Summary
여기에서는 원발성 월경통이 있는 쥐에서 초고성능 액체 크로마토그래피-고분해능 탠덤 질량분석법(UPLC-MS/MS)을 사용하여 원시 및 가공된 Cyperi rhizoma(CR) 샘플의 비교 분석을 제시합니다. 대사 산물 및 샘플 성분의 혈중 농도 변화는 CR로 처리 된 쥐와 식초로 처리 된 CR (CRV) 사이에서 조사되었습니다.
Abstract
Cyperi rhizoma (CR)는 산부인과에서 널리 사용되며 중국의 여성 질병 치료를위한 일반 의약품입니다. 식초로 처리한 후 CR의 진통 효과가 향상되기 때문에 식초로 처리한 CR(CRV)은 일반적으로 임상적으로 사용됩니다. 그러나, 식초 가공에 의해 진통 효과가 향상되는 메커니즘은 불분명하다. 이 연구에서는 초고압 액체 크로마토그래피탠덤 질량분석법(UPLC-MS/MS) 기술을 사용하여 월경통이 있는 CR 처리 쥐와 CRV 처리 쥐 사이의 외인성 성분 및 대사 산물의 혈중 농도 변화를 조사했습니다. 그 결과 이 쥐의 혈액에서 15가지 성분과 2가지 대사 산물의 수준이 다른 것으로 나타났습니다. 그 중에서도 CRV 그룹의 (-)-myrtenol 및 [(1R, 2S, 3R, 4R) -3- 하이드 록시 -1,4,7,7- 테트라 메틸 사이클로 [2.2.1] 헵트 -2- 일] 아세트산의 수준은 CR 그룹보다 상당히 높았다. CRV는 전염증, 혈소판 응집 및 혈관 수축 활성이 있는 2 시리즈 프로스타노이드 및 4 시리즈 류코트리엔의 수준을 감소시키고 아라키돈산 및 리놀레산 대사와 불포화 지방산의 생합성을 조절하여 진통 효과를 제공했습니다. 이 연구는 식초 가공이 CR의 진통 효과를 향상시키고 CRV의 작용 메커니즘에 대한 우리의 이해에 기여한다는 것을 보여주었습니다.
Introduction
원발성 월경통(PD)은 임상 산부인과에서 가장 흔한 상태입니다. 생식 기관의 골반 병리 없이 월경 전이나 월경 중 요통, 부기, 복통 또는 불편함이 특징입니다1. 유병률에 대한 보고서에 따르면 학생의 85.7%가 PD2를 앓고 있습니다. 저용량 경구 피임약이 표준 치료법이지만 심부 정맥 혈전증과 같은 부작용이 점점 더 주목을 받고 있다3. 경구 피임약 사용자 중 심부 정맥 혈전증의 유병률은 여성 1,000명당 >1명이며, 위험은 처음 6-12개월과 40세 이상 사용자 사이에서 가장 높다4.
중국 전통 의학(TCM)에서 오랫동안 사용된 Cyperi rhizoma(CR)는 Cyperaceae 계통의 Cyperus rotundus L.의 말린 뿌리줄기에서 파생됩니다. CR은 월경 장애를 조절하고 우울증과 통증을 완화합니다5. CR은 산부인과에서 널리 사용되며 여성의 질병을 치료하는 일반 의학으로 간주됩니다6. 식초로 처리된 CR(CRV)은 일반적으로 임상적으로 사용됩니다. CR과 비교하여 CRV는 월경 및 통증 완화에 대한 강화된 조절을 보여줍니다. 현대 연구에 따르면 CR은 cyclooxygenase-2 (COX-2)와 프로스타글란딘 (PG)의 후속 합성을 억제하여 항 염증 효과를 얻습니다. 한편, CR은 부작용 없이 진통 효과를 나타내므로7 CR은 월경통 환자에게 좋은 선택이 된다. 그러나 CRV에 의한 월경 조절 및 통증 완화 제공의 기본 메커니즘은 불분명합니다. CR 연구는 주로 항염증제, 항우울제 및 진통 효과와 같은 활성 화학 성분 및 약리학적 활성의 변화에 중점을 두었습니다 8,9,10,11,12.
TCM의 성분은 복잡하지만 혈액에 흡수되어 특정 혈중 농도에 도달해야 효과가 있다13. TCM의 활성 성분을 스크리닝하는 범위는 혈액 내 성분 결정 전략을 활용하여 좁힐 수 있습니다. 시험관 내에서 화학 성분을 연구할 때 실명을 피할 수 있고, 개별 성분14을 연구할 때 일방성을 피할 수 있다. 혈액 내 CR과 CRV의 조성을 비교함으로써 처리된 CR의 활성 성분 변화를 효과적이고 빠르게 감지할 수 있습니다. 약물 효능은 약물이 신체에 영향을 미치는 과정입니다. 약물의 작용 메커니즘과 관련이있을 수있는 신체의 대사 반응으로 인한 약물 성분의 변화는 대사 학으로 결정할 수 있습니다. 대사노학(Metabonomics)은 중국 전통 의학의 전반적인 효능을 결정하는 것과 일치하는 전체적이고 역동적인 대사 반응을 측정하는 것을 목표로 한다15. 또한, 대사산물은 유전자 발현의 최종 산물이며, 이는 표현형과 가장 밀접한 관련이 있다16. 따라서, 대사노학은 PD의 치료에서 CR과 CRV 사이의 대사 경로의 차이를 탐색하는 데 적합할 수 있다. 액체 크로마토그래피-고분해능 탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 기반 비표적 대사체학은 높은 처리량, 높은 감도 및 고분해능을 특징으로 하며 다양한 소분자 성분을 측정하는 데 사용할 수 있다17,18 . 이 방법은 혈액에 흡수 된 내인성 대사 산물과 외인성 성분을 동시에 결정할 수 있습니다. 대사노학은 TCM19, 약물 독성학 20, 건강 관리 21, 스포츠22, 식품 23 및 기타 분야에 대한 연구에서 널리 사용되었습니다.
본 연구에서는 CRV의 진통 효과 기전을 밝히기 위해 LC-MS/MS 기반 비표적 대사체학을 사용하여 CR 처리된 월경통 모델 쥐와 CRV 처리된 월경통 모델 쥐 사이에서 혈액에 흡수된 외인성 성분과 내인성 대사산물의 차이를 측정했습니다.
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Protocol
모든 동물 관련 실험은 충칭 중의학연구소 실험윤리위원회의 승인을 받아 수행되었다. 8-10주령이고 체중이 200g± 20g인 24마리의 암컷 Sprague Dawley 쥐(SD)를 이 실험에 사용했습니다.
1. 추출의 제조
- 계산
- CR 또는 CRV 추출물을 6마리의 Sprague-Dawley 쥐(10g/[kg∙day])의 처리군에 3일 동안 투여할 계획입니다. 1g/mL의 CR 또는 CRV 추출물 농도를 사용하십시오(추출물 1mL는 허브 1g에서 얻음).
참고: CR의 복용량은 6-10g입니다. 본 연구에서는 최대 용량 10g을 투약량으로 사용하였다. 성인의 평균 체중이 60kg이므로 성인 복용량은 0.1667g/kg입니다. 체중 변환 알고리즘(24)에 따르면, 인간과 래트 사이의 용량 변환 계수가 6.3이므로, 래트에 대한 용량은 1.05g/kg이다. 쥐의 경우 약물 용량을 10배 증가시켜 10.5g/kg으로 늘렸습니다. 투여량은 계산 및 실제 실험의 편의를 위해 10g/kg으로 설정하였다. 예를 들어, 계산에 의해, 총 36g의 CR 또는 CRV가 필요한 경우, 한약재는 적어도 두 번 준비되어야한다. 따라서, 200 g의 CR이 필요하였고, 100 g의 CR을 CR로 사용하였고, 100 g의 CR을 CRV로 가공하였다. - 방정식 (1)을 사용하여 쥐당 적용될 CR 또는 CRV의 부피를 계산합니다.
V = 10g/(kg∙day) × 200g/(1g/mL) = 2mL (1)
- CR 또는 CRV 추출물을 6마리의 Sprague-Dawley 쥐(10g/[kg∙day])의 처리군에 3일 동안 투여할 계획입니다. 1g/mL의 CR 또는 CRV 추출물 농도를 사용하십시오(추출물 1mL는 허브 1g에서 얻음).
- CRV 처리
- CR 100g과 식초 20g(아세트산 >5.5g/100mL)을 완전히 섞고 12시간 동안 배양합니다.
알림: 12시간 후 식초로 CR의 내부를 적시도록 CR과 식초를 혼합하고 잘 저어준 다음 내부가 촉촉해질 때까지 다시 저어줍니다. - 혼합물을 110-120°C에서 10분 동안 철 팬에서 볶습니다. 그런 다음 혼합물을 꺼내 실온에서 식히십시오.
알림: CR이 타는 것을 방지하려면 가열하면서 계속 저어주어야 합니다. 처리된 CRV가 너무 습한 경우 60°C에서 건조할 수 있습니다. CR의 표면이 세피아일 때, 볶음은 멈출 수 있습니다.
- CR 100g과 식초 20g(아세트산 >5.5g/100mL)을 완전히 섞고 12시간 동안 배양합니다.
- 추출
- CR 추출물
- CR에 순수한 물의 10배(CR 양)를 넣고 2시간 동안 담근다. 몸을 담글 때 약재가 액체 수준보다 낮은지 확인하십시오.
알림: CR은 추출 전에 반으로 자르기만 하면 됩니다. 담그는 목적은 활성 성분을 보다 효과적으로 추출하는 것입니다. 몸을 담그는 과정은 필수적입니다. - 물과 약의 혼합물을 센 불에서 끓이다가 약한 불에서 20분간 끓인다. 여과포(100메쉬)로 여과하고, 여과액을 수집한다.
알림: 달일 때 끓이기 전에 고열을 사용하고 끓임을 유지하기 위해 약한 열을 사용했습니다. - 1.3.1.2 단계를 한 번 반복하고 여과액을 결합합니다.
- 회전 증발기로 추출물을 1g/mL로 농축합니다(원래 약 기준, 농도 온도는 60°C 미만이어야 함).
참고: CR의 활성 성분은 휘발성이므로 농도 온도는 60°C를 넘지 않아야 합니다.
- CR에 순수한 물의 10배(CR 양)를 넣고 2시간 동안 담근다. 몸을 담글 때 약재가 액체 수준보다 낮은지 확인하십시오.
- CRV 추출물
- CR 추출 방법과 동일한 단계(1.3.1.1-1.3.1.3)를 수행합니다.
- 테스트용 CR 추출물
- CR 추출물 500 μL와 메탄올 500 μL를 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 넣고 30초 동안 와동하여 혼합한다.
알림: 메탄올과 물의 혼합물은 활성 성분을 더 잘 추출합니다. 테스트를 위해 추출을 직접 필터링해서는 안 됩니다. - 각 샘플을 4°C에서 1,6502 × g 에서 15분 동안 원심분리한다. 상층액을 걸러낸 다음 테스트를 위해 샘플 바이알로 옮깁니다.
참고: 메탄올과 추출물 혼합물의 고속 원심분리 후 상층액을 여과 없이 측정을 위해 샘플 병으로 직접 옮길 수 있습니다. 원심분리 과정에서 발생하는 열로 인해, 극저온 원심분리기를 사용하는 것이 바람직하다.
- CR 추출물 500 μL와 메탄올 500 μL를 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 넣고 30초 동안 와동하여 혼합한다.
- 테스트용 CRV 추출물
- 1.3.3.1-1.3.3.2단계를 수행하여 테스트할 CRV 추출을 준비합니다.
- CR 추출물
2. 동물
- 계산
- 에스트라디올 벤조에이트 50mg을 취하여 올리브 오일 50mL에 첨가하여 1mg/mL 용액을 제조합니다. 옥시토신 50mg을 취하여 생리식염수 50mL에 넣어 1mg/mL 용액을 만든다.
참고: 에스트라디올 벤조에이트와 옥시토신의 복강내 주사량은 10mg/(kg∙day)입니다. 에스트라디올 벤조에이트는 올리브 오일에 용해되고 옥시토신은 생리식염수에 용해됩니다. 에스트라디올 벤조에이트는 올리브 오일에 용해되기 쉽지 않으며 용해를 가속화하기 위해 초음파로 치료할 수 있습니다. 에스트라디올 벤조에이트와 옥시토신 용액은 모두 매일 준비해야 합니다. - 쥐당 적용할 에스트라디올 벤조에이트 용액의 부피를 계산합니다(즉, V = 10mg/[kg∙day] × 200g/[1g/mL] = 2mL). 쥐당 적용할 옥시토신 용액의 부피를 계산합니다(즉, V = 10mg/[kg∙day] × 200g/[1g/mL] = 2mL).
- 에스트라디올 벤조에이트 50mg을 취하여 올리브 오일 50mL에 첨가하여 1mg/mL 용액을 제조합니다. 옥시토신 50mg을 취하여 생리식염수 50mL에 넣어 1mg/mL 용액을 만든다.
- 동물 그룹화 및 관리
참고: 관리25,26에 10일이 할당되었습니다. 치료하는 동안 쥐는 표준 차우와 물에 무제한으로 접근할 수 있었습니다. 옥시토신 투여 후 30분 이내에 각 쥐의 몸부림치는 활동을 추적했습니다. PD 쥐 모델은 자궁 수축, 한쪽 사지 회전, 뒷다리 확장, 속이 빈 몸통 및 복부 수축을 포함하는 모델 쥐의 비틀림 반응에 의해 입증된 바와 같이 성공적으로 개발되었다26.- 24마리의 암컷 Sprague-Dawley 쥐(SD 쥐, 8-10주령, 체중 200g± 20g)를 무작위 대조, 모델, CR 및 CRV의 4개 그룹으로 할당하고 7일 동안 먹이십시오.
- 동물 관리
- 모델, CR 및 CRV 그룹의 쥐에게 매일 2mL의 에스트라디올 벤조에이트 용액을 복강 주사합니다. 대조군의 랫트에게 생리식염수 2mL를 복강주사한다.
- 8일째부터 2.2.2.1단계를 완료합니다. 그런 다음 CRV 그룹의 쥐에게 CRV 추출물 2mL, CR 그룹의 쥐에게 CR 추출물 2mL, 대조군 및 모델 그룹의 쥐에게 생리 식염수 2mL를 위내 투여합니다.
- 10일째에 2.2.2.2단계를 완료합니다. 그 후, 모델, CR 및 CRV 그룹의 랫트에게 2 mL의 옥시토신 용액을, 대조군의 래트에게 2 mL의 생리식염수를 복강 주사한다.
- 옥시토신 주사 후 30분 이내에 쥐의 몸부림 시간을 기록합니다.
- 시료 채취
- 복부 대동맥 혈액 샘플을 수집하고 자궁을 신속하고 완전하게 절제하고 자궁벽에 부착 된 결합 조직과 지방을 조심스럽게 분리합니다.
참고: 혈액은 최종 투여 후 1시간 이내에 거의 수집되었습니다. - 미세 원심 분리기 튜브를 사용하여 자궁 조직을 보존하고 액체 질소로 옮깁니다. 조직 샘플을 -80°C에서 보관한다.
- 혈액 샘플을 4,125 × g에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 혈청 함유 상층액을 제거하고, 4°C에서 10분 동안 16,502 × g 에서 원심분리하였다. 혈청을 원심분리한 다음 -80°C의 튜브에 보관하여 보관합니다.
알림: 혈액 샘플은 재처리를 위해 실온에서 1시간 동안 방치해야 합니다.
- 복부 대동맥 혈액 샘플을 수집하고 자궁을 신속하고 완전하게 절제하고 자궁벽에 부착 된 결합 조직과 지방을 조심스럽게 분리합니다.
- 시료 처리
- 혈청 샘플
- 메탄올 400μL와 혈청 200μL를 미세원심분리기 튜브에 넣고 30초 동안 소용돌이치며 혼합합니다. 각 샘플을 4°C에서 16,502 × g 에서 15분 동안 원심분리한다. 수집 및 여과 후 상청액으로 샘플 병을 채웁니다. 각 샘플의 모든 상층액을 동일한 부피로 혼합하여 테스트를 위한 품질 관리 샘플을 준비합니다.
- 자궁 조직 샘플
- 동측 분절에서 자궁 조직 100mg을 취하여 9 배의 생리 식염수로 갈아줍니다. 균질액을 4,125 × g에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 수집한다. 테스트를 위해 4 °C의 냉장고에 상등액을 넣거나 같은 날 테스트하지 않을 경우 -80 °C에 두십시오.
- 생리식염수, 티슈, 강구를 2mL 미세원심분리관에 넣고 미세원심분리관을 액체질소에 3-5초 동안 넣은 후 티슈를 티슈 그라인더에 넣어 분쇄한다.
- 혈청 샘플
- 샘플 테스트
- 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 래트 샘플의 자궁 조직 내 PGF2α 및 PGE2 함량을 측정합니다.
참고: PGE2 함량을 측정하기 위해 쥐PGE2 ELISA 키트를 사용하였고, PGF 2α 수준을 측정하기 위해 쥐 PGF2α ELISA 키트를 사용하였다. 자세한 단계는 제조업체의 지침에서 찾을 수 있습니다. 키트의 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다. - UPLC-MS/MS를 사용하여 혈청 샘플, CR 추출물 및 CRV 추출물을 평가합니다.
- UPLC의 경우 C18 컬럼(2.6μm, 2.1mm x 100mm)과 0.1% 포름산을 함유한 이동상 A와 아세토니트릴을 함유한 이동상 B를 사용하는 이원 그래디언트 분석법을 사용합니다. 용출 구배를 다음과 같이 설정하십시오: 0분에서 1분, 15% B; 1 분 내지 8.5 분, 15 % 내지 85 % B; 8.5 분에서 11.5 분까지, 85 % B; 11.5 분에서 11.6 분까지, 99 %에서 1 % B까지; 11.6 분에서 15 분까지, 15 % B. 유속을 0.35mL/분으로, 주입량을 2μL로 설정합니다.
- MS의 경우 온도를 600°C로, 커튼 가스(CUR) 유량을 0.17MPa로, 외장 및 보조 가스 유량을 모두 0.38MPa로 설정합니다. 양이온 모드와 음이온 모드의 이온 스프레이 전압을 각각 5.5kV 및 -4.5kV로 설정하고, DP(Declustering Potential) 전압을 80V 또는 -80V로, 충돌 에너지(CE)를 40eV 또는 -25eV로, 충돌 에너지 중첩(CES)을 35eV ± 15eV로 설정합니다.
- UPLC-MS/MS를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 테스트를 수행합니다. 50-1,000 m/z의 질량 범위에서 MS를 수행합니다.
- 검출 모드의 정보 종속 수집, 다중 질량 결함 필터 및 동적 배경 추론과 함께 일치하는 워크스테이션 프로그램을 사용하여 UPLC-MS/MS 결과를 얻을 수 있습니다. 풀링된 혈청의 품질 관리 샘플을 사용하여 UPLC-MS/MS 장비의 반복성과 안정성을 테스트하여 기존 접근 방식을 검증합니다. 연구 표본의 앞에, 4개의 연속적인 달리기를 위한 품질 관리 표본을 주사하고, 그 후에 매 5개의 혈청 표본 후에 그(것)들을 주사하십시오.
- 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 래트 샘플의 자궁 조직 내 PGF2α 및 PGE2 함량을 측정합니다.
3. 데이터 처리
- 데이터 준비
- 변환 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 mzXML 형식으로 변환합니다. 각 샘플의 총 이온 전류(TIC) 데이터를 정규화합니다.
참고: XCMS에 구축된 내부 R 기반 애플리케이션(www.lims2.com)을 사용하여 통합, 정렬, 추출 및 피크 검출을 위한 정보를 분석했습니다(27). - 독점적인 MS2 데이터베이스(www.lims2.com)를 사용하여 대사산물 주석을 수행합니다. 주석 임계값을 0.328로 설정합니다.
참고: 내인성 대사산물은 각 그룹에서 확인되었습니다.
- 변환 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 mzXML 형식으로 변환합니다. 각 샘플의 총 이온 전류(TIC) 데이터를 정규화합니다.
- 주성분 분석 및 직교 부분 최소 제곱 판별 분석
- 해석 소프트웨어를 사용하여 주성분 분석(PCA) 및 모델링을 수행할 수 있습니다. 대사 산물의 표준화된 데이터를 분석 소프트웨어로 가져옵니다. 그런 다음 자동 맞춤 을 사용하여 해석 모델을 작성합니다. 마지막으로 score 를 사용하여 PCA의 점수 산점도를 구합니다.
참고: 각 그룹의 클러스터링은 PCA의 점수 산점도로 얻었습니다. PCA는 주로 개입 없이 차원 축소를 통해 샘플을 그룹화하는 비지도 분석 모드입니다. - 분석 소프트웨어를 사용하여 직교 부분 최소 제곱 판별 분석(OPLS-DA)을 수행할 수 있습니다.
- CR 및 CRV 그룹의 대사 산물에 대한 표준화된 데이터를 분석 소프트웨어로 가져옵니다.
- CR 그룹의 데이터를 생성된 CR 그룹으로 가져오고, CRV 그룹의 데이터를 생성된 CRV 그룹으로 가져옵니다.
참고: OPLS-DA는 지도 분석 모드이며 샘플을 그룹화해야 합니다. - 그런 다음 자동 맞춤 을 사용하여 분석 모델을 빌드하고 score 를 사용하여 OPLS-DA의 점수 산점도를 가져옵니다. 마지막으로, VIP를 사용하여 OPLS-DA의 프로젝션( VIP ) 값에서 변수 유의성을 확보하십시오.
참고: CR 및 CRV 그룹의 대사 산물의 투영(VIP) 값의 변수 유의성은 OPLS-DA를 통해 얻었습니다.
- 해석 소프트웨어를 사용하여 주성분 분석(PCA) 및 모델링을 수행할 수 있습니다. 대사 산물의 표준화된 데이터를 분석 소프트웨어로 가져옵니다. 그런 다음 자동 맞춤 을 사용하여 해석 모델을 작성합니다. 마지막으로 score 를 사용하여 PCA의 점수 산점도를 구합니다.
- 잠재적 차등 대사 산물의 식별
- 3.2.2.3단계에서 VIP 값이 1보다 큰 대사 산물을 선별합니다.
- 통계 소프트웨어를 사용하여 스튜던트 t-검정에 의해 3.3.1단계에서 선별된 대사산물의 P 값을 계산합니다.
참고: CR 및 CRV 그룹에서 잠재적 차등 대사산물의 유의미한 차이는 Student's t-test에 의해 결정되었습니다. 잠재적 차등 대사산물은 스튜던트 t-검정 p-값이 0.05<이고 투영에서 변수 유의성(VIP)이 1보다 큰 대사산물이었습니다. 표현은 화산 플롯을 사용하여 수행되었습니다.
- 차등 대사산물의 동정
- 3.3단계에서 잠재적인 차등 대사산물을 선별합니다. 3.1.2단계의 결과를 사용하여 이러한 차등 대사산물을 식별합니다.
참고: 소수의 잠재적 차등 대사산물이 확인되었고, 이들은 후보 차등 대사산물이 되었습니다. - KEGG 데이터베이스에서 일치시킬 차등 대사 산물을 선별합니다. 히트맵을 그려 CR 및 CRV 그룹의 차등 대사 산물의 변화를 보여줍니다.
참고: 소수의 후보 차등 대사산물이 일치하여 차등 대사산물이 되었습니다.
- 3.3단계에서 잠재적인 차등 대사산물을 선별합니다. 3.1.2단계의 결과를 사용하여 이러한 차등 대사산물을 식별합니다.
- 잠재적인 대사 경로 검사
- 다양한 대사 산물을 Metaboanalyst(www.metaboanalyst.ca) 데이터베이스에 업로드합니다.
- 경로 분석을 사용하여 잠재적인 대사 경로를 얻습니다.
참고: 잠재적인 대사 경로는 CR 및 CRV 그룹에서 얻었습니다. P 값과 영향 값은 중요한 경로를 선택하는 데 있어 두 가지 매우 중요한 지표였습니다. P 값이 영향 값보다 더 중요했습니다. 유의성은 0.05< P 값으로 정의되었습니다. 더 큰 영향 값은 더 나은 상관 관계와 관련이 있습니다. - 다양한 대사 산물을 KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) 데이터베이스에 업로드하여 잠재적인 대사 경로를 분석합니다.
참고: 대사 경로의 기능과 PD 사이의 관계도 고려해야 합니다. 중요한 대사 경로가 얻어졌습니다.
- 혈액에 흡수 된 성분의 식별
- 사내 MS2 데이터베이스(www.lims2.com), 인간 대사체 데이터베이스(HMDB), Massbank 및 Chemspider 데이터베이스를 사용하여 CR 및 CRV 추출물의 화학 성분을 식별합니다.
- CR 및 CRV 그룹에서 혈액으로 흡수된 성분을 결정하고 CR과 CRV 그룹 간의 구성 요소를 비교합니다.
참고: 혈액에 흡수된 성분은 CR 또는 CRV 그룹에서 검출되어야 하지만 대조군에서는 검출될 수 없습니다.
- 통계 분석
- 일변량 분석(UVA)과 분산 분석(ANOVA) 및 스튜던트 t-검정을 포함한 다변량 통계 방법을 사용하여 데이터를 분석합니다.
참고: 실험 정보는 통계 소프트웨어를 사용하여 평균 ± 표준 편차(±SD)로 표시되었습니다. P < 0.01은 매우 유의한 차이로 간주되었고, P < 0.05는 유의한 차이28을 나타냈다.
- 일변량 분석(UVA)과 분산 분석(ANOVA) 및 스튜던트 t-검정을 포함한 다변량 통계 방법을 사용하여 데이터를 분석합니다.
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Representative Results
월경통 모델 실험 분석
대조군에서는 30분 이내에 몸부림치는 반응이 없었는데, 이는 이 쥐들에게 통증을 유발하기 위해 옥시토신과 에스트라디올 벤조에이트를 복강 주사하지 않았기 때문입니다. 모델, CR 및 CRV 그룹의 쥐는 옥시토신 주사 후 상당한 몸부림 반응을 보였다. 이러한 결과는 월경통을 유발하는 에스트라디올 벤조에이트와 옥시토신 조합의 효능을 입증합니다. 모델과 대조군 간의 PGF 2α, PGE 2 및 PGF2α/PGE2 수준의 차이는 유의했으며(P < 0.001, P < 0.05), 모델의 효능을 입증했습니다(그림 1).
그림 1: 자궁 조직의 PGF 2 α 및 PGE2 함량 및 각 그룹의 몸부림 수. (A) 각 그룹의 자궁 조직 내 PGF2α 함량. (B) 각 그룹의 자궁 조직 내PGE2 함량. (C) 각 그룹의 자궁 조직 내 PGF 2 α/PGE2 함량. (D) 각 그룹의 몸부림치는 숫자. 컬럼은 4개 그룹(그룹당 6마리의 마우스)의 평균 ± SEM을 나타냅니다. *P < 0.05 또는 **P < 0.01은 모델군에 비해 유의한 차이를 나타내고,ΔP < 0.05 또는ΔΔ P < 0.01은 CR 군에 비해 유의한 차이를 나타낸다. 모델, CR 및 CRV 그룹의 쥐는 옥시토신 주사 후 상당한 몸부림 반응을 보였다. 약어: PG = 프로스타글란딘; CR = 사이페리 뿌리줄기; CRV = 식초로 처리 된 CR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PGF 2α 및 PGF 2α/PGE 2의 농도는 CRV 및 CR 그룹에서 감소하였고, 이러한 감소는 CRV 그룹에서 더 두드러졌다. 또한 CRV와 CR 그룹 사이에 PGF2α 및 PGF2α/PGE2의 농도에 유의한(P < 0.001 및 P < 0.05) 차이가 있었습니다. 모델 그룹과 비교하여,PGE2 농도는 CRV 및 CR 그룹에서 유의하게 더 컸고(P < 0.001), CRV 그룹에서 그 수준이 가장 많이 증가하였다.
품질 관리
BPC 크로마토그래피 피크의 머무름 시간과 품질 관리 샘플의 신호 강도 사이에 양호한 일치가 관찰되어 높은 수준의 기기 안정성과 매우 일관된 데이터 품질을 입증했습니다(보충 파일 1-보충 그림 1 및 보충 그림 2). 또한 모든 품질 관리 샘플은 ±2 표준 편차 이내였으며 (그림 2A, B) 품질 관리 샘플 간의 상관 관계는 0.7보다 컸습니다 (그림 2C, D). 이러한 결과는 절차가 신뢰할 수 있고 결과가 신뢰할 수 있음을 시사합니다.
그림 2: PCA-X 품질 관리 샘플의 1차원 분포. (A) 포지티브 모드, (B) 네거티브 모드; (C) 양성 모드 및 (D) 음성 모드에서 품질 관리 샘플의 상관 분석. 모든 품질 관리 샘플은 ±2 표준 편차 이내였으며 품질 관리 샘플 간의 상관 관계는 0.7보다 컸습니다. 이러한 결과는 절차가 신뢰할 수 있고 정보가 신뢰할 수 있음을 시사했습니다. 약어: PC = 주성분; PCA = 주성분 분석; 품질 관리; CR = 사이페리 뿌리줄기; CRV = 식초로 처리 된 CR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
주성분 분석
그림 3에서 볼 수 있듯이 가로 PC(1)는 첫 번째 주성분의 점수를 나타내고 세로좌표 PC(2)는 두 번째 주성분의 점수를 나타냅니다. 그림에서 녹색 원은 대조군, 빨간색 원은 모델 그룹, 파란색 원은 CR 그룹, 흰색 원은 CRV 그룹, 분홍색 원은 품질 관리 그룹을 나타냅니다.
그림 3: PCA의 점수 산점도 . (A) 포지티브 모드 및 (B) 네거티브 모드. 품질 관리 샘플이 겹쳐서 기기가 매우 안정적임을 나타냅니다. 각 그룹은 자체 영역에 분포되어 있으며 CR 그룹과 CRV 그룹만 때때로 경로를 교차합니다. 약어: PC = 주성분; PCA = 주성분 분석; QC = 품질 관리; CR = 사이페리 뿌리줄기; CRV = 식초로 처리 된 CR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PCA 분석 결과는 CR과 모델 그룹의 클러스터가 양이온 모드와 음이온 모드 모두에서 유의하게 분리되었음을 보여주었습니다. 클러스터는 양이온 및 음이온 모드에서 CRV와 모델 그룹 사이에서 유의하게 분리되었습니다. 품질관리군, 모델군, 대조군을 다른 처리군(CR, CRV)과 분리하였다. CR 및 CRV 그룹은 때때로 양이온 모드에서 겹칩니다. 음이온 모드에서, 각 그룹은 유의적으로 분리되었다.
직교 부분 최소 제곱법 판별 분석
OPLS-DA는 대사 차이를 스크리닝하는 데 사용되었습니다. OPLS-DA 산점도는 모든 샘플이 95% 신뢰 구간(Hotelling의 T-제곱 타원) 내에 있음을 보여주었습니다. 그림 4A, C는 CR 및 CRV 그룹이 분리되었음을 보여줍니다. 모델 과적합은 순열 테스트(n = 200)를 사용하여 테스트되었으며 모델의 통계적 유의성을 평가했습니다. 그림 4B,D에서 세로좌표는R2Y의 값 또는Q2 값을 나타내고 가로축은 대체 유지를 나타냅니다. R2Y는 녹색 점으로,Q2는 파란색 사각형 점으로 표시되며, 두 개의 점선은 해당 회귀선을 나타냅니다. 포지티브 및 네거티브 모드에서,R2Y값은 각각 0.8 및 0.84이고,Q2 값은 각각 -0.59 및 -0.57이었다. 이는 모델의 높은 신뢰성과 과적합이 없음을 보여줍니다.
그림 4: CR 그룹과 CRV 그룹에 대한 OPLS-DA 모델. (A) 양성 모드 및 (C) 부정 모드에서 산점도를 점수화합니다. (B) 양성 모드 및 (D) 음성 모드에서 CR 그룹 대 CRV 그룹에 대한 OPLS-DA 모델의 순열 테스트. R2Y는 양수 및 음수 모드에서 각각 0.8 및 0.84이고,Q2 는 각각 -0.59 및 -0.57이었다. 이는 모델의 높은 신뢰성과 과적합 동작이 없음을 보여줍니다. 약어: OPLS-DA = 직교 부분 최소 제곱 판별 분석; CR = 사이페리 뿌리줄기; CRV = 식초로 처리 된 CR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
일변량 통계 분석
대사 변이를 확인하기 위해 단변량 통계 분석이 수행되었습니다. VIP > 1 및 P < 0.05의 표준 스크리닝 하에서 339 및 394 잠재적 차등 대사 산물이 각각 양이온 및 음이온 모드에서 검출되었습니다. 화산 플롯은 그림 5에 나와 있으며, 여기서 각 점은 서로 다른 대사 산물에 해당합니다. 세로좌표는 스튜던트 t-검정의 P 값을 나타내고 가로축은 그룹의 각 분자 수준의 여러 변화를 반영합니다. 분산형 크기는 OPLS-DA 모델의 VIP 값을 나타냅니다. VIP 값은 분산의 크기에 따라 증가합니다. 빨간색 점은 증가를 나타내고 파란색 점은 감소를 나타내며 회색은 큰 차이가 없음을 나타냅니다.
후보 차등 대사산물의 정성적 분석은 2차 질량 분석법을 사용하여 수행되었습니다. 양성 모드의 63개 대사산물(보충 파일 1-보충 표 1)과 음성 모드의 30개 대사산물(보충 파일 1-보충 표 2)에서 유의한 변화가 관찰되었습니다. 차등 대사 산물은 KEGG 및 HDMB 데이터베이스를 사용하여 결정되었습니다. 정확하게 매칭된 화합물은 차등 대사산물로 확인되었으며, 이들은 표 3 및 표 4에 열거되어 있다.
그림 5: CR 그룹 대 CRV 그룹에 대한 화산 플롯. (A) 포지티브 모드 및 (B) 네거티브 모드. 표시된 화산 그래프에서 각 점은 다른 대사 산물에 해당합니다. 세로좌표는 스튜던트 t-검정의 P 값을 나타내고 가로축은 그룹 내 각 물질의 여러 변화를 반영합니다. 분산형 크기는 OPLS-DA 모델의 VIP 값을 나타냅니다. VIP 값은 분산의 크기에 따라 증가합니다. 빨간색 점은 증가를 나타내고 파란색 점은 감소를 나타내며 회색은 큰 차이가 없음을 나타냅니다. 약어: OPLS-DA = 직교 부분 최소 제곱 판별 분석; VIP = 투영에서 변수 유의성; CR = 사이페리 뿌리줄기; CRV = 식초로 처리 된 CR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대사 산물 비교
CR과 CRV 그룹 사이의 차등 대사산물의 정량적 값의 유클리드 거리 행렬을 계산하고, 차등 대사산물을 포괄적인 상관 접근법을 사용하여 클러스터링하였다.
가로축은 다른 실험 그룹을 나타내고 세로좌표는 그림 6의 상대적 수준을 나타냅니다. 색상 패치의 배치는 각 대사 산물이 다른 대사 산물에 비해 어떻게 표현되는지를 나타냅니다. 양이온 모드에서는 CR 그룹과 비교하여 CRV 그룹의 4 가지 차등 대사 산물 수준이 증가한 반면 11 개의 차동 대사 산물 수준은 감소했습니다. 음이온 모드에서는 CR 군과 비교하여 CRV 그룹의 4 가지 차동 대사 산물의 수준이 증가하고 7 개의 차동 대사 산물의 수준이 감소했습니다.
그림 6: CRV 그룹과 CR 그룹에 대한 히트맵 분석 . (A) 포지티브 모드 및 (B) 네거티브 모드. 가로축은 다른 실험군을 나타내고 세로좌표는 상대적 발현 수준을 나타냅니다. 색상 패치의 배치는 각 대사 산물이 다른 대사 산물에 비해 어떻게 표현되는지를 나타냅니다. 약어: CR = Cyperi rhizome; CRV = 식초로 처리 된 CR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CR 그룹과 비교하여 CRV 그룹에서 증가한 대사 산물은 스핑고신 1-포스페이트, 노빌레틴, 글리세로포스포콜린, 리솝(18:1(9z)), 2-하이드록시-6-펜타데실벤조산, 9,10-에폭시옥타데센산, 13s-하이드록시옥타데카디엔산 및 2-메톡시에스트론이었고, 감소한 것은 코르티코스테론, 인돌 아세트산, 글리코콜산, 베르베린, 디부틸프탈레이트, 레티놀, 류코트리엔 B4, 프로스타글란딘 J2, 21-하이드록시프레그네놀론, 제라놀, 호모시스테인, 프로피노산, 스테아르산, 도코사헥사엔산, 페닐아세틸글리신, L-페닐알라닌, 에스트론글루쿠로나이드, 구연산(그림 7).
그림 7: CRV 및 CR 그룹에서 잠재적 대사 산물의 상대적 수준 추세. (A) 포지티브 모드 및 (B) 네거티브 모드. 양성 모드에서는 CR 그룹과 비교하여 CRV 그룹에서 4 개의 차등 대사 산물의 수준이 증가하고 11의 수준이 감소했습니다. 음성 모드에서는 CRV 그룹에서 4 개의 차등 대사 산물의 수준이 증가하고 7 개의 차등 대사 산물의 수준이 감소했습니다. 컬럼은 4개 그룹(그룹당 6마리의 마우스)의 평균 ± SEM을 나타냅니다. *P < 0.05, **P < 0.01, 또는 ***P < 0.01은 CRV와 CR 그룹 사이의 유의한 차이를 나타낸다. 약어: CR = Cyperi rhizome; CRV = 식초로 처리 된 CR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
KEGG 경로 분석
차등 대사 산물에 주석을 달고 KEGG 경로를 분석했습니다. 결과는 차등 대사산물이 각각 양성 및 음성 모드에서 9개의 경로와 연관되어 있음을 보여주었습니다(표 1 및 표 2). 그림 8에서 대사 경로는 버블 차트에서 각각 버블로 표시되며, 더 중요한 척도는 더 큰 효과 계수를 나타냅니다. 토폴로지 분석의 요인에 영향을 미치는 경로의 크기는 버블 차트의 가로축과 버블 크기로 표시됩니다. 버블 차트의 세로축과 버블 색상은 농축 분석의 P 값을 나타냅니다(음의 자연 로그, 즉 −ln(p) 취함). 농축 정도가 더 중요하고, P 값이 더 작고, 세로좌표 값이 더 두드러지고, 색상이 더 어둡습니다. P 값과 영향 값은 중요한 경로 선택에서 매우 중요한 두 가지 지표입니다. 일반적으로 P 값이 영향 값보다 더 중요합니다.
그림 8: CRV 그룹 대 CR 그룹에 대한 경로 분석 . (A) 포지티브 모드 및 (B) 네거티브 모드. 대사 경로는 각각 버블 차트에서 버블로 표시됩니다. 버블 차트의 가로좌표와 버블 크기는 토폴로지 분석에서 경로에 영향을 미치는 요인의 크기를 나타냅니다. 거품형 차트의 세로축과 거품 색은 보강 분석의 P 값을 나타냅니다. 주요 대사 경로에는 불포화 지방산의 생합성과 리놀레산 대사가 포함됩니다. 약어: CR = Cyperi rhizome; CRV = 식초로 처리 된 CR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 3과 표 4는 페닐알라닌 대사와 리놀레산 대사뿐만 아니라 불포화 지방산, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판의 생합성과 같은 상당한 차이가 있는 대사 경로를 보여줍니다. 대사 경로에는 스테로이드 호르몬 생합성, 스핑고지질 및 아라키돈산 대사가 포함되었지만 월경통과 관련된 유의미한 차이는 없었습니다. 결과는 리놀레산 대사와 불포화 지방산의 생합성이 CRV의 향상된 효능과 관련된 중요한 대사 경로임을 보여주었습니다.
혈액에 흡수 된 성분
CRV 및 CR 추출물로부터의 15개의 성분 및 2개의 대사 산물이 CR 및 CRV 그룹의 래트 혈청에서 검출되었다(표 5). 17개 성분 모두 양이온 모드에서 발견되었습니다.
두 그룹의 혈액 샘플에서 상대적 구성 수준은 Student's t-test를 사용하여 비교되었습니다. 그림 9 의 가로축은 다양한 실험 그룹을 표시합니다. 세로좌표는 질량 스펙트럼의 반응 값을 나타냅니다. 중요한 차이점이 있는 두 가지 구성 요소가 있었습니다. 분석 결과 CRV 그룹에서 CRV 그룹에 비해 이 두 성분의 수준이 상승한 반면 15개 요소의 수준은 큰 변화가 없는 것으로 나타났습니다.
그림 9: CRV 그룹 대 CR 그룹의 혈액에 흡수된 성분. CR 및 CRV 그룹의 쥐 혈청에서 CRV 및 CR 추출물로부터의 15개의 성분 및 2개의 대사 산물이 있었다. 분석 결과 CRV 그룹은 CR 그룹에 비해 두 가지 성분의 혈중 농도가 증가한 반면 15개 성분의 혈중 농도는 큰 변화가 없는 것으로 나타났습니다. 그 중에서도 CRV 그룹의 (-)-myrtenol 및 [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acetic acid의 수준은 CR 그룹보다 상당히 높았다. *P < 0.05 또는 ** P < 0.01은 CRV 그룹과 CR 그룹 간의 유의한 차이를 나타낸다. 약어: CR = Cyperi rhizome; CRV = 식초로 처리 된 CR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 양성 모드의 대사 차이. 약어: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = 투영에서 변수 유의성; RT = 머무름 시간. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 음성 모드의 대사 차이. 약어: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = 투영에서 변수 유의성; RT = 머무름 시간. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 양성 모드의 대사 경로 분석. 약어: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4 음성 모드에서의 대사 경로 분석. 약어: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 5: 쥐 혈청에서 프로토타입 성분 및 대사산물의 식별. 참고: M1과 M2는 대사 산물입니다. 다른 성분은 프로토 타입 성분입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 누드 마우스의 혈액에 흡수된 성분의 BPC 다이어그램 및 MS2 크로마토그램. 포지티브 및 네거티브 모드의 모든 품질 관리 샘플의 BPC 다이어그램; 쥐의 혈액에 흡수 된 17 가지 성분의 MS 2 크로마토 그램 : D- 캄펜, (-) - 미르 테놀, 에틸 파라벤, 칼라 메넨, α- 사이 페론, (+) - 누 카톤, (1R, 2S, 3R, 4R) -3- 하이드 록시 -1,4,7,7- 테트라 메틸 시클로 [2.2.1] 헵트 -2- 일] 아세트산, 4- (2- (2.2.1) - 비 시클로 헵틸 메틸) 벤조산, 10,12- 퍼 옥시 칼라 메넨, (1a, 10aR) -1a, 5,9- 트리메틸 -1a, 3,6,10a- 테트라 히드로 옥시 레노 [4,5] 시클로 데카 [1,2-b ] 푸란 -10 (2H) -온, 프테로신 D, terrecyclic acid, 스게오닐 아세테이트, 3-아세틸-13-데옥시포메놈, 이소커쿠메놀, 리구시페로놀, 프로커쿠마디올. 양이온 및 음이온 모드에서 2차 질량 분석법과 HDMB 및 KEGG 데이터베이스로 식별된 차등 대사 산물도 포함됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
TCM의 다양하고 다양한 특성으로 인해 이러한 허브는 때때로 임상 실습에서 효과가 없으며 이는 TCM의 부적절한 가공 및 달임 때문일 수 있습니다. TCM의 메커니즘은 현대 과학 기술29,30의 사용으로 더욱 분명 해지고 있습니다. 이 연구는 CR과 CRV 모두 PD 모델 쥐에서 치료 효과가 있고 CRV의 치료 효과가 더 중요하다는 것을 보여줍니다. CRV의 작용 메커니즘은 식초 가공이 혈액에 흡수되는 CR 성분에 영향을 미칠 수 있고 리놀레산 대사 및 불포화 지방산의 생합성과 관련될 수 있다는 사실과 관련될 수 있습니다. 그림 10은 통증 완화에서 CRV 작용의 잠재적 경로를 보여줍니다.
그림 10: CRV의 향상된 진통 효과의 메커니즘. 그 결과 혈액에서 15 개의 성분과 2 개의 대사 산물이 발견되었습니다. 그 중에서도 CRV 그룹의 (-)-myrtenol 및 [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acetic acid의 수준은 CR 그룹보다 상당히 높았습니다. CRV는 ARA로 만든 2 시리즈 프로스타노이드 및 4 시리즈 류코트리엔의 수준을 낮추고 아라키돈산 대사, 불포화 지방산의 생합성 및 리놀레산 대사의 조절을 통해 진통 효과를 얻을 수 있습니다. 약어: ARA = 아라키돈산; COX = 사이클로옥시게나제; LA = 리놀레산; PUFA = 고도불포화 지방산; GLA = γ- 리놀렌산; DGLA = 디호모-γ-리놀렌산; PD = 원발성 월경통; PG = 프로스타글란딘; LT = 류코트리엔; TX = 트롬복산; SDA = 스테아리돈산; ETA = 에이코사테트라엔산; EPA = 에이코사펜타엔산; CR = 사이페리 뿌리줄기; CRV = 식초로 처리 된 CR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
실험 중 주의사항
CR의 유효성분의 오일은 휘발성이기 때문에 CR을 추출하는 시간은 20분을 초과하지 않아야 하며, 끓을 때는 농축시 60°C를 넘지 않는 온도로 저온에 두어야 한다. 유효 성분의 성공적인 추출을 보장하기 위해, 허브는 담그기가 완료 될 때 허브가 젖을 수 있도록 달인 전에 적어도 2 시간 동안 물에 담가야합니다. CR 처리 중에 식초가 허브와 잘 섞여 식초가 완전히 침투 할 수 있어야합니다. 식초 양이 너무 적어 허브를 완전히 적실 수 없는 경우 소량의 물을 첨가하여 식초를 희석한 다음 식초를 허브와 완전히 섞을 수 있습니다. 혼합이 완료되면 허브가 모든 식초를 흡수합니다. 식초에는 아세트산이 포함되어 있기 때문에 화학 반응을 피하기 위해 혼합물이 철과 접촉해서는 안됩니다.
쥐 실험에서 10 일째에 에스트라 디올 벤조 에이트의 첫 번째 복강 내 주사를 한 다음 CR 또는 CRV 추출물을 위 내 투여하고 마지막으로 옥시토신을 복강 내 주사합니다. 옥시토신을 복강 내 주사 한 후, 동물을 30 분 동안 관찰하고 즉시 혈액을 채취합니다. 보통, 혈중 농도는 위내 투여 후 1시간 이내에 최고조에 도달한다13, 이는 혈액을 채취하기에 가장 좋은 시기이다.
LC-MS/MS로 추출물 및 혈청 샘플을 측정할 때 동일한 배치에서 측정하여 서로 다른 샘플에서 동일한 성분의 머무름 시간이 일관되도록 해야 합니다. 이 실험에서는 성분의 식별이 어려운 점이었다. 내인성 대사 산물에 대해 비교적 성숙한 데이터베이스를 사용할 수 있지만 혈액에 흡수된 성분을 식별하기 위한 일치하는 데이터베이스가 없었기 때문에 식별에 더 많은 주의를 기울여야 합니다.
CR과 CRV 그룹 사이의 혈액에 흡수되는 성분의 차이
CR의 유효성분을 확인하기 위해, 본 실험은 월경통 모델 쥐에서 혈액에 흡수된 성분을 조사하였다. 이 실험에서 혈액 내 15개의 성분과 2개의 대사산물이 CR과 CRV 그룹 간에 차이가 있음을 발견했습니다. 그 중에서도 CRV 그룹의 (-)-myrtenol 및 [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acetic acid의 수준은 CR 그룹보다 상당히 높았지만 다른 성분의 수준은 크게 다르지 않았습니다. (-)-Myrtenol 및 [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acetic acid는 테르페노이드이며 CRV의 유효 성분으로 간주됩니다.
리구시페로놀과 프로쿠쿠마디올은 각각 α-사이페론과 이소쿠르쿠메놀의 산화에 의해 생성되며 α-사이페론은 강력한 진통 효과가 있습니다. 제안된 작용 기전은 NF-kB 신호전달의 음성 조절을 통해 LPS-유도된 COX-2 발현 및PGE2 합성을 감소시킬 수 있다31. (+)-Nootkatone은 또한 COX-2 활성을 억제합니다32,33. 이소커쿠메놀은 월경통3 치료에 있어 강황 근종의 핵심 성분이며 대사산물인 프로쿠르쿠마디올은 진통 효과가 있을 수 있습니다. CR 그룹과 비교하여, CRV 그룹은 상당히 높은 수준의 (-)-미르테놀을 나타내었으며, 이는 진통 효과가 있다34. 가능한 작용 기전은 COX-235의 발현 변화가 항염증성 사이토카인(IL-10, IFN-γ)의 수준을 증가시키고 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β) 수준을 감소시키는 것일 수 있다(36). 식초로 가공하면 혈액 내 활성 성분 수치가 향상되므로 식초로 생산된 제품이 더 효과적일 수 있습니다.
CR과 CRV 그룹 간의 대사 경로의 차이
경로 분석은 페닐알라닌 대사, 불포화 지방산, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 생합성의 생합성, 리놀레산 대사 측면에서 CR과 CRV 그룹 간에 상당히 다른 대사 경로를 보여주었습니다. 그러나 페닐알라닌 대사와 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 생합성의 대사 경로는 PD와 관련이 없습니다. 이러한 결과는 CRV의 향상된 효능과 관련된 대사 경로가 리놀레산 대사 및 불포화 지방산의 생합성임을 보여줍니다.
불포화 지방산에는 오메가-3와 오메가-637의 두 가지 유형이 있습니다. 에이코사펜타엔산(20:5ω3; EPA), 도코사헥사엔산(22:5ω3; DHA), 아라키돈산(20:5ω6; ARA), 불포화지방산 경로37,38의 생합성에 관여한다. EPA와 ARA 대사는 모두 COX의 작용하에 프로스타글란딘과 류코트리엔을 생성합니다. ARA는 PGF 2 α, PGE 2, PGI 2 및 트롬복산(TXA 2, TXB 2)을 포함한 2 계열 프로스타노이드와 류코트리엔 A 4(LTA 4), 류코트리엔 B 4(LTB 4), 류코트리엔 C4(LTC 4) 및 류코트리엔D4(LTD 4)를 포함하는 4 계열 류코트리엔을 생산합니다. 3 계열 프로스타노이드는 프로스타글란딘 E3(PGE 3), 프로스타사이클린I3(PGI 3) 및 트롬복산A2(TXA 3)를 포함하며, 5 계열 류코트리엔은 주로 EPA에서 생산되는 류코트리엔 A5(LTA5), 류코트리엔 B5(LTB 5), 류코트리엔 C5(LTC5) 및 류코트리엔 D5(LTD5)를 포함한다.
EPA의 형질전환 과정은 ARA의 형질전환 과정과 동일하며 유사한 효소에 의해 매개된다39. 2 시리즈 프로스타노이드와 4 시리즈 류코트리엔은 주로 염증 유발, 혈소판 응집 및 혈관 수축 효과가 있습니다. 대조적으로, 3 시리즈 프로스타노이드와 5 시리즈 류코트리엔은 항염증, 항혈소판 및 혈관 확장 효과를 나타낸다38. TXA 2와 TXB2는 ARA에서 생성되어 혈관을 좁히게 합니다. EPA 유래 PGI 3, PGE3 및 TXA3는 혈관확장제로서만 작용한다38,40. EPA와 ARA는 COX 효소에 의해 PG로 전환되기 위해 경쟁합니다. 멤브레인 EPA/AA 비율이 증가하면, 응집을 촉진하는 에이코사노이드 PGI2 및TXA2가 항응집을 촉진하는TXA3 및PGI3로 변형되어 항염증 및 항응집 효과를 얻을 수 있다(40). 또한 EPA, DHA 및 리놀레산 (C18 : 2ω6; LIN)은 소 자궁내막과 영양막에서 PGF2 α 및 PGE2 방출을 감소시킬 수 있다41,42.
PD는 PGs 및 류코트리엔 43,44,45, 특히 PGs 46의 생성에 의해 유발될 가능성이 있다. 한편, 바소프레신, β-엔돌핀, 에스트로겐, 프로게스테론, 신경전달물질, IL, ET-1 및 NO의 불균형도 월경통과 관련이 있을 수 있다47. ELISA 결과에 따르면, CRV 그룹의 PGF 2α 및 PGF 2α/PGE 2 수준은 감소한 반면, PGE2 수준은 CR 그룹에 비해 증가하였다. 또한 류코트리엔 B4 (C02165)와 프로스타글란딘 J2 (C05957)는 CRV 그룹에서 더 낮았다. 이는 CRV 그룹에서 월경통의 가장 중요한 인자인 PGF2α를 포함하여 ARA로 만든 2 시리즈 프로스타노이드의 수치가 더 낮았음을 나타냅니다. 고농도의 PGE 2 치료는 혈관을 확장시키고, PGE2는 저농도에서 혈관 수축을 일으킨다48. 따라서 자궁은 혈관 확장으로 이완되고 월경통이 완화됩니다.
인체는 충분한 양의 C18 불포화 지방산을 합성 할 수 없기 때문에 C18 불포화 지방산의 유일한 공급원 인 리놀레산과 α- 리놀렌산은 매우 중요합니다38. 리놀레산과 α-리놀렌산은 각각 오메가-6 및 오메가-3 불포화 지방산 대사의 원천입니다. 특히, 프로스타글란딘 합성의 전구체는 ARA이며, ARA는 리놀레산49로부터 합성된다. 리놀레산은 전구체이며 ARA, 프로스타글란딘(PGF 2 α, PGE 2), 프로스타사이클린(PGI 2) 및 트롬복산(TXA 2)을 포함한 일련의 대사 산물이 합성됩니다.50. 리놀레산은 CRV의 향상된 진통 효과와 밀접한 관련이 있습니다. 또한, 스테로이드 호르몬 생합성의 대사 경로는 스핑고지질 대사의 대사 경로에 의해 생성되는 프로게스테론 51,52,53과 스핑고신-1-포스페이트(C06124)를 생성하여 COX-2를 유도하고 PGE2를 통해 TNF54,55,56,57을 생성할 수 있습니다. 이들은 또한 PD와 관련이있을 수 있습니다.
프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 성분의 상대적 수준만 비교했고, 표준 샘플은 허브의 성분과 혈액에 흡수된 성분을 정량화하는 데 사용되지 않았습니다. 쥐의 대변과 소변은 동물 실험에서 수집되지 않아 생체 내에서 CR의 대사 산물이 더 적게 발견되었습니다. 검증 실험은 대사 노믹스 분석에 의해 발견 된 메커니즘을 추가로 확인해야합니다.
이 연구에 사용된 전략과 프로토콜은 시험관 내 화학 성분 연구와 생체 내 개별 성분의 일방적 연구에서 실명을 피했습니다. 따라서 메커니즘 탐색에 매우 적합했습니다. 이 전략은 많은 시간과 작업을 절약할 수 있으며 치료 효능에 대한 중요한 구성 요소와 메커니즘을 정확하게 식별할 수 있습니다.
이 연구에서는 혈액에 15 가지 성분과 2 가지 대사 산물이 있음이 밝혀졌습니다. 그 중에서도 (-)-myrtenol 및 [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acetic acid의 수치는 CRV군에 비해 CRV군에서 유의하게 증가하여 식초로 처리하면 혈중 활성 성분의 수치가 증가할 수 있음을 보여줍니다. CR을 식초로 처리한 후 PGF2α, 류코트리엔 B 4 및 프로스타글란딘J2를 포함하여 전염증, 혈소판 응집 및 혈관 수축 특성을 갖는4 시리즈 프로스타노이드 및 2 시리즈 류코트리엔의 수준이 감소했습니다. 이것은 CRV가 향상된 진통 효과를 나타내는 메커니즘일 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 충칭시 보건 및 가족 계획위원회 한의학 과학 기술 프로젝트 (프로젝트 번호 : ZY201802297), 충칭 자연 과학 재단 일반 프로젝트 (프로젝트 번호 : cstc2019jcyj-msxmX065), 충칭 현대 산악 지역 특성 고효율 농업 기술 시스템 혁신 팀 빌딩 계획 2022 [10] 및 충칭시 보건위원회 중국 재료의 핵심 분야 건설 프로젝트의 지원을 받았습니다. 메디카 프로세싱.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | 197164 | |
| BECKMAN COULTER Microfuge 20 | Beckman Coulter, Inc. | MRZ15K047 | |
| Estradiol benzoate | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | C10042616 | |
| formic acid | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | 177799 | |
| LC 30A system | Shimadzu, Kyoto, Japan | 228-45162-46 | |
| Olive oil | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd | H25A11P111909 | |
| Oxytocin synthetic | Zhejiang peptide biology Co., Ltd | 2019092001 | |
| Rat PGF2α ELISA kit | Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd | 202101 | |
| Rat PGFE2 ELISA kit | Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd | EDL202006217 | |
| SPF Sprague-Dawley rats | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd | Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004 | |
| Tecan Infinite 200 PRO | Tecan Austria GmbH, Austria | 1510002987 | |
| Triple TOF 4600 system | SCIEX, Framingham, MA, USA | BK20641402 | |
| water | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | 152720 |
References
- Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009 (2021).
- Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
- Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558 (2021).
- Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
- Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962 (2021).
- Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832 (2022).
- Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867 (2021).
- El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
- Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709 (2020).
- Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
- Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
- Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
- Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238 (2017).
- Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
- Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773 (2020).
- Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
- Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
- Zhao, L., Hartung, T.
- Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
- Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
- Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
- Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
- Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763 (2021).
- Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642 (2021).
- Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
- Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233 (2021).
- Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
- Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768 (2020).
- Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
- Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181 (2020).
- Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119 (2021).
- Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448 (2020).
- Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
- Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
- Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
- Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
- Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966 (2019).
- Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
- Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
- Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
- Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F.
- Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
- Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N.
- Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
- Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191 (2020).
- Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683 (2019).
- Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628 (2020).
- Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
- Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
- Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
- Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555 (2018).
- Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
- Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
- Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
