דקות מהזרקת האוקסיטוצין.
  3. אוסף דוגמאות
    1. לאסוף דגימות דם של אבי העורקים הבטני, להוציא את הרחם במהירות ובשלמות, ולהפריד בזהירות את רקמת החיבור והשומן הנצמדים לדופן הרחם.
      הערה: הדם נאסף קרוב לשעה לאחר המנה הסופית.
    2. השתמש צינורות microcentrifuge כדי לשמר ולהעביר את רקמת הרחם לחנקן נוזלי. אחסן את דגימות הרקמה ב -80 ° C.
    3. צנטריפוגה את דגימות הדם במשך 10 דקות ב 4,125 × גרם. הסר את הסופרנטנט המכיל את הסרום, ואת הצנטריפוגה ב 16,502 × גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C. צנטריפוגר את הסרום, ולאחר מכן לשמור אותו בצינור ב -80 ° C לאחסון.
      הערה: יש להשאיר את דגימות הדם בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לצורך עיבוד מחדש.
  4. עיבוד דוגמאות
    1. דוגמיות סרום
      1. שים 400 μL של מתנול ו 200 μL של סרום לתוך צינור microcentrifuge, מערבולת במשך 30 s כדי לערבב. צנטריפוגה כל דגימה במשך 15 דקות ב-16,502 × גרם ב-4°C. מלאו את הבקבוקים לדוגמה בסופרנאטנט לאחר איסוף וסינון. ערבבו את כל הסופרנאטנטים מכל דגימה באותו נפח כדי להכין דגימות בקרת איכות לבדיקה.
    2. דגימות רקמת רחם
      1. קח 100 מ"ג של רקמת הרחם מן קטע ipsilateral ולטחון אותו עם נפח פי תשעה של מלוחים נורמליים. צנטריפוגות את ההומוגנט למשך 10 דקות במשקל 4,125 × גרם, ואוספות את הסופרנטנט. הכניסו את הסופרנאטנט למקרר בטמפרטורה של 4°C לבדיקה או בטמפרטורה של -80°C אם לא נבדקו באותו היום.
      2. מניחים כדורי מלח, רקמה ופלדה רגילים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל, מכניסים את צינור המיקרוצנטריפוגה לחנקן נוזלי למשך 3-5 שניות, ולאחר מכן מכניסים את הרקמה למטחנת רקמות לטחינה.
  5. בדיקות לדוגמה
    1. השתמשו בבדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) כדי למדוד את תכולת PGF2α ו-PGE2 ברקמות הרחם של דגימות החולדות.
      הערה: ערכת החולדה PGE 2 ELISA שימשה למדידת תכולת PGE2, וערכת PGF 2α ELISA של החולדה שימשה למדידת רמת PGF2α. את השלבים המפורטים ניתן למצוא בהוראות היצרן. פרטי הערכה מופיעים בטבלת החומרים.
    2. הערך את דגימת הסרום, תמצית CR ותמצית CRV באמצעות UPLC-MS/MS.
      1. עבור UPLC, השתמש בטור C18 (2.6 מיקרומטר, 2.1 מ"מ x 100 מ"מ) ובשיטת שיפוע בינארית עם שלב A נייד המכיל 0.1% חומצה פורמית ושלב B נייד המכיל אצטוניטריל. הגדר את שיפוע elution כדלקמן: מ 0 דקות עד 1 דקה, 15% B; מ 1 דקות עד 8.5 דקות, 15% עד 85% B; מ 8.5 דקות עד 11.5 דקות, 85% B; מ 11.5 דקות עד 11.6 דקות, 99% עד 1% B; ומ-11.6 דקות עד 15 דקות, 15% B. הגדר את קצב הזרימה ל-0.35 מ"ל/דקה ואת נפח ההזרקה ל-2 מיקרוליטר.
      2. עבור MS, הגדר את הטמפרטורה ל- 600 ° C, את קצב זרימת גז המסך (CUR) ל- 0.17 MPa, ואת קצב זרימת הנדן וגז העזר ל- 0.38 MPa. הגדר את מתח ריסוס היונים של מצב היונים החיוביים ומצב היונים השליליים ל- 5.5 kV ו- -4.5 kV, בהתאמה, את מתח פוטנציאל פירוק האשכולות (DP) ל- 80 V או -80 V, את אנרגיית ההתנגשות (CE) ל- 40 eV או -25 eV, ואת סופרפוזיציית אנרגיית ההתנגשות (CES) ל- 35 eV ±- 15 eV.
      3. בצע את הבדיקה בהתאם לפרוטוקול היצרן באמצעות UPLC-MS/MS. בצע MS לטווח מסה של 50-1,000 m/z.
      4. השג את תוצאות UPLC-MS/MS באמצעות תוכנית תחנת העבודה התואמת בשילוב עם רכישה תלוית מידע של מצב האיתור, מסנן פגמי מסה מרובים וניכוי רקע דינמי. השתמש בדגימות בקרת האיכות של הסרום המשותף כדי לבדוק את החזרתיות והיציבות של ציוד UPLC-MS/MS כדי לאמת את הגישה הקונבנציונלית. לפני דגימות המחקר, הזריקו את דגימות בקרת האיכות במשך ארבע ריצות רצופות, ולאחר מכן הזריקו אותן לאחר כל חמש דגימות בסרום.

3. עיבוד נתונים

  1. הכנת נתונים
    1. השתמש בתוכנת המרה כדי להמיר את הנתונים הגולמיים לתבנית mzXML. נרמל את נתוני זרם היונים הכולל (TIC) של כל דגימה.
      הערה: יישום פנימי מבוסס R (www.lims2.com) שנבנה על XCMS שימש לניתוח המידע עבור אינטגרציה, יישור, חילוץ וזיהוי שיא27.
    2. בצע ביאור מטבוליטים באמצעות מסד נתונים קנייני של MS2 (www.lims2.com). הגדר את סף הביאור ל- 0.328.
      הערה: המטבוליטים האנדוגניים זוהו בכל קבוצה.
  2. ניתוח רכיבים עיקריים ואנליזה דיסקרימיננטית אורתוגונלית חלקית לפחות ריבועית
    1. השתמש בתוכנת ניתוח כדי לבצע את ניתוח הרכיבים העיקריים (PCA) ואת המידול. ייבא את הנתונים הסטנדרטיים של המטבוליטים לתוכנת הניתוח. לאחר מכן, השתמש בהתאמה אוטומטית כדי לבנות את מודל הניתוח. לבסוף, השתמש בניקוד כדי להשיג את תרשים פיזור הניקוד של PCA.
      הערה: האשכולות של כל קבוצה התקבלו עם תרשים פיזור הניקוד של PCA. PCA הוא מצב ניתוח ללא פיקוח שבעיקר מקבץ את הדגימות באמצעות הפחתת ממד ללא התערבות.
    2. השתמש בתוכנת הניתוח כדי לבצע את ניתוח הדיסקרימיננטה האורתוגונלית החלקית הכי פחות ריבועית (OPLS-DA).
      1. ייבא את הנתונים הסטנדרטיים על המטבוליטים בקבוצות CR ו- CRV לתוכנת הניתוח.
      2. יבא את הנתונים מקבוצת CR לקבוצת CR שנוצרה, וייבא את הנתונים מקבוצת CRV לקבוצת CRV שנוצרה.
        הערה: OPLS-DA הוא מצב ניתוח מפוקח, ויש צורך בקיבוץ של הדגימות.
      3. לאחר מכן, השתמש בהתאמה אוטומטית כדי לבנות את מודל הניתוח, והשתמש בניקוד כדי להשיג את תרשים פיזור הניקוד של OPLS-DA. לבסוף, השתמש ב- VIP כדי לקבל את משמעות המשתנה בערך ההקרנה ( VIP ) ב- OPLS-DA.
        הערה: משמעות המשתנה בערכי ההיטל (VIP) של המטבוליטים בקבוצות CR ו- CRV הושגה באמצעות OPLS-DA.
  3. זיהוי מטבוליטים דיפרנציאליים פוטנציאליים
    1. סנן את המטבוליטים עם ערכי VIP גדולים מ- 1 בשלב 3.2.2.3.
    2. השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לחשב את ערך P של המטבוליטים שהוקרנו בשלב 3.3.1 על ידי מבחן t של התלמיד.
      הערה: הבדלים משמעותיים במטבוליטים הדיפרנציאליים הפוטנציאליים בקבוצות CR ו- CRV נקבעו על ידי מבחן t של סטודנט. המטבוליטים הדיפרנציאליים הפוטנציאליים היו אלה עם ערך p של מבחן t של סטודנט < 0.05 ומובהקות משתנה בהיטל (VIP) גדול מ-1. הייצוג הושג באמצעות חלקה וולקנית.
  4. זיהוי המטבוליטים הדיפרנציאליים
    1. סנן את המטבוליטים הדיפרנציאליים הפוטנציאליים בשלב 3.3. השתמש בתוצאות שלב 3.1.2 כדי לזהות מטבוליטים דיפרנציאליים אלה.
      הערה: זוהו מספר קטן של מטבוליטים דיפרנציאליים פוטנציאליים, והם הפכו למטבוליטים הדיפרנציאליים המועמדים.
    2. סנן את המטבוליטים הדיפרנציאליים שיש להתאים במסד הנתונים של KEGG. הצג את השינויים במטבוליטים הדיפרנציאליים בקבוצות CR ו- CRV על ידי ציור מפת חום.
      הערה: מספר קטן של מטבוליטים דיפרנציאליים מועמדים הותאמו, והם הפכו למטבוליטים דיפרנציאליים.
  5. בחינת המסלולים המטבוליים הפוטנציאליים
    1. העלה את המטבוליטים השונים למסד הנתונים Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. השתמש בניתוח מסלולים כדי להשיג את המסלולים המטבוליים הפוטנציאליים.
      הערה: המסלולים המטבוליים הפוטנציאליים התקבלו בקבוצות CR ו- CRV. ערך P וערך ההשפעה היו שני אינדיקטורים חשובים מאוד בבחירת המסלולים הקריטיים. ערך P היה חשוב יותר מערך ההשפעה. מובהקות הוגדרה על ידי ערך P < 0.05; ערכי השפעה גדולים יותר היו קשורים למתאמים טובים יותר.
    3. נתח את המסלולים המטבוליים הפוטנציאליים על ידי העלאת המטבוליטים השונים למסד הנתונים של KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      הערה: יש לשקול גם את הקשר בין תפקוד המסלול המטבולי לבין מחלת פרקינסון. המסלולים המטבוליים הקריטיים התקבלו.
  6. זיהוי המרכיבים הנקלטים בדם
    1. זהה את המרכיבים הכימיים בתמציות CR ו- CRV באמצעות מסד הנתונים הפנימי MS2 (www.lims2.com), מסד הנתונים של חילוף החומרים האנושי (HMDB) ומסדי הנתונים Massbank ו- Chemspider.
    2. קבע את המרכיבים שנספגו בדם בקבוצות CR ו- CRV, והשווה את המרכיבים בין קבוצות CR ו- CRV.
      הערה: המרכיבים הנספגים בדם חייבים להיות מזוהים בקבוצות CR או CRV, אך לא ניתן לזהות אותם בקבוצת הביקורת.
  7. ניתוח סטטיסטי
    1. נתח את הנתונים באמצעות ניתוח חד משתני (UVA) ושיטות סטטיסטיות מרובות משתנים, כולל ניתוח השונות (ANOVA) ומבחן t של התלמיד.
      הערה: המידע הניסיוני הוצג באמצעות תוכנה סטטיסטית כממוצע ± סטיית תקן (±SD). P < 0.01 נחשב להבדל משמעותי ביותר, ו - P < 0.05 ייצג הבדל משמעותי28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח ניסוי מודל דיסמנוריאה
לא הייתה תגובה מתפתלת תוך 30 דקות בקבוצת הביקורת, כי לחולדות האלה לא הוזרקו אוקסיטוצין ואסטרדיול בנזואט תוך צפקית כדי לגרום לכאב. החולדות בקבוצות המודל, CR ו-CRV הראו תגובות התפתלות משמעותיות לאחר הזרקת האוקסיטוצין. תוצאות אלה מדגימות את היעילות של שילוב אסטרדיול בנזואט ואוקסיטוצין לגרימת דיסמנוריאה. ההבדלים ברמות PGF 2α, PGE 2 ו-PGF2α/PGE2 בין המודל לקבוצות הביקורת היו משמעותיים (P < 0.001, P <-0.05), והדגימו את יעילות המודל (איור 1).

Figure 1
איור 1: תכולת PGF 2 α ו-PGE2 ברקמת הרחם והמספר המתפתל בכל קבוצה. (A) PGF2α תוכן ברקמת הרחם בכל קבוצה. (B) תכולת PGE2 ברקמת הרחם בכל קבוצה. (C) תכולת PGF 2 α/PGE2 ברקמת הרחם בכל קבוצה. (D) המספר המתפתל בכל קבוצה. העמודות מייצגות את הממוצע ± SEM מארבע קבוצות (שישה עכברים בכל קבוצה). * P < 0.05 או ** P < 0.01 מייצגים הבדל משמעותי בהשוואה לקבוצת הדגמים, ו- Δ P < 0.05 או ΔΔ P < 0.01 מייצגים הבדל משמעותי בהשוואה לקבוצת CR. החולדות בקבוצות המודל, CR ו-CRV הראו תגובת התפתלות משמעותית לאחר הזרקת האוקסיטוצין. קיצורים: PG = פרוסטגלנדין; CR = קנה שורש Cyperi; CRV = CR מעובד עם חומץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הריכוזים של PGF 2α ו-PGF2α/PGE 2 הופחתו בקבוצות CRV ו-CR, וירידה זו הייתה בולטת יותר בקבוצת CRV. היו גם הבדלים משמעותיים (P < 0.001 ו-P <-0.05) בריכוזים של PGF 2α ו-PGF2α/PGE 2 בין קבוצות CRV ו-CR. בהשוואה לקבוצת המודל, ריכוז PGE2 היה גבוה משמעותית בקבוצות CRV ו-CR (P <-0.001), כאשר הרמה עלתה הכי הרבה בקבוצת CRV.

בקרת איכות
נצפתה התאמה טובה בין זמני השמירה של השיאים הכרומטוגרפיים של BPC לבין עוצמות האות בדגימות בקרת האיכות, מה שמראה רמה גבוהה של יציבות מכשירים ואיכות נתונים עקבית להפליא (קובץ משלים 1 - תרשים משלים 1 ותרשים משלים 2). יתר על כן, כל דגימות בקרת האיכות היו בטווח של ±2 סטיות תקן (איור 2A,B), והמתאם בין דגימות בקרת האיכות היה גבוה מ-0.7 (איור 2C,D). תוצאות אלה מצביעות על כך שההליך היה אמין ושהתוצאות היו אמינות.

Figure 2
איור 2: התפלגות חד-ממדית של PCA-X של דגימות בקרת האיכות. (A) מצב חיובי, (B) מצב שלילי; ניתוח מתאם של דגימות בקרת האיכות במצב (C) חיובי ו-(D) במצב שלילי. כל דגימות בקרת האיכות היו בטווח של ±2 סטיות תקן, והמתאמים בין דגימות בקרת האיכות היו גבוהים מ-0.7. תוצאות אלה הצביעו על כך שההליך אמין והמידע אמין. קיצורים: PC = רכיב עיקרי; PCA = ניתוח רכיבים עיקריים; בקרת איכות; CR = קנה שורש Cyperi; CRV = CR מעובד עם חומץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח רכיבים עיקריים
כפי שניתן לראות באיור 3, מחשב אבסקיסה (1) ציין את הציונים של המרכיבים העיקריים הראשונים, ואילו המחשב הקואורדינטי (2) ציין את הציונים של המרכיבים העיקריים השניים. באיור, העיגול הירוק מציין את קבוצת הביקורת, העיגול האדום מייצג את קבוצת הדגם, העיגול הכחול מציין את קבוצת CR, העיגול הלבן מציין את קבוצת CRV והעיגול הוורוד מציין את קבוצת בקרת האיכות.

Figure 3
איור 3: תרשים פיזור הניקוד של PCA . (A) מצב חיובי ו-(B) מצב שלילי. דגימות בקרת האיכות חופפות, מה שמעיד על כך שהמכשיר היה יציב מאוד. כל קבוצה מחולקת באזור משלה, כאשר רק קבוצת CR וקבוצת CRV מצטלבות מדי פעם. קיצורים: PC = רכיב עיקרי; PCA = ניתוח רכיבים עיקריים; QC = בקרת איכות; CR = קנה שורש Cyperi; CRV = CR מעובד עם חומץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות ניתוח ה-PCA הראו כי אשכולות ה-CR וקבוצות המודל הופרדו באופן משמעותי הן במצב היונים החיובי והן במצב היונים השלילי. הצבירים הופרדו באופן משמעותי בין קבוצות ה-CRV והמודל במצב היונים החיובי והשלילי. קבוצות בקרת האיכות, המודל והבקרה הופרדו מקבוצות הטיפול האחרות (CR, CRV). קבוצות CR ו-CRV חפפו מדי פעם במצב היונים החיוביים. במצב היונים השליליים, כל קבוצה הופרד באופן משמעותי.

שיטת ריבועים אורתוגונליים חלקיים לפחות אנליזה דיסקרימיננטית
OPLS-DA שימש לסינון הבדלים מטבוליים. תרשים הפיזור OPLS-DA הראה שכל הדגימות היו בתוך רווח בר-סמך של 95% (אליפסת T-square של Hotelling). איור 4A,C מראה שקבוצות CR ו-CRV הופרדו זו מזו. התאמת יתר של המודל נבדקה באמצעות מבחן התמורות (n = 200), והוערכה מובהקותו הסטטיסטית של המודל. באיור 4B,D, הקואורדינטה מתארת את הערך של R 2Y או הערך Q2, והאבסיסה מציינת את שימור ההחלפה. R2 Y מיוצג על ידי הנקודה הירוקה, Q2 מיוצג על ידי הנקודה הריבועית הכחולה, ושני הקווים המקווקווים מייצגים את קווי הרגרסיה המתאימים להם. במצב החיובי והשלילי, ערכי R 2 Yהיו 0.8 ו- 0.84, וערכי Q2 היו -0.59 ו- -0.57, בהתאמה. זה מדגים את האמינות הגבוהה של הדגם ואת היעדר התאמת יתר.

Figure 4
איור 4: מודלים של OPLS-DA עבור קבוצת CR לעומת קבוצת CRV. התוויית פיזור ניקוד במצב (A) חיובי ו-(C) במצב שלילי. בדיקת תמורות של מודל OPLS-DA עבור קבוצת CR לעומת קבוצת CRV במצב (B) חיובי ו-(D) במצב שלילי. R2 Y היה 0.8 ו 0.84, ו Q2 היה -0.59 ו -0.57 במצב החיובי והשלילי, בהתאמה. זה מדגים את האמינות הגבוהה של המודל ואת היעדר התנהגות overfiting. קיצורים: OPLS-DA = ניתוח מפלה אורתוגונלי חלקי לפחות ריבועים; CR = קנה שורש Cyperi; CRV = CR מעובד עם חומץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח סטטיסטי חד-משתני
ניתוחים סטטיסטיים חד-משתניים בוצעו כדי לזהות שינויים מטבוליים. תחת הסינון הסטנדרטי של VIP > 1 ו - P < 0.05, 339 ו- 394 מטבוליטים דיפרנציאליים פוטנציאליים זוהו במצב היונים החיובי והשלילי, בהתאמה. תרשים של הר געש מוצג באיור 5, שבו כל נקודה מתאימה למטבוליט אחר. הקואורדינטה מראה את ערך P של מבחן t של התלמיד, והאבסיסה משקפת שינויים מרובים ברמה של כל מולקולה בקבוצה. גודל הפיזור מייצג את ערך ה-VIP של מודל OPLS-DA; ערך ה- VIP גדל עם גודל הפיזור. הנקודות האדומות מציינות עלייה, הנקודות הכחולות מציינות ירידה והאפור מציין שאין הבדל משמעותי.

ניתוח איכותני של מטבוליטים דיפרנציאליים מועמדים בוצע באמצעות ספקטרומטריית מסה משנית. שינויים משמעותיים נצפו ב-63 מטבוליטים במצב חיובי (קובץ משלים 1-טבלה משלימה 1) וב-30 מטבוליטים במצב שלילי (קובץ משלים 1-טבלה משלימה 2). המטבוליטים הדיפרנציאליים נקבעו באמצעות מסדי הנתונים KEGG ו-HDMB. התרכובות שהותאמו במדויק זוהו כמטבוליטים דיפרנציאליים, ואלה מפורטים בטבלה 3 ובטבלה 4.

Figure 5
איור 5: תרשים הר געש עבור קבוצת CR לעומת קבוצת CRV . (A) מצב חיובי ו-(B) מצב שלילי. בגרף הר הגעש המיוצג, כל נקודה מתאימה למטבוליט אחר. האורדינטה מראה את ערך P של מבחן t של התלמיד, והאבסקיסה משקפת את השינויים המרובים בכל חומר בקבוצה. גודל הפיזור מייצג את ערך ה-VIP של מודל OPLS-DA. ערך ה- VIP גדל עם גודל הפיזור. נקודות אדומות מציינות עליות, נקודות כחולות מציינות ירידות, ואפור מציין שאין הבדלים משמעותיים. קיצורים: OPLS-DA = ניתוח מפלה אורתוגונלי חלקי לפחות ריבועים; VIP = מובהקות משתנה בהקרנה; CR = קנה שורש Cyperi; CRV = CR מעובד עם חומץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

השוואות מטבוליטים
חושבה מטריצת המרחק האוקלידי של הערכים הכמותיים של המטבוליטים הדיפרנציאליים בין קבוצות CR ו-CRV, והמטבוליטים הדיפרנציאליים קובצו באמצעות גישת מתאם מקיפה.

האבסיסה מייצגת קבוצות ניסוי שונות, ואילו הקואורדינטה מייצגת את הרמה היחסית באיור 6. מיקום כתמי הצבע מציין כיצד כל מטבוליט מתבטא ביחס לאחרים. במצב היונים החיוביים, בהשוואה לקבוצת CR, רמות ארבעת המטבוליטים הדיפרנציאליים בקבוצת CRV עלו, בעוד שהרמות של 11 מטבוליטים דיפרנציאליים ירדו. במצב יונים שליליים, בהשוואה לקבוצת CR, רמות ארבעת המטבוליטים הדיפרנציאליים בקבוצת CRV עלו, והרמות של 7 מטבוליטים דיפרנציאליים ירדו.

Figure 6
איור 6: ניתוח מפת חום עבור קבוצת CRV לעומת קבוצת CR . (A) מצב חיובי ו-(B) מצב שלילי. האבסיסה מייצגת את קבוצות הניסוי השונות, והקואורדינטה מייצגת את רמות הביטוי היחסיות. מיקום כתמי הצבע מציין כיצד כל מטבוליט מתבטא ביחס לאחרים. קיצורים: CR = קנה שורש Cyperi; CRV = CR מעובד עם חומץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בהשוואה לקבוצת CR, המטבוליטים שגדלו בקבוצת CRV היו ספינגוזין 1-פוספט, נובילטין, גליצרופוספופולין, ליסופק (18:1(9z)), 2-הידרוקסי-6-חומצה פנטדצילבנזואית, 9,10-חומצה אפוקסיוקטאדצנואית, חומצה 13s-הידרוקסיוקטדקדיאנואית ו-2-מתוקסיאסטרון, ואילו אלה שירדו היו קורטיקוסטרון, חומצה אינדולאצטית, חומצה גליקוקולית, ברברין, דיבוטיל פתלאט, רטינול, לויקוטרין B4, פרוסטגלנדין J2, 21-הידרוקסיפרגננולון, זרנול, הומוציסטאין, חומצה פרופינואית, חומצה סטארית, חומצה דוקוסהקסאנואית, פנילאצטילגליצין, L-פנילאלנין, אסטרון גלוקורוניד וחומצת לימון (איור 7).

Figure 7
תרשים 7: מגמות הרמה היחסית של המטבוליטים הפוטנציאליים בקבוצות CRV ו-CR. (A) מצב חיובי ו-(B) מצב שלילי. במצב החיובי, בהשוואה לקבוצת CR, רמות ארבעת המטבוליטים הדיפרנציאליים עלו בקבוצת CRV, והרמות של 11 ירדו. במצב השלילי, רמות של ארבעה מטבוליטים דיפרנציאליים עלו בקבוצת CRV, ורמות של שבעה מטבוליטים דיפרנציאליים ירדו. העמודות מייצגות את הממוצע ± SEM מארבע קבוצות (שישה עכברים בכל קבוצה). * P < 0.05, ** P < 0.01, או *** P < 0.01 מייצגים הבדל משמעותי בין קבוצות CRV ו- CR. קיצורים: CR = קנה שורש Cyperi; CRV = CR מעובד עם חומץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח מסלול KEGG
המטבוליטים הדיפרנציאליים היו מבוארים, ומסלולי KEGG נותחו. התוצאות הראו כי המטבוליטים הדיפרנציאליים היו קשורים לתשעה מסלולים במצב החיובי והשלילי, בהתאמה (טבלה 1 וטבלה 2). באיור 8, המסלולים המטבוליים מיוצגים כל אחד על-ידי בועה בתרשים הבועות, כאשר קנה מידה משמעותי יותר מצביע על גורם השפעה גדול יותר. גודל הנתיב המשפיע על הגורמים בניתוח הטופולוגיה מיוצג על ידי האבסיסה של תרשים הבועות וגודל הבועה. הקואורדינטה של תרשים הבועות וצבע הבועה מציינים את ערך P של ניתוח ההעשרה (אם ניקח את הלוגריתם הטבעי השלילי, כלומר −ln (p)). מידת ההעשרה משמעותית יותר, ערך P קטן יותר, ערך הקואורדינטות בולט יותר והצבע כהה יותר. ערך P וערך השפעה הם שני אינדיקטורים חשובים מאוד בבחירת מסלולים קריטיים. באופן כללי, ערך P חשוב יותר מערך ההשפעה.

Figure 8
איור 8: ניתוח נתיבים עבור קבוצת CRV לעומת קבוצת CR . (A) מצב חיובי ו-(B) מצב שלילי. המסלולים המטבוליים מיוצגים כל אחד על ידי בועה בתרשים הבועות. האבסיסה של תרשים הבועות וגודל הבועה מציינים את גודל הגורמים המשפיעים על הנתיב בניתוח הטופולוגיה. הקואורדינטה של תרשים הבועות וצבע הבועות מציינים את ערך P של ניתוח ההעשרה. המסלולים המטבוליים העיקריים כוללים ביוסינתזה של חומצות שומן בלתי רוויות ומטבוליזם של חומצה לינולאית. קיצורים: CR = קנה שורש Cyperi; CRV = CR מעובד עם חומץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 3 וטבלה 4 מראות מסלולים מטבוליים עם הבדלים משמעותיים - מטבוליזם של פנילאלנין ומטבוליזם של חומצה לינולאית, כמו גם ביוסינתזה של חומצות שומן בלתי רוויות, פנילאלנין, טירוזין, וטריפטופן. למרות שהמסלולים המטבוליים כללו ביוסינתזה של הורמונים סטרואידים, מטבוליזם של ספינגולפידים וחומצה ארכידונית, לא היו הבדלים משמעותיים, שהיו קשורים לדיסמנוריאה. התוצאות הראו כי מטבוליזם של חומצה לינולאית וביוסינתזה של חומצות שומן בלתי רוויות היו המסלולים המטבוליים הקריטיים הקשורים ליעילות המשופרת של CRV.

מרכיבים נספגים בדם
חמישה עשר מרכיבים ושני תוצרי חילוף חומרים מתמציות CRV ו-CR התגלו בסרום החולדות בקבוצות CR ו-CRV (טבלה 5). כל 17 הרכיבים נמצאו במצב יונים חיוביים.

רמות המרכיבים היחסיות בדגימות הדם של שתי הקבוצות הושוו באמצעות מבחן t של הסטודנט. האבסקיסה באיור 9 מציגה קבוצות ניסוי שונות; הקואורדינטה מייצגת את ערך התגובה של ספקטרום המסות. היו שני מרכיבים עם הבדלים משמעותיים. הניתוח הראה כי הרמות של שני רכיבים אלה היו גבוהות בקבוצת CRV בהשוואה לקבוצת CR, בעוד שהרמות של 15 אלמנטים לא הראו שינויים משמעותיים.

Figure 9
איור 9: מרכיבים שנספגו בדם עבור קבוצת CRV לעומת קבוצת CR. היו 15 מרכיבים ושני תוצרים של חילוף חומרים מתמציות CRV ו-CR בסרום החולדות בקבוצות CR ו-CRV. הניתוח הראה כי רמות של שני רכיבים בדם עלו בקבוצת CRV בהשוואה לקבוצת CR, בעוד שרמות הדם של 15 רכיבים לא הראו שינויים משמעותיים. ביניהם, רמת (-)-מירטנול ו-[(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl] חומצה אצטית בקבוצת CRV הייתה גבוהה משמעותית מאשר בקבוצת CR. * P < 0.05 או ** P < 0.01 מייצגים הבדל משמעותי בין קבוצת CRV לקבוצת CR. קיצורים: CR = קנה שורש Cyperi; CRV = CR מעובד עם חומץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הבדלים מטבוליים במצב חיובי. קיצורים: KEGG = אנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים; VIP = מובהקות משתנה בהקרנה; RT = זמן שמירה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: הבדלים מטבוליים במצב שלילי. קיצורים: KEGG = אנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים; VIP = מובהקות משתנה בהקרנה; RT = זמן שמירה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: ניתוח מסלולים מטבוליים במצב חיובי. קיצור: KEGG = אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4: ניתוח מסלולים מטבוליים במצב שלילי. קיצור: KEGG = אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 5: זיהוי מרכיבי האבטיפוס והמטבוליטים בסרום חולדות. הערה: M1 ו- M2 הם מטבוליטים; מרכיבים אחרים הם רכיבי אב-טיפוס. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קובץ משלים 1: דיאגרמות BPC וכרומטוגרמהMS 2 של המרכיבים שנספגו בדמם של עכברים עירומים. דיאגרמות BPC של כל דגימות בקרת האיכות במצבים חיוביים ושליליים; כרומטוגרמה MS 2 של 17 המרכיבים שנספגים בדמן של החולדות: D-camphene, (-)-myrtenol, ethylparaben, calamenene, α-cyperone, (+)-nootkatone, (1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]חומצה אצטית, 4-(2-(2.2.1)-bicycloheptylmethyl)חומצה בנזואית, 10,12-peroxycalamenene, (1aS,10aR)-1a,5,9-trimethyl-1a,3,6,10a-tetrahydrooxireno[4,5]cyclodeca[1,2-b ]furan-10(2H)-one, pterosin D, חומצה terrecyclic, sugeonyl אצטט, 3-אצטיל-13-deoxyphomenome, isocurcumenol, ligucyperonol, procurcumadiol. המטבוליטים הדיפרנציאליים המזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה משנית, כמו גם מסדי הנתונים HDMB ו- KEGG, במצבי היונים החיוביים והשליליים כלולים גם הם. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשל המגוון הרחב והאופי השונה של TCMs, צמחי מרפא אלה לפעמים לא עובדים בפועל קליני, וזה יכול להיות בגלל עיבוד לא מתאים decocting של TCMs. המנגנונים של TCM הופכים ברורים יותר עם השימוש במדע וטכנולוגיה עכשוויים29,30. מחקר זה מראה כי הן ל-CRV והן ל-CRV יש השפעות טיפוליות בחולדות מודל פרקינסון וכי ההשפעה הטיפולית של CRV משמעותית יותר. מנגנון הפעולה של CRV יכול להיות קשור לעובדה שעיבוד חומץ עשוי להשפיע על המרכיבים של CR שנספגים בדם ויכול להיות קשור למטבוליזם של חומצה לינולאית ולביוסינתזה של חומצות שומן בלתי רוויות. איור 10 מתאר את המסלולים האפשריים של פעולת CRV לשיכוך כאבים.

Figure 10
איור 10: מנגנונים של אפקט משכך כאבים משופר של CRV. התוצאות הראו כי 15 מרכיבים ושני מטבוליטים נמצאו בדם. ביניהם, רמות (-)-מירטנול ו-[(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl] חומצה אצטית בקבוצת CRV היו גבוהות במידה ניכרת מאשר בקבוצת CR. CRV יכול להפחית את הרמה של פרוסטנואידים מסדרה 2 ולויקוטריאנים מסדרה 4 המיוצרים מ- ARA ולהשיג השפעות משככות כאבים באמצעות אפנון חילוף החומרים של חומצה ארכידונית, ביוסינתזה של חומצות שומן בלתי רוויות ומטבוליזם של חומצה לינולאית. קיצורים: ARA = חומצה ארכידונית; COX = cyclooxygenase; LA = חומצה לינולאית; PUFA = חומצות שומן רב בלתי רוויות; GLA = חומצה γ-לינולנית; DGLA = דיהומו-γ-לינולני; PD = דיסמנוריאה ראשונית; PG = פרוסטגלנדין; LT = לויקוטריאנים; TX = טרומבוקסן; SDA = חומצה סטארידונית; ETA = חומצה איקוסאטראנואית; EPA = חומצה איקוסאפנטאנואית; CR = קנה שורש Cyperi; CRV = CR מעובד עם חומץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אמצעי זהירות במהלך הניסוי
מאז השמן של הרכיב היעיל של CR הוא נדיף, הזמן לחילוץ CR לא יעלה על 20 דקות, וכאשר הוא רותח, זה צריך להיות על אש נמוכה עם טמפרטורה לא יעלה על 60 מעלות צלזיוס במהלך הריכוז. כדי להבטיח מיצוי מוצלח של החומרים היעילים, עשבי תיבול חייב להיות ספוג במים לפחות 2 שעות לפני מרתח, כך עשבי תיבול רטובים כאשר השריה הושלמה. במהלך עיבוד CR, החומץ חייב להיות מעורבב היטב עם עשבי תיבול, כך החומץ יכול לחדור במלואם אליהם. אם נפח החומץ נמוך מכדי להרטיב את עשבי התיבול ביסודיות, ניתן להוסיף כמות קטנה של מים כדי לדלל את החומץ, ואז ניתן לערבב את החומץ במלואו עם עשבי התיבול. כאשר הערבוב הושלם, עשבי התיבול יספגו את כל החומץ. מאז חומץ מכיל חומצה אצטית, תערובת לא צריך לבוא במגע עם ברזל כדי למנוע תגובה כימית.

בניסוי החולדה, הזריקה התוך-צפקית הראשונה של אסטרדיול בנזואט ניתנת ביום 10, ואז ניתן הניהול התוך-קיבתי של תמצית CR או CRV, ולבסוף, ההזרקה התוך-צפקית של אוקסיטוצין מנוהלת. לאחר הזרקת intraperitoneal של אוקסיטוצין, החיה נצפתה במשך 30 דקות, הדם נלקח מיד. בדרך כלל, ריכוז הדם מגיע לשיא בתוך 1 שעה לאחר ניהול intragastric13, שהוא הזמן הטוב ביותר לקחת דם.

בעת קביעת דגימות התמצית והסרום לפי LC-MS/MS, יש לקבוע אותן באותה אצווה כדי להבטיח שזמן השמירה של אותו רכיב בדגימות שונות יהיה עקבי. בניסוי זה, זיהוי המרכיבים היה נקודה קשה. למרות שניתן להשתמש במסד נתונים בוגר יחסית למטבוליטים אנדוגניים, לא היה מסד נתונים תואם לזיהוי המרכיבים הנספגים בדם, ולכן יש לנקוט משנה זהירות בזיהוי.

הבדלים במרכיבים שנספגו בדם בין קבוצות CR ו- CRV
כדי לקבוע את המרכיב הפעיל של CR, ניסוי זה חקר את המרכיבים שנספגו בדם בחולדות מודל דיסמנוריאה. בניסוי זה נמצא כי 15 מרכיבים ושני מטבוליטים בדם נבדלו בין קבוצות CR ו-CRV. ביניהם, הרמות של (-)-myrtenol ו-[(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl] חומצה אצטית בקבוצת CRV היו גבוהות במידה ניכרת מאשר בקבוצת CR, אך רמות המרכיבים האחרים לא היו שונות באופן משמעותי. (-)-Myrtenol ו-[(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]חומצה אצטית הם טרפנואידים ונחשבים לרכיבים היעילים של CRV.

Ligucyperonol ו procurcumadiol מיוצרים על ידי חמצון של α-cyperone ו isocurcumenol, בהתאמה, ו α-cyperone יש אפקט משכך כאבים חזק. מנגנון הפעולה המוצע עשוי להפחית את ביטוי COX-2 המושרה על ידי LPS ואת סינתזת PGE2 באמצעות ויסות שלילי של איתות NF-kB31. (+)-נוטקטון מעכב גם פעילות COX-232,33. Isocurcumenol הוא מרכיב הליבה של קנה שורש Curcumae בטיפול dysmenorrhea3, ואת מטבוליט procurcumadiol שלה עשוי להיות אפקט משכך כאבים. בהשוואה לקבוצת CR, קבוצת CRV הראתה רמות גבוהות משמעותית של (-)-מירטנול, שיש לו אפקט משכך כאבים34. מנגנון הפעולה האפשרי עשוי להיות ששינויים בביטוי של COX-2 35 מעלים את רמות הציטוקין האנטי-דלקתי (IL-10, IFN-γ) ומפחיתים את רמות הציטוקינים מעודדי הדלקת (TNF-α, IL-1β)רמות 36. עיבוד עם חומץ משפר את רמות החומרים הפעילים בדם, אשר עשוי להיות הסיבה מוצרים המיוצרים עם חומץ יעילים יותר.

הבדלים במסלולים המטבוליים בין קבוצות CR ו- CRV
ניתוח מסלולים הראה מסלולים מטבוליים שונים באופן משמעותי בין קבוצות CR ו- CRV, כולל במונחים של מטבוליזם פנילאלנין, ביוסינתזה של חומצות שומן בלתי רוויות, פנילאלנין, טירוזין וביוסינתזה של טריפטופן, ומטבוליזם של חומצה לינולאית. עם זאת, המסלולים המטבוליים של מטבוליזם פנילאלנין וביוסינתזה של פנילאלנין, טירוזין, וטריפטופן אינם קשורים לפרקינסון. תוצאות אלה מראות כי המסלולים המטבוליים הקשורים ליעילות המשופרת של CRV הם מטבוליזם של חומצה לינולאית וביוסינתזה של חומצות שומן בלתי רוויות.

חומצות שומן בלתי רוויות כוללות שני סוגים: אומגה 3 ואומגה 637. שלושה מבשרי מתווכים, כולל חומצה איקוסאפנטאנואית (20:5ω3; EPA), חומצה דוקוסהקסאנואית (22:5ω3; DHA), וחומצה ארכידונית (20:5ω6; ARA), מעורבים בביוסינתזה של חומצות שומן בלתי רוויות מסלול37,38. מטבוליזם EPA ו- ARA מייצרים שניהם פרוסטגלנדינים ולויקוטריאנים תחת הפעולה של COX. ARA מייצרת פרוסטנואידים מסדרה 2, כולל PGF 2 α, PGE 2, PGI 2 וטרומבוקסאן (TXA 2, TXB 2), ולויקוטריאנים מסדרה 4, כולל לויקוטרין A 4 (LTA 4), לויקוטרין B 4 (LTB 4), לויקוטרין C 4 (LTC 4) ולויקוטרין D 4 (LTD 4). הפרוסטנואידים מסדרה 3 כוללים פרוסטגלנדין E 3 (PGE 3), פרוסטציקלין I 3 (PGI 3) וטרומבוקסאן A2 (TXA 3), והלויקוטריאנים מסדרה 5 כוללים לויקוטרין A 5 (LTA 5), לויקוטרין B 5 (LTB 5), לויקוטרין C 5 (LTC 5) ולויקוטרין D 5 (LTD 5), המיוצרים בעיקר על ידי EPA.

תהליך הטרנספורמציה של EPA זהה לזה של ARA ומתווך על ידי אנזימים דומים39. לפרוסטנואידים מסדרה 2 וללויקוטריאנים מסדרה 4 יש בעיקר השפעות פרו-דלקתיות, צבירת טסיות דם והתכווצות כלי דם. לעומת זאת, פרוסטנואידים מסדרה 3 ולויקוטריאנים מסדרה 5 הדגימו השפעות נוגדות דלקת, נוגדות טסיות ומרחיבות כלי דם38. TXA 2 ו- TXB2 מיוצרים מ- ARA, מה שגורם לכלי הדם להיצר. PGI 3, PGE 3 ו-TXA3 שמקורם ב-EPA פועלים רק כמרחיבי כלי דם38,40. EPA ו-ARA מתחרים על המרה ל-PGs על ידי האנזים COX. כאשר יחס EPA/AA של הממברנה גדל, האיקוסנואידים PGI 2 ו-TXA2, המקדמים צבירה, יכולים להפוך ל-TXA 3 ו-PGI3, המקדמים אנטי-אגרגציה, וכתוצאה מכך השפעות אנטי-דלקתיות ונוגדות אגרגטוריות40. בנוסף, שימוש משולב של EPA, DHA וחומצה לינולאית (C18:2ω6; LIN) יכול להפחית שחרור PGF 2 α ו-PGE2 ברירית הרחם של בקר ובטרופובלסטים41,42.

PD נגרמת ככל הנראה על ידי ייצור של PGs ו leukotrienes 43,44,45, במיוחד PGs 46. בינתיים, חוסר איזון בוזופרסין, β-אנדורפינים, אסטרוגן, פרוגסטרון, מוליכים עצביים, IL, ET-1 ו-NO עשוי להיות קשור גם לדיסמנוריאה47. על פי תוצאות ELISA, רמות PGF 2α ו-PGF 2α/PGE 2 בקבוצת CRV ירדו, בעוד שרמת PGE2 עלתה ביחס לקבוצת CR. בנוסף, לויקוטרין B4 (C02165) ופרוסטגלנדין J2 (C05957) היו נמוכים יותר בקבוצת CRV. זה מצביע על כך שבקבוצת CRV היו רמות נמוכות יותר של פרוסטנואידים מסדרה 2 העשויים מ-ARA, כולל PGF2α, שהוא הגורם החשוב ביותר לדיסמנוריאה. טיפול ב-PGE 2 בריכוזים גבוהים מרחיב את כלי הדם, ו-PGE2 גורם להיצרות כלי הדם בריכוזים נמוכים48. לכן, הרחם הוא רגוע עם vasodilation, dysmenorrhea הוא הקלה.

מכיוון שגוף האדם אינו יכול לסנתז כמות מספקת של חומצות שומן בלתי רוויות C18, חומצה לינולאית וחומצה α-לינולנית, שהן המקור היחיד לחומצות שומן בלתי רוויות C18, חשובות מאוד38. חומצה לינולאית וחומצה α-לינולנית הן המקור למטבוליזם של חומצות שומן בלתי רוויות מסוג אומגה-6 ואומגה-3, בהתאמה. בפרט, המבשר של סינתזת פרוסטגלנדין הוא ARA, ו- ARA מסונתז מחומצה לינולאית49. חומצה לינולאית היא קודמן, וסדרה של מטבוליטים מסונתזים ממנה, כולל ARA, פרוסטגלנדינים (PGF 2 α, PGE 2), פרוסטטיקלין (PGI 2) וטרומבוקסאן (TXA 2)50. חומצה לינולאית קשורה קשר הדוק לאפקט משכך כאבים משופר של CRV. יתר על כן, המסלול המטבולי של ביוסינתזה של הורמונים סטרואידים יכול לייצר פרוגסטרון 51,52,53 וספינגוזין-1-פוספט (C06124), המיוצרים על ידי המסלול המטבולי של מטבוליזם ספינגולפידים, לגרום COX-2, ולייצר PGE2 עד TNF54,55,56,57. אלה עשויים להיות קשורים גם למחלת פרקינסון.

יש כמה מגבלות לפרוטוקול. רק הרמות היחסיות של המרכיבים הושוו, והמדגם הסטנדרטי לא שימש לכימות המרכיבים בצמח ואלה שנספגו בדם. הצואה והשתן של חולדות לא נאספו בניסויים בבעלי חיים, וכתוצאה מכך התגלו פחות מטבוליטים של CR in vivo. ניסויי תיקוף אמורים לאשר עוד יותר את המנגנון שהתגלה על ידי ניתוח מטבונומי.

האסטרטגיה והפרוטוקול ששימשו במחקר זה מנעו עיוורון בחקר רכיבים כימיים במבחנה ובמחקר חד-צדדי של רכיבים בודדים in vivo. לכן, זה היה מתאים מאוד לחקר מנגנון. האסטרטגיה יכולה לחסוך הרבה זמן ועבודה ויכולה לזהות במדויק את המרכיבים הקריטיים ואת המנגנון ליעילות הטיפולית.

במחקר זה, נמצא כי היו 15 מרכיבים ושני מטבוליטים בדם. ביניהם, רמות (-)-מירטנול ו-[(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl] חומצה אצטית עלו באופן משמעותי בקבוצת CRV בהשוואה לקבוצת CR, מה שמראה כי עיבוד עם חומץ יכול להעלות את רמות החומרים הפעילים בדם. לאחר עיבוד CR עם חומץ, ירדו הרמות של פרוסטנואידים מסדרה 2 ולויקוטריאנים מסדרה 4 עם תכונות פרו-דלקתיות, צבירת טסיות דם והתכווצות כלי דם, כולל PGF2α, לויקוטרין B4 ופרוסטגלנדין J2. זה עשוי להיות המנגנון שבו CRV מדגים אפקט משכך כאבים משופר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי ועדת הבריאות ותכנון המשפחה העירונית של צ'ונגצ'ינג פרויקט המדע והטכנולוגיה של הרפואה הסינית (מספר פרויקט: ZY201802297), פרויקט כללי של קרן צ'ונגצ'ינג למדעי הטבע (מספר פרויקט: cstc2019jcyj-msxmX065), אזור ההר המודרני של צ'ונגצ'ינג מאפיין יעילות גבוהה תוכנית גיבוש צוות חדשנות של מערכת טכנולוגיה חקלאית 2022 [10], ופרויקט בניית משמעת מפתח של ועדת הבריאות העירונית של צ'ונגצ'ינג של מטריה סינית עיבוד מדיקה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile  Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20 Beckman Coulter, Inc. MRZ15K047
Estradiol benzoate Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd C10042616
formic acid Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 177799
LC 30A system Shimadzu, Kyoto, Japan 228-45162-46
Olive oil Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd H25A11P111909
Oxytocin synthetic Zhejiang peptide biology Co., Ltd  2019092001
Rat PGF2α ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd 202101
Rat PGFE2 ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
Triple TOF 4600 system SCIEX, Framingham, MA, USA BK20641402
water Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 152720

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009 (2021).
  2. Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
  3. Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558 (2021).
  4. Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
  5. Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962 (2021).
  6. Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832 (2022).
  7. Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867 (2021).
  8. El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
  9. Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709 (2020).
  10. Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
  11. Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
  12. Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
  13. Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238 (2017).
  14. Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
  15. Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773 (2020).
  16. Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
  17. Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
  18. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  19. Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
  20. Zhao, L., Hartung, T. Metabonomics and toxicology. Methods in Molecular Biology. 1277, 209-231 (2015).
  21. Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
  22. Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
  23. Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
  24. Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
  25. Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763 (2021).
  26. Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642 (2021).
  27. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
  28. Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233 (2021).
  29. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  30. Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768 (2020).
  31. Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
  32. Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181 (2020).
  33. Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119 (2021).
  34. Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448 (2020).
  35. Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
  36. Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
  37. Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
  38. Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
  39. Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966 (2019).
  40. Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
  41. Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
  42. Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
  43. Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F. Adolescent dysmenorrhea. Endocrine Development. 22, 171-180 (2012).
  44. Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
  45. Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N. Prostaglandin level of primary dysmenorrhea pain sufferers. Enfermería Clínica. 30, 5-9 (2020).
  46. Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
  47. Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191 (2020).
  48. Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683 (2019).
  49. Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628 (2020).
  50. Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
  51. Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
  52. Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
  53. Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555 (2018).
  54. Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
  55. Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
  56. Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
  57. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).

Tags

פסילה גיליון 190
ניתוח דגימות Rhizoma Cyperi גולמיות ומעובדות באמצעות ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית-טנדם בחולדות עם דיסמנוריאה ראשונית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., … More

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., Chu, R., Li, S. Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea. J. Vis. Exp. (190), e64691, doi:10.3791/64691 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter