Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Análise de Amostras de Cyperi Rhizoma Cru e Processadas Usando Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massas em Tandem em Ratos com Dismenorreia Primária

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

Summary

Aqui, uma análise comparativa de amostras de Cyperi rhizoma (CR) cruas e processadas é apresentada usando cromatografia líquida de ultra-alta eficiência e espectrometria de massas em tandem de alta resolução (UPLC-MS/MS) em ratos com dismenorreia primária. As alterações nos níveis sanguíneos dos metabólitos e dos constituintes da amostra foram examinadas entre ratos tratados com CR e CR processados com vinagre (CRV).

Abstract

Cyperi rhizoma (CR) é amplamente utilizado em ginecologia e é um medicamento geral para o tratamento de doenças das mulheres na China. Uma vez que o efeito analgésico da RC é aumentado após o processamento com vinagre, a RC processada com vinagre (CRV) é geralmente usada clinicamente. No entanto, o mecanismo pelo qual o efeito analgésico é aumentado pelo processamento do vinagre não está claro. Neste estudo, a técnica de cromatografia líquida de ultra-alta pressão acoplada à espectrometria de massas (UPLC-MS/MS) foi usada para examinar as alterações nos níveis sanguíneos dos constituintes exógenos e metabólitos entre ratos com dismenorreia tratados com RC e tratados com CRV. Os resultados revelaram diferentes níveis de 15 constituintes e dois metabólitos no sangue desses ratos. Entre eles, os níveis de (-)-mirtenol e ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético no grupo CRV foram consideravelmente maiores do que no grupo CR. O CRV reduziu o nível de prostanoides de 2 séries e leucotrienos de 4 séries com atividades pró-inflamatórias, de agregação plaquetária e vasoconstritoras e proporcionou efeitos analgésicos pela modulação do metabolismo do ácido araquidônico e do ácido linoleico e da biossíntese de ácidos graxos insaturados. Este estudo revelou que o processamento do vinagre aumenta o efeito analgésico da RC e contribui para o entendimento do mecanismo de ação do CRV.

Introduction

A dismenorreia primária (DP) é a condição mais prevalente na clínica ginecológica. Caracteriza-se por dor nas costas, inchaço, dor abdominal ou desconforto antes ou durante a menstruação, sem patologia pélvica no sistema reprodutivo1. Um relatório sobre sua prevalência mostrou que 85,7% dos estudantes sofrem de DP2. Os anticoncepcionais orais em baixas doses são a terapia padrão, mas seus efeitos adversos, como a trombose venosa profunda, têm chamado cada vez mais atenção3. A prevalência de trombose venosa profunda entre usuárias de anticoncepcional oral é de >1 por 1.000 mulheres, e o risco é maior nos primeiros 6-12 meses e em usuárias com mais de 40 anos4.

Muito utilizado na medicina tradicional chinesa (MTC), Cyperi rhizoma (CR) é derivado do rizoma seco de Cyperus rotundus L. da família Cyperaceae. A RC regula os distúrbios menstruais e alivia a depressão e a dor5. A RC é amplamente utilizada em ginecologia e é considerada um medicamento geral para o tratamento de doenças da mulher6. CR processado com vinagre (CRV) é normalmente usado clinicamente. Em comparação com a RC, a VRC mostra maior regulação da menstruação e alívio da dor. Estudos modernos têm demonstrado que a RC inibe a ciclooxigenase-2 (COX-2) e a subsequente síntese de prostaglandinas (PGs), alcançando assim um efeito anti-inflamatório. Enquanto isso, a RC apresenta efeito analgésico sem efeitos colaterais7, tornando a RC uma boa opção para pacientes com dismenorreia. No entanto, o mecanismo subjacente à regulação da menstruação e ao alívio da dor pelo CRV não está claro. A pesquisa em RC tem se concentrado principalmente em alterações em seus componentes químicos ativos e atividades farmacológicas, como seus efeitos anti-inflamatórios, antidepressivos e analgésicos 8,9,10,11,12.

Embora os ingredientes da MTC sejam complexos, eles são absorvidos pelo sangue e devem atingir uma concentração sanguínea específica para serem eficazes13. O escopo da triagem dos ingredientes ativos da MTC pode ser reduzido utilizando a estratégia de determinação de constituintes no sangue. A cegueira pode ser evitada no estudo dos componentes químicos in vitro, e a unilateralidade pode ser evitada no estudo dos constituintes individuais14. Ao comparar as composições de CR e CRV no sangue, alterações nos ingredientes ativos do CR processado podem ser detectadas de forma eficaz e rápida. A eficácia da droga é o processo pelo qual uma droga influencia o corpo. Alterações nos componentes da droga devido à resposta metabólica do organismo, que podem estar relacionadas ao mecanismo de ação da droga, podem ser determinadas com metabolômicos. Metabonomics visa medir as respostas metabólicas globais e dinâmicas, o que é consistente com a determinação da eficácia global da medicina tradicional chinesa15. Além disso, os metabólitos são o produto final da expressão gênica, que está mais intimamente relacionada aos fenótipos16. Assim, metabolômicas podem ser adequadas para explorar as diferenças nas vias metabólicas entre RC e CRV no tratamento da DP. A metabolômica não direcionada baseada em cromatografia líquida baseada em espectrometria de massas em tandem de alta resolução (LC-MS/MS) é caracterizada por alto rendimento, alta sensibilidade e alta resolução e pode ser usada para medir muitos componentes moleculares pequenos17,18 . Este método pode determinar simultaneamente os metabolitos endógenos e constituintes exógenos absorvidos no sangue. A metabinômica tem sido amplamente utilizada em estudos sobre MTC19, toxicologia de drogas 20, gestão em saúde 21, esportes22, alimentos 23 e outros campos.

Neste estudo, as diferenças nos constituintes exógenos absorvidos no sangue e nos metabólitos endógenos foram medidas entre ratos modelo de dismenorreia tratados com RC e tratados com CRV usando metabolômica não direcionada baseada em LC-MS/MS para revelar os mecanismos dos efeitos analgésicos do CRV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os experimentos relacionados a animais foram conduzidos com aprovação do Comitê de Ética em Experimentos do Instituto Chongqing da MTC. Vinte e quatro ratas Sprague Dawley (SD) com 8-10 semanas de idade e pesando 200 g ± 20 g foram utilizadas neste experimento.

1. Preparação da extração

  1. Cálculo
    1. Planeie administrar o extracto de CR ou CRV a um grupo de tratamento de seis ratos Sprague-Dawley (10 g/[kg∙dia]) durante 3 dias. Use uma concentração de extrato CR ou CRV de 1 g/mL (1 mL do extrato é obtido a partir de 1 g de ervas).
      NOTA: A dosagem de CR é de 6-10 g. Neste estudo, a dose máxima de 10 g foi utilizada como dosagem. Como o peso médio de uma pessoa adulta é de 60 kg, a dose de adulto é de 0,1667 g/kg. De acordo com o algoritmo de conversão de peso24, como o coeficiente de conversão de dose entre humanos e ratos é de 6,3, a dosagem para ratos é de 1,05 g/kg. A dose da droga foi aumentada em 10 vezes para 10,5 g/kg para ratos. A dosagem foi fixada em 10 g/kg para a conveniência do cálculo e do experimento propriamente dito. Por exemplo, pelo cálculo, se for necessário um total de 36 g de CR ou CRV, o fitoterápico chinês deve ser preparado pelo menos duas vezes. Assim, foram necessários 200 g de RC - 100 g de RC foram usados como RC, e 100 g de RC foram processados em CRV.
    2. Calcular o volume de CR ou CRV a aplicar por rato utilizando a equação (1):
      V = 10 g/(kg∙dia) × 200 g/(1 g/mL) = 2 mL (1)
  2. Processamento do CRV
    1. Misturar 100 g de CR e 20 g de vinagre (>5,5 g de ácido acético/100 mL) e incubar por 12 h.
      NOTA: Para garantir que o interior do CR fosse umedecido por vinagre após 12 h, o CR e o vinagre foram misturados, bem agitados e, em seguida, agitados novamente até que a porção interna estivesse úmida.
    2. Frite a mistura em uma panela de ferro por 10 min a 110-120 °C. Em seguida, retire a mistura e deixe esfriar em temperatura ambiente.
      NOTA: Para evitar que o CR arda, é necessário mexer continuamente durante o aquecimento. Se o CRV processado estiver muito úmido, ele pode ser seco a 60 °C. Quando a superfície do CR é sépia, a fritura pode ser interrompida.
  3. Extração
    1. Extrato de CR
      1. Adicione 10 vezes (a quantidade de CR) água pura ao CR e deixe de molho por 2 h. Certifique-se de que os materiais medicinais estão abaixo do nível de líquido durante a imersão.
        NOTA: O CR só precisa ser cortado ao meio antes da extração. O objetivo da imersão é extrair os constituintes ativos de forma mais eficaz. O processo de imersão é essencial.
      2. Leve a mistura de água e remédio para ferver em fogo alto e mantenha fervendo em fogo baixo por 20 min. Filtrar com um pano filtrante (100 mesh) e recolher o filtrado.
        NOTA: Durante a decocção, um calor alto foi usado antes da fervura, e um fogo baixo foi usado para manter a ebulição.
      3. Repita o passo 1.3.1.2 uma vez e combine os filtrados.
      4. Concentrar o extracto com um evaporador rotativo a 1 g/ml (com base no medicamento original, a temperatura de concentração deve ser inferior a 60 °C).
        NOTA: Os componentes activos em CR são voláteis, pelo que a temperatura de concentração não deve ser superior a 60 °C.
    2. Extrato de CRV
      1. Execute as mesmas etapas (1.3.1.1-1.3.1.3) que para o método de extração CR.
    3. Extrato CR para teste
      1. Pipetar 500 μL do extrato CR e 500 μL de metanol para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e vórtice por 30 s para misturar.
        NOTA: Uma mistura de metanol e água extrai melhor os componentes ativos. O extrato não deve ser diretamente filtrado para teste.
      2. Centrifugar cada amostra durante 15 min a 1,6502 × g a 4 °C. Filtre o sobrenadante e, em seguida, transfira-o para o frasco para injetáveis de amostra para teste.
        NOTA: Após a centrifugação a alta velocidade da mistura de metanol e extracto, o sobrenadante pode ser transferido directamente para o frasco da amostra para determinação sem filtração. Devido ao calor gerado pelo processo de centrifugação, é preferível usar uma centrífuga criogênica.
    4. Extrato de CRV para teste
      1. Execute as etapas 1.3.3.1-1.3.3.2 para preparar o extrato de CRV para teste.

2. Animais

  1. Cálculo
    1. Tome 50 mg de benzoato de estradiol e adicione-o a 50 mL de azeite para preparar uma solução de 1 mg/mL. Tome 50 mg de ocitocina e adicione-a a 50 mL de soro fisiológico normal para preparar uma solução de 1 mg/mL.
      NOTA: A dose da injeção intraperitoneal de benzoato de estradiol e ocitocina é de 10 mg/(kg∙dia). O benzoato de estradiol é dissolvido no azeite de oliva, e a ocitocina é dissolvida em soro fisiológico. O benzoato de estradiol não é fácil de dissolver no azeite e pode ser tratado com ultrassom para acelerar a dissolução. Tanto o benzoato de estradiol quanto as soluções de ocitocina devem ser preparados diariamente.
    2. Calcular o volume de solução de benzoato de estradiol a aplicar por rato (ou seja, V = 10 mg/[kg∙dia] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml). Calcular o volume de solução de ocitocina a aplicar por rato (ou seja, V = 10 mg/[kg∙dia] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml).
  2. Agrupamento e administração de animais
    OBS: Foram atribuídos dez dias para administração25,26. Durante o tratamento, os ratos tiveram acesso irrestrito à ração padrão e à água. Dentro de 30 minutos após a administração de ocitocina, a atividade de contorção de cada rato foi rastreada. O modelo de PD foi desenvolvido com sucesso, como evidenciado pelas respostas de torção das ratas modelo, que incluíram contração uterina, rotação de um membro, extensão de membro posterior, tronco oco e contração abdominal26.
    1. Atribuir 24 ratos Sprague-Dawley fêmeas (ratos SD, 8-10 semanas de idade, pesando 200 g ± 20 g) em quatro grupos ao acaso - controle, modelo, CR e CRV - e alimentá-los por 7 dias.
    2. Administração de animais
      1. Injetar intraperitonealmente ratos nos grupos modelo, CR e CRV com 2 mL de solução de benzoato de estradiol todos os dias. Injetar intraperitonealmente nos ratos do grupo controle 2 mL de solução salina normal.
      2. A partir do dia 8, conclua a etapa 2.2.2.1. Em seguida, administrar por via intragástrica 2 mL de extrato de CRV aos ratos do grupo CRV, 2 mL de extrato de CR aos ratos do grupo RC e 2 mL de solução salina normal aos ratos dos grupos controle e modelo.
      3. No dia 10, conclua a etapa 2.2.2.2. Em seguida, injetar intraperitonealmente os ratos dos grupos modelo, RC e CRV com 2 mL de solução de ocitocina e os ratos do grupo controle com 2 mL de solução salina normal.
    3. Registrar os tempos de contorção dos ratos dentro de 30 min após a injeção de ocitocina.
  3. Coleta de amostras
    1. Coletar amostras de sangue da aorta abdominal, excisar o útero rápida e completamente, e separar cuidadosamente o tecido conjuntivo e a gordura aderida à parede uterina.
      NOTA: O sangue foi coletado dentro de dentro de 1 h após a dose final.
    2. Use tubos de microcentrífuga para preservar e transferir o tecido uterino para nitrogênio líquido. Conservar as amostras de tecido a -80 °C.
    3. Centrifugar as amostras de sangue durante 10 min a 4.125 × g. Retirar o sobrenadante que contém soro e centrifugar a 16.502 × g durante 10 minutos a 4 °C. Centrifugar o soro e, em seguida, mantê-lo no tubo a -80 °C para armazenamento.
      NOTA: As amostras de sangue devem ser deixadas à temperatura ambiente por 1 h para reprocessamento.
  4. Processamento de amostras
    1. Amostras de soro
      1. Coloque 400 μL de metanol e 200 μL de soro em um tubo de microcentrífuga e vórtice por 30 s para misturar. Centrifugar cada amostra durante 15 min a 16,502 × g a 4 °C. Encher frascos de amostra com o sobrenadante após a coleta e filtração. Misturar todos os sobrenadantes de cada amostra com o mesmo volume para preparar amostras de controle de qualidade para teste.
    2. Amostras de tecido uterino
      1. Tomar 100 mg de tecido uterino do segmento ipsilateral e triturá-lo com um volume nove vezes maior de soro fisiológico. Centrifugar o homogeneizado durante 10 min a 4.125 × g e recolher o sobrenadante. Colocar o sobrenadante num frigorífico a 4 °C para ensaio ou a -80 °C se não for ensaiado no mesmo dia.
      2. Coloque soro fisiológico, tecido e esferas de aço em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, coloque o tubo de microcentrífuga em nitrogênio líquido por 3-5 s e, em seguida, coloque o tecido em um moedor de tecido para moagem.
  5. Teste de amostra
    1. Use um ensaio imunoenzimático (ELISA) para medir o conteúdo de PGF2α e PGE2 nos tecidos uterinos das amostras de ratos.
      OBS: O kit ELISA PGE 2 para ratos foi utilizado para medir o conteúdo de PGE 2 e o kit ELISA PGF 2α para ratos foi utilizado para medir o nível de PGF2α. As etapas detalhadas podem ser encontradas nas instruções do fabricante. Os detalhes do kit são dados na Tabela de Materiais.
    2. Avaliar a amostra de soro, o extrato de CR e o extrato de CRV usando UPLC-MS/MS.
      1. Para UPLC, use uma coluna C18 (2,6 μm, 2,1 mm x 100 mm) e um método de gradiente binário com fase móvel A contendo 0,1% de ácido fórmico e fase móvel B contendo acetonitrila. Defina o gradiente de eluição da seguinte forma: de 0 min a 1 min, 15% B; de 1 min a 8,5 min, 15% a 85% B; de 8,5 min a 11,5 min, 85% B; de 11,5 min a 11,6 min, 99% a 1% B; e de 11,6 min a 15 min, 15% B. Ajuste o fluxo para 0,35 mL/min e o volume de injeção para 2 μL.
      2. Para MS, ajuste a temperatura para 600 °C, a taxa de fluxo de gás de cortina (CUR) para 0,17 MPa, e as taxas de fluxo de bainha e gás auxiliar para 0,38 MPa. Ajuste a tensão de pulverização de íons do modo de íons positivos e do modo de íons negativos para 5,5 kV e −4,5 kV, respectivamente, a tensão de potencial de desagrupamento (DP) para 80 V ou −80 V, a energia de colisão (CE) para 40 eV ou −25 eV e a superposição de energia de colisão (CES) para 35 eV ± 15 eV.
      3. Execute o teste seguindo o protocolo do fabricante usando UPLC-MS/MS. Execute MS para uma faixa de massa de 50-1.000 m/z.
      4. Obtenha os resultados do UPLC-MS/MS usando o programa de estação de trabalho correspondente em conjunto com a aquisição dependente de informações do modo de detecção, o filtro de defeitos de massa múltipla e a dedução dinâmica de plano de fundo. Use as amostras de controle de qualidade do soro agrupado para testar a repetibilidade e estabilidade do equipamento UPLC-MS/MS para verificar a abordagem convencional. Antes das amostras de pesquisa, injetar as amostras de controle de qualidade por quatro tiragens sucessivas e, em seguida, injetá-las após cada cinco amostras de soro.

3. Processamento de dados

  1. Preparação dos dados
    1. Use o software de conversão para converter os dados brutos para o formato mzXML. Normalize os dados de corrente iônica total (TIC) de cada amostra.
      NOTA: Uma aplicação interna baseada em R (www.lims2.com) construída em XCMS foi usada para analisar as informações para a integração, alinhamento, extração e detecção de pico27.
    2. Execute a anotação de metabólitos usando um banco de dados MS2 proprietário (www.lims2.com). Defina o limite de anotação para 0,328.
      OBS: Os metabólitos endógenos foram identificados em cada grupo.
  2. Análise de componentes principais e análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais
    1. Utilize softwares de análise para realizar a análise de componentes principais (ACP) e a modelagem. Importar os dados padronizados dos metabólitos para o software de análise. Em seguida, use o ajuste automático para criar o modelo de análise. Por fim, utilizar o escore para obter o gráfico de dispersão do escore da ACP.
      OBS: O agrupamento de cada grupo foi obtido com o gráfico de dispersão dos escores da ACP. A ACP é uma modalidade de análise não supervisionada que agrupa principalmente as amostras por meio de redução de dimensões sem intervenção.
    2. Utilizar o software de análise para realizar a análise discriminante ortogonal de mínimos quadrados parciais (OPLS-DA).
      1. Importar os dados padronizados dos metabólitos nos grupos CR e CRV para o software de análise.
      2. Importe os dados do grupo CR para o grupo CR criado e importe os dados do grupo CRV para o grupo CRV criado.
        NOTA: OPLS-DA é um modo de análise supervisionado, sendo necessário o agrupamento das amostras.
      3. Em seguida, use o ajuste automático para construir o modelo de análise e use a pontuação para obter o gráfico de dispersão de pontuação do OPLS-DA. Por fim, utilizar o VIP para obter a variável significância no valor da projeção (VIP) no OPLS-DA.
        OBS: A significância das variáveis nos valores de projeção (VIP) dos metabólitos nos grupos RC e CRV foi obtida através do OPLS-DA.
  3. Identificação dos potenciais metabólitos diferenciais
    1. Seleccione os metabolitos com valores VIP superiores a 1 no passo 3.2.2.3.
    2. Utilizar software estatístico para calcular o valor de P dos metabólitos que foram selecionados na etapa 3.3.1 pelo teste t de Student.
      NOTA: Diferenças significativas nos potenciais metabólitos diferenciais nos grupos RC e CRV foram determinadas pelo teste t de Student. Os potenciais metabólitos diferenciais foram aqueles com valor de p do teste t de Student < 0,05 e significância da variável na projeção (VIP) maior que 1. A representação foi realizada usando uma parcela vulcânica.
  4. Identificação dos metabólitos diferenciais
    1. Seleccione os potenciais metabolitos diferenciais no passo 3.3. Utilize os resultados do passo 3.1.2 para identificar estes metabolitos diferenciais.
      NOTA: Um pequeno número de potenciais metabólitos diferenciais foram identificados, e eles se tornaram os metabólitos diferenciais candidatos.
    2. Filtre os metabólitos diferenciais a serem correspondidos no banco de dados KEGG. Mostrar as mudanças nos metabólitos diferenciais nos grupos CR e CRV desenhando um mapa de calor.
      NOTA: Um pequeno número de metabólitos diferenciais candidatos foram combinados, e eles se tornaram os metabólitos diferenciais.
  5. Exame das vias metabólicas potenciais
    1. Carregue os diferentes metabólitos no banco de dados Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. Use a Análise de Vias para obter as vias metabólicas potenciais.
      LEGENDA: As potenciais vias metabólicas foram obtidas nos grupos RC e CRV. O valor de P e o valor de impacto foram dois indicadores muito importantes na seleção das vias críticas. O valor de P foi mais importante do que o valor de impacto. A significância foi definida pelo valor de P < 0,05; Maiores valores de impacto foram associados a melhores correlações.
    3. Analise as vias metabólicas potenciais carregando os diferentes metabólitos para o banco de dados KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      NOTA: A relação entre a função da via metabólica e a DP também deve ser considerada. As vias metabólicas críticas foram obtidas.
  6. Identificação dos constituintes absorvidos no sangue
    1. Identifique os constituintes químicos nos extratos de CR e CRV usando o banco de dados interno MS2 (www.lims2.com), o banco de dados de metaboloma humano (HMDB) e os bancos de dados Massbank e Chemspider.
    2. Determinar os constituintes absorvidos no sangue nos grupos CR e CRV e comparar os constituintes entre os grupos CR e CRV.
      NOTA: Os constituintes absorvidos no sangue devem ser detectados nos grupos CR ou CRV, mas não podem ser detectados no grupo controle.
  7. Análise estatística
    1. Analisar os dados por meio de análise univariada (UVA) e métodos estatísticos multivariados, incluindo a análise de variância (ANOVA) e o teste t de Student.
      OBS: As informações experimentais foram apresentadas por meio de software estatístico como média ± desvio padrão (±DP). P < 0,01 foi considerado uma diferença altamente significativa, e P < 0,05 representou uma diferença significativa28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Análise do experimento do modelo de dismenorreia
Não houve resposta de contorção dentro de 30 minutos no grupo controle porque esses ratos não foram injetados intraperitonealmente com ocitocina e benzoato de estradiol para causar dor. Os ratos dos grupos modelo, RC e CRV apresentaram reações de contorção substanciais após a injeção de ocitocina. Esses resultados demonstram a eficácia da combinação de benzoato de estradiol e ocitocina na indução de dismenorreia. As diferenças nos níveis de PGF 2α, PGE 2 e PGF2α/PGE 2 entre os grupos modelo e controle foram significativas (P < 0,001, P < 0,05), demonstrando a eficácia do modelo (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Conteúdo de PGF 2 α e PGE2 no tecido uterino e número de contorções em cada grupo. (A) O conteúdo de PGF2α no tecido uterino em cada grupo. (B) O conteúdo de PGE2 no tecido uterino em cada grupo. (C) O conteúdo de PGF 2 α/PGE2 no tecido uterino em cada grupo. (D) O número de contorções em cada grupo. As colunas representam a média ± MEV de quatro grupos (seis camundongos por grupo). * P < 0,05 ou ** P < 0,01 representam uma diferença significativa em relação ao grupo modelo, e Δ P < 0,05 ou ΔΔ P < 0,01 representam uma diferença significativa em relação ao grupo RC. Os ratos dos grupos modelo, RC e CRV apresentaram uma reação de contorção substancial após a injeção de ocitocina. Abreviações: PG = prostaglandina; CR = rizoma de Cyperi; CRV = CR processado com vinagre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As concentrações de PGF 2α e PGF2α/PGE2 foram reduzidas nos grupos CRV e RC, e essa redução foi mais acentuada no grupo CRV. Também houve diferenças significativas (P < 0,001 e P < 0,05) nas concentrações de PGF 2α e PGF2α/PGE2 entre os grupos CRV e RC. Em comparação com o grupo modelo, a concentração de PGE2 foi significativamente maior nos grupos CRV e RC (P < 0,001), com o nível aumentando mais no grupo CRV.

Controle de qualidade
Uma boa correspondência foi observada entre os tempos de retenção dos picos cromatográficos do BPC e as intensidades de sinal nas amostras de controle de qualidade, demonstrando um alto nível de estabilidade do instrumento e uma qualidade de dados notavelmente consistente (Arquivo Suplementar 1 - Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2). Além disso, todas as amostras de controle de qualidade estavam dentro de ±2 desvios-padrão (Figura 2A,B), e a correlação entre as amostras de controle de qualidade foi maior que 0,7 (Figura 2C,D). Esses resultados sugerem que o procedimento foi confiável e que os resultados foram confiáveis.

Figure 2
Figura 2: Distribuição unidimensional PCA-X das amostras de controle de qualidade. (A) modo positivo, (B) modo negativo; análise de correlação das amostras de controle de qualidade nos modos (C) positivo e (D) negativo. Todas as amostras de controle de qualidade estavam dentro de ±2 desvios-padrão, e as correlações entre as amostras de controle de qualidade foram superiores a 0,7. Esses resultados sugeriram que o procedimento foi confiável e as informações foram confiáveis. Abreviações: PC = componente principal; ACP = análise de componentes principais; controle de qualidade; CR = rizoma de Cyperi; CRV = CR processado com vinagre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise de componentes principais
Como mostrado na Figura 3, o CP abscissa (1) indicou os escores dos primeiros componentes principais, enquanto o CP ordenado (2) indicou os escores dos segundos componentes principais. Na figura, o círculo verde indica o grupo controle, o círculo vermelho representa o grupo modelo, o círculo azul indica o grupo CR, o círculo branco indica o grupo CRV e o círculo rosa indica o grupo controle de qualidade.

Figure 3
Figura 3: Gráfico de dispersão do escore da ACP . (A) Modo positivo e (B) modo negativo. As amostras de controle de qualidade se sobrepõem, o que indica que o instrumento foi muito estável. Cada grupo está distribuído em sua própria área, com apenas o grupo RC e o grupo CRV ocasionalmente cruzando caminhos. Abreviações: PC = componente principal; ACP = análise de componentes principais; CQ = controle de qualidade; CR = rizoma de Cyperi; CRV = CR processado com vinagre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os resultados da análise de PCA demonstraram que os agrupamentos dos grupos RC e modelo foram significativamente separados nos modos íons positivo e negativo. Os agrupamentos foram significativamente separados entre os grupos CRV e modelo nos modos íons positivo e negativo. Os grupos controle de qualidade, modelo e controle foram separados dos demais grupos de tratamento (RC, CRV). Os grupos RC e CRV ocasionalmente se sobrepuseram no modo íon positivo. No modo íon negativo, cada grupo foi separado significativamente.

Análise discriminante do método dos mínimos quadrados parciais ortogonais
OPLS-DA foi usado para rastrear diferenças metabólicas. O gráfico de dispersão OPLS-DA mostrou que todas as amostras estavam dentro do intervalo de confiança de 95% (elipse do quadrado T de Hotelling). A Figura 4A,C demonstra que os grupos RC e CRV foram separados. O sobreajuste do modelo foi testado pelo teste de permutação (n = 200) e a significância estatística do modelo foi avaliada. Na Figura 4B,D, a ordenada representa o valor de R 2 Y ou ovalor de Q2, e a abscissa indica a retenção de substituição. R 2Y é representado pelo ponto verde, Q2 é representado pelo ponto quadrado azul e as duas linhas tracejadas representam suas linhas de regressão correspondentes. Nas modalidades positiva e negativa, os valores de R 2Y foram 0,8 e 0,84, e os valores de Q2 foram −0,59 e −0,57, respectivamente. Isso demonstra a alta confiabilidade do modelo e a ausência de overfitting.

Figure 4
Figura 4: Modelos OPLS-DA para o grupo RC versus CRV. Gráfico de dispersão de pontuação no modo (A) positivo e (C) negativo. Teste de permutação do modelo OPLS-DA para o grupo RC versus o grupo CRV nos modos (B) positivo e (D) negativo. R 2Y foi 0,8 e 0,84, e Q2 foi −0,59 e −0,57 nas modalidades positiva e negativa, respectivamente. Isso demonstra a alta confiabilidade do modelo e a ausência de comportamento de sobreajuste. Abreviações: OPLS-DA = análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais; CR = rizoma de Cyperi; CRV = CR processado com vinagre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise estatística univariada
Análises estatísticas univariadas foram realizadas para identificar variações metabólicas. Sob a triagem padrão de VIP > 1 e P < 0,05, 339 e 394 potenciais metabólitos diferenciais foram detectados nos modos iônico positivo e negativo, respectivamente. Um gráfico de vulcão é mostrado na Figura 5, em que cada ponto corresponde a um metabólito diferente. A ordenada mostra o valor de P do teste t de Student, e a abscissa reflete múltiplas mudanças no nível de cada molécula do grupo. O tamanho da dispersão representa o valor VIP do modelo OPLS-DA; o valor VIP aumenta com o tamanho da dispersão. Os pontos vermelhos indicam um aumento, os pontos azuis indicam uma diminuição e o cinza indica nenhuma diferença significativa.

Uma análise qualitativa dos metabólitos diferenciais candidatos foi realizada usando espectrometria de massa secundária. Foram observadas alterações significativas em 63 metabólitos no modo positivo (Arquivo Suplementar 1-Tabela Suplementar 1) e em 30 metabólitos no modo negativo (Arquivo Suplementar 1-Tabela Suplementar 2). Os metabólitos diferenciais foram determinados usando as bases de dados KEGG e HDMB. Os compostos combinados com precisão foram identificados como metabólitos diferenciais, e estes estão listados na Tabela 3 e na Tabela 4.

Figure 5
Figura 5: Gráfico vulcânico para o grupo RC versus o grupo CRV . (A) Modo positivo e (B) modo negativo. No gráfico do vulcão representado, cada ponto corresponde a um metabólito diferente. A ordenada mostra o valor de P do teste t de Student, e a abscissa reflete as múltiplas mudanças em cada substância do grupo. O tamanho da dispersão representa o valor VIP do modelo OPLS-DA. O valor VIP aumenta com o tamanho da dispersão. Pontos vermelhos indicam aumentos, pontos azuis indicam diminuições e cinza indica que não há diferenças significativas. Abreviações: OPLS-DA = análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais; VIP = significância da variável na projeção; CR = rizoma de Cyperi; CRV = CR processado com vinagre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Comparações de metabólitos
A matriz de distância euclidiana dos valores quantitativos dos metabólitos diferenciais entre os grupos RC e CRV foi calculada, e os metabólitos diferenciais foram agrupados usando uma abordagem de correlação abrangente.

A abscissa representa diferentes grupos experimentais, enquanto a ordenada representa o nível relativo na Figura 6. A colocação das manchas coloridas indica como cada metabólito é expresso em relação aos outros. No modo íon positivo, em comparação com o grupo RC, os níveis de quatro metabólitos diferenciais no grupo CRV aumentaram, enquanto os níveis de 11 metabólitos diferenciais diminuíram. No modo íon negativo, em comparação com o grupo CR, os níveis de quatro metabólitos diferenciais no grupo CRV aumentaram, e os níveis de 7 metabólitos diferenciais diminuíram.

Figure 6
Figura 6: Análise do mapa de calor para o grupo CRV versus o grupo RC . (A) Modo positivo e (B) modo negativo. A abscissa representa os diferentes grupos experimentais e a ordenada representa os níveis relativos de expressão. A colocação das manchas coloridas indica como cada metabólito é expresso em relação aos outros. Abreviações: CR = Cyperi rizoma; CRV = CR processado com vinagre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em comparação com o grupo CR, os metabólitos que aumentaram no grupo CRV foram esfingosina 1-fosfato, nobiletina, glicerofosfocolina, lisopc(18:1(9z)), ácido 2-hidroxi-6-pentadecilbenzóico, ácido 9,10-epoxioctadecenóico, ácido 13s-hidroxioctadecadienóico e 2-metoxiestrona, enquanto os que diminuíram foram corticosterona, ácido indolacético, ácido glicólico, berberina, ftalato de dibutila, retinol, leucotrieno B4, prostaglandina J2, 21-hidroxipregnenolona, zeranol, homocisteína, ácido propinóico, ácido esteárico, ácido docosahexaenóico, fenilacetilglicina, L-fenilalanina, glucuronida de estrona e ácido cítrico (Figura 7).

Figure 7
Figura 7: Tendências do nível relativo dos potenciais metabolitos nos grupos CRV e CR. (A) Modo positivo e (B) modo negativo. No modo positivo, em comparação com o grupo RC, os níveis de quatro metabólitos diferenciais aumentaram no grupo CRV, e os níveis de 11 diminuíram. No modo negativo, os níveis de quatro metabólitos diferenciais aumentaram no grupo CRV, e os níveis de sete metabólitos diferenciais diminuíram. As colunas representam a média ± MEV de quatro grupos (seis camundongos por grupo). * P < 0,05, ** P < 0,01 ou *** P < 0,01 representam uma diferença significativa entre os grupos VCR e RC. Abreviações: CR = Cyperi rizoma; CRV = CR processado com vinagre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise da via KEGG
Os metabólitos diferenciais foram anotados e as vias de KEGG analisadas. Os resultados mostraram que os metabólitos diferenciais foram associados a nove vias nos modos positivo e negativo, respectivamente (Tabela 1 e Tabela 2). Na Figura 8, as vias metabólicas são representadas cada uma por uma bolha no gráfico de bolhas, com uma escala mais significativa indicando um fator de efeito maior. O tamanho do caminho que influencia os fatores na análise topológica é representado pela abscissa do gráfico de bolhas e pelo tamanho da bolha. A ordenada do gráfico de bolhas e a cor da bolha indica o valor de P da análise de enriquecimento (tomando o logaritmo natural negativo, ou seja, −ln (p)). O grau de enriquecimento é mais significativo, o valor de P é menor, o valor de ordenada é mais proeminente e a cor é mais escura. O valor de P e o valor de impacto são dois indicadores muito importantes na seleção de vias críticas. Geralmente, o valor de P é mais importante do que o valor de impacto.

Figure 8
Figura 8: Análise do trajeto do grupo CRV versus RC . (A) Modo positivo e (B) modo negativo. As vias metabólicas são representadas por uma bolha no gráfico de bolhas. A abscissa do gráfico de bolhas e o tamanho da bolha indicam o tamanho dos fatores que influenciam o caminho na análise topológica. A ordenada do gráfico de bolhas e a cor da bolha indicam o valor de P da análise de enriquecimento. As principais vias metabólicas incluem a biossíntese de ácidos graxos insaturados e o metabolismo do ácido linoleico. Abreviações: CR = Cyperi rizoma; CRV = CR processado com vinagre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Tabela 3 e a Tabela 4 mostram as vias metabólicas com diferenças significativas - metabolismo da fenilalanina e metabolismo do ácido linoleico, bem como a biossíntese de ácidos graxos insaturados, fenilalanina, tirosina e triptofano. Embora as vias metabólicas incluíssem biossíntese de hormônios esteroides, metabolismo de esfingolipídios e ácido araquidônico, não houve diferenças significativas, que foram relacionadas à dismenorreia. Os resultados mostraram que o metabolismo do ácido linoleico e a biossíntese de ácidos graxos insaturados foram as vias metabólicas críticas associadas à maior eficácia do CRV.

Constituintes absorvidos no sangue
Quinze constituintes e dois produtos do metabolismo dos extratos de CRV e CR foram detectados no soro de ratos nos grupos CR e CRV (Tabela 5). Todos os 17 componentes foram encontrados no modo íon positivo.

Os níveis relativos de constituintes nas amostras de sangue dos dois grupos foram comparados pelo teste t de Student. A abscissa da Figura 9 apresenta vários grupos experimentais; A ordenada representa o valor de resposta do espectro de massa. Houve dois componentes com diferenças significativas. A análise mostrou que os níveis desses dois componentes estavam elevados no grupo VCR em relação ao grupo RC, enquanto os níveis de 15 elementos não apresentaram alterações significativas.

Figure 9
Figura 9: Constituintes absorvidos no sangue para o grupo CRV versus o grupo RC. Havia 15 constituintes e dois produtos do metabolismo dos extratos de CRV e CR no soro de ratos nos grupos CR e CRV. A análise mostrou que os níveis sanguíneos de dois componentes estavam aumentados no grupo CRV em comparação com o grupo RC, enquanto os níveis sanguíneos de 15 componentes não apresentaram alterações significativas. Entre eles, o nível de (-)-mirtenol e ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético no grupo CRV foi consideravelmente maior do que no grupo CR. * P < 0,05 ou ** P < 0,01 representam uma diferença significativa entre o grupo CRV e o grupo RC. Abreviações: CR = Cyperi rizoma; CRV = CR processado com vinagre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Diferenças metabólicas no modo positivo. Abreviações: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = significância da variável na projeção; TR = tempo de retenção. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Diferenças metabólicas no modo negativo. Abreviações: KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; VIP = significância da variável na projeção; TR = tempo de retenção. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Análise das vias metabólicas no modo positivo. Abreviação: KEGG = Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4 Análise das vias metabólicas no modo negativo. Abreviação: KEGG = Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 5: Identificação dos ingredientes protótipos e metabólitos no soro de ratos. Nota: M1 e M2 são metabolitos; outros constituintes são ingredientes protótipos. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: Diagramas BPC e cromatograma MS2 dos constituintes absorvidos no sangue de camundongos nus. Diagramas BPC de todas as amostras de controle de qualidade nos modos positivo e negativo; Cromatograma MS 2 dos 17 constituintes absorvidos no sangue dos ratos: ácido D-canfeno, (-)-mirtenol, etilparabeno, calameneno, α-ciperona, (+)-nootkatona, (1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]ácido acético, ácido 4-(2-(2.2.1)-bicicloheptilmetil)benzoico, 10,12-peroxicalameneno, (1aS,10aR)-1a,5,9-trimetil-1a,3,6,10a-tetraidrooxireno[4,5]ciclodeca[1,2-b ]furano-10(2H)-ona, pterosina D, ácido terrecíclico, acetato de sugeonil, 3-acetil-13-deoxiphomenome, isocurcumenol, ligucyperonol, procurcumadiol Os metabólitos diferenciais identificados por espectrometria de massa secundária, bem como os bancos de dados HDMB e KEGG, nos modos íons positivo e negativo também são incluídos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Devido à grande variedade e natureza diferente dos MTCs, essas ervas às vezes não funcionam na prática clínica, e isso pode ser devido ao processamento inadequado e decocting de MTCs. Os mecanismos da MTC estão se tornando mais evidentes com o uso da ciência e tecnologia contemporâneas29,30. Este estudo mostra que tanto a RC quanto a CRV têm efeitos terapêuticos em ratos modelo de DP e que o efeito terapêutico da CRV é mais substancial. O mecanismo de ação do CRV pode estar relacionado ao fato de que o processamento do vinagre pode influenciar os constituintes do CR que são absorvidos pelo sangue e pode estar associado ao metabolismo do ácido linoleico e à biossíntese de ácidos graxos insaturados. A Figura 10 ilustra as possíveis vias de ação do CRV no alívio da dor.

Figure 10
Figura 10: Mecanismos do efeito analgésico aprimorado do CRV. Os resultados mostraram que 15 constituintes e dois metabólitos foram encontrados no sangue. Entre eles, os níveis de (-)-mirtenol e ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético no grupo CRV foram consideravelmente maiores do que no grupo CR. O CRV pode reduzir o nível de prostanóides da série 2 e leucotrienos da série 4 feitos de ARA e alcançar efeitos analgésicos através da modulação do metabolismo do ácido araquidônico, da biossíntese de ácidos graxos insaturados e do metabolismo do ácido linoleico. Abreviações: ARA = ácido araquidônico; COX = ciclooxigenase; LA = ácido linoleico; AGPI = ácidos graxos poli-insaturados; GLA = ácido γ-linolênico; DGLA = dihomo-γ-linolênico; DP = dismenorreia primária; GP = prostaglandina; LT = leucotrienos; TX = tromboxano; SDA = ácido estearidônico; ETA = ácido eicosatetraenóico; EPA = ácido eicosapentaenoico; CR = rizoma de Cyperi; CRV = CR processado com vinagre. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Precauções durante o experimento
Uma vez que o óleo do componente efetivo do CR é volátil, o tempo para extrair o CR não deve exceder 20 min, e quando ferve, deve ser em fogo baixo com uma temperatura não superior a 60°C durante a concentração. Para garantir a extração bem-sucedida dos ingredientes eficazes, as ervas devem ser embebidas em água por pelo menos 2 h antes da decocção para que as ervas estejam molhadas quando a imersão estiver completa. Durante o processamento CR, o vinagre deve ser bem misturado com as ervas para que o vinagre possa penetrar totalmente nelas. Se o volume de vinagre for muito baixo para molhar as ervas completamente, uma pequena quantidade de água pode ser adicionada para diluir o vinagre e, em seguida, o vinagre pode ser totalmente misturado com as ervas. Quando a mistura estiver completa, as ervas absorverão todo o vinagre. Como o vinagre contém ácido acético, a mistura não deve entrar em contato com o ferro para evitar uma reação química.

No experimento com ratos, a primeira injeção intraperitoneal de benzoato de estradiol é administrada no dia 10, em seguida, a administração intragástrica do extrato de CR ou CRV é administrada e, finalmente, a injeção intraperitoneal de ocitocina é administrada. Após a injeção intraperitoneal de ocitocina, o animal é observado por 30 min, e o sangue é imediatamente coletado. Geralmente, a concentração sanguínea atinge um pico dentro de 1 h após a administração intragástrica13, que é o melhor momento para a coleta de sangue.

Ao determinar as amostras de extracto e soro por LC-MS/MS, estas devem ser determinadas no mesmo lote para garantir que o tempo de retenção do mesmo componente em amostras diferentes é consistente. Neste experimento, a identificação dos componentes foi um ponto difícil. Embora um banco de dados relativamente maduro possa ser usado para metabólitos endógenos, não havia um banco de dados correspondente para identificar os constituintes absorvidos no sangue, portanto, mais cuidado deve ser tomado na identificação.

Diferenças nos constituintes absorvidos no sangue entre os grupos CR e CRV
Para determinar o princípio ativo da RC, este experimento investigou os constituintes absorvidos no sangue em ratos modelo de dismenorreia. Neste experimento, verificou-se que 15 constituintes e dois metabólitos no sangue diferiram entre os grupos RC e CRV. Entre eles, os níveis de (-)-mirtenol e ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético no grupo CRV foram consideravelmente maiores do que no grupo CR, mas os níveis de outros componentes não foram significativamente diferentes. O (-)-mirtenol e o ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético são terpenóides e considerados os componentes efetivos do CRV.

Ligucyperonol e procurcumadiol são produzidos pela oxidação de α-ciperona e isocurcumenol, respectivamente, e α-ciperona tem um forte efeito analgésico. O mecanismo de ação proposto pode reduzir a expressão de COX-2 induzida por LPS e a síntese de PGE2 através da regulação negativa da sinalização NF-kB31. (+)-Nootkatone também inibe a atividade da COX-232,33. O isocurcumenol é o componente central do rizoma de Curcumae no tratamento da dismenorreia3, e seu metabólito procurcumadiol pode ter efeito analgésico. Comparado ao grupo RC, o grupo CRV apresentou níveis consideravelmente mais elevados de (-)-mirtenol, que tem efeito analgésico34. O possível mecanismo de ação pode ser que alterações na expressão de COX-2 35 aumentem os níveis de citocinas anti-inflamatórias (IL-10, IFN-γ) e reduzam os níveis de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β)36. O processamento com vinagre melhora os níveis dos ingredientes ativos no sangue, e pode ser por isso que os produtos produzidos com vinagre são mais eficazes.

Diferenças nas vias metabólicas entre os grupos RC e CRV
A análise das vias mostrou vias metabólicas significativamente diferentes entre os grupos CR e CRV, incluindo em termos de metabolismo da fenilalanina, biossíntese de ácidos graxos insaturados, biossíntese de fenilalanina, tirosina e triptofano e metabolismo do ácido linoleico. Entretanto, as vias metabólicas do metabolismo da fenilalanina e da biossíntese de fenilalanina, tirosina e triptofano não estão relacionadas à DP. Esses resultados mostram que as vias metabólicas associadas à maior eficácia do CRV são o metabolismo do ácido linoleico e a biossíntese de ácidos graxos insaturados.

Os ácidos graxos insaturados incluem dois tipos: ômega-3 e ômega-637. Três precursores de mediadores, incluindo o ácido eicosapentaenoico (20:5ω3; EPA), ácido docosahexaenóico (22:5ω3; DHA) e ácido araquidônico (20:5ω6; ARA), estão envolvidos na via da biossíntese de ácidos graxos insaturados37,38. O metabolismo de EPA e ARA produz prostaglandinas e leucotrienos sob a ação da COX. ARA produz prostanoides de 2 séries, incluindo PGF 2 α, PGE 2, PGI 2 e tromboxano (TXA 2, TXB 2), e leucotrienos de 4 séries, incluindo leucotrieno A 4 (LTA 4), leucotrieno B 4 (LTB 4), leucotrieno C 4 (LTC 4) e leucotrieno D 4 (LTD 4). Os prostanoides da série 3 incluem a prostaglandina E 3 (PGE 3), prostaciclina I 3 (PGI 3) e tromboxano A2 (TXA 3), e os leucotrienos da série 5 incluem leucotrieno A 5 (LTA 5), leucotrieno B 5 (LTB 5), leucotrieno C 5 (LTC 5) e leucotrieno D 5 (LTD 5), que são em grande parte produzidos pela EPA.

O processo de transformação do EPA é o mesmo do ARA e é mediado por enzimas similares39. Os prostanoides da série 2 e os leucotrienos da série 4 têm principalmente efeitos pró-inflamatórios, agregação plaquetária e vasoconstrição. Em contraste, os prostanoides da série 3 e os leucotrienos da série 5 apresentam efeitos anti-inflamatórios, antiplaquetários e vasodilatadores38. TXA 2 e TXB2 são produzidos a partir de ARA, causando o estreitamento dos vasos sanguíneos. As PGI 3, PGE3 e TXA3 derivadas de EPA atuam apenas como vasodilatadores 38,40. EPA e ARA competem pela conversão em PGs pela enzima COX. Quando a relação EPA/AA da membrana é aumentada, os eicosanoides PGI 2 e TXA2, que promovem agregação, podem ser transformados em TXA 3 e PGI3, que promovem antiagregação, resultando em efeitos anti-inflamatórios e antiagregatórios40. Além disso, o uso combinado de EPA, DHA e ácido linoleico (C18:2ω6; LIN) pode reduzir a liberação de PGF 2 α e PGE2 em endométrio bovino e trofoblastos41,42.

A DP é provavelmente causada pela produção de PGs e leucotrienos 43,44,45, particularmente PGs 46. Enquanto isso, um desequilíbrio na vasopressina, β-endorfinas, estrógeno, progesterona, neurotransmissores, IL, ET-1 e NO também pode estar relacionado à dismenorreia47. De acordo com os resultados do ELISA, os níveis de PGF 2α e PGF2α/PGE 2 no grupo CRV diminuíram, enquanto o nível de PGE 2 aumentou em relação ao grupo RC. Além disso, leucotrieno B4 (C02165) e prostaglandina J2 (C05957) foram menores no grupo CRV. Isso indica que, no grupo CRV, houve níveis mais baixos de prostanoides da série 2 feitos de ARA, incluindo PGF2α, que é o fator mais importante para dismenorreia. A terapia com PGE 2 em altas concentrações dilata os vasos sanguíneos, e a PGE2 causa vasoconstrição em baixas concentrações48. Portanto, o útero é relaxado com vasodilatação, e a dismenorreia é aliviada.

Como o corpo humano não consegue sintetizar uma quantidade suficiente de ácidos graxos insaturados C18, o ácido linoleico e o ácido α-linolênico, que são a única fonte de ácidos graxos insaturados C18, são muito importantes38. O ácido linoleico e o ácido α-linolênico são a fonte do metabolismo dos ácidos graxos insaturados ômega-6 e ômega-3, respectivamente. Em particular, o precursor da síntese de prostaglandinas é o ARA, e o ARA é sintetizado a partir do ácido linoleico49. O ácido linoleico é um precursor, e uma série de metabólitos são sintetizados a partir dele, incluindo ARA, prostaglandinas (PGF 2 α, PGE 2), prostaciclina (PGI 2) e tromboxano (TXA 2)50. O ácido linoleico está intimamente relacionado ao efeito analgésico aumentado do CRV. Além disso, a via metabólica da biossíntese do hormônio esteroide pode produzir progesterona 51,52,53 e esfingosina-1-fosfato (C06124), que são produzidos pela via metabólica do metabolismo esfingolipídico, induzem COX-2 e produzem PGE2 através do TNF54,55,56,57. Estes também podem estar relacionados à DP.

Existem algumas limitações no protocolo. Apenas os níveis relativos dos constituintes foram comparados, e a amostra padrão não foi usada para quantificar os constituintes na erva e aqueles absorvidos no sangue. As fezes e urina dos ratos não foram coletadas nos experimentos com animais, resultando na descoberta de menos metabólitos de RC in vivo. Experimentos de validação devem confirmar ainda mais o mecanismo descoberto pela análise metabonomica.

A estratégia e o protocolo utilizados neste estudo evitaram a cegueira no estudo de componentes químicos in vitro e o estudo unilateral de componentes individuais in vivo. Portanto, era muito adequado para a exploração de mecanismos. A estratégia pode economizar muito tempo e trabalho e pode identificar com precisão os constituintes críticos e o mecanismo para a eficácia terapêutica.

Neste estudo, verificou-se que havia 15 constituintes e dois metabólitos no sangue. Entre eles, os níveis de (-)-mirtenol e ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético foram significativamente aumentados no grupo CRV em comparação com o grupo CR, mostrando que o processamento com vinagre pode aumentar os níveis dos ingredientes ativos no sangue. Após o processamento da RC com vinagre, os níveis de prostanoides da série 2 e leucotrienos da série 4 com propriedades pró-inflamatórias, agregação plaquetária e vasoconstrição diminuíram, incluindo PGF2α, leucotrieno B4 e prostaglandina J2. Esse pode ser o mecanismo pelo qual o CRV demonstra um efeito analgésico aumentado.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Comissão Municipal de Saúde e Planejamento Familiar de Chongqing Projeto de Ciência e Tecnologia de Medicina Chinesa (Número do Projeto: ZY201802297), Projeto Geral da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing (Número do Projeto: cstc2019jcyj-msxmX065), Chongqing Modern Mountain Area Characteristic High-efficiency Agricultural Technology System Innovation Team Building Plan 2022 [10] e Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project of Chinese Materia Processamento Médico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile  Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20 Beckman Coulter, Inc. MRZ15K047
Estradiol benzoate Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd C10042616
formic acid Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 177799
LC 30A system Shimadzu, Kyoto, Japan 228-45162-46
Olive oil Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd H25A11P111909
Oxytocin synthetic Zhejiang peptide biology Co., Ltd  2019092001
Rat PGF2α ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd 202101
Rat PGFE2 ELISA kit Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
Triple TOF 4600 system SCIEX, Framingham, MA, USA BK20641402
water Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 152720

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009 (2021).
  2. Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
  3. Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558 (2021).
  4. Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
  5. Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962 (2021).
  6. Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832 (2022).
  7. Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867 (2021).
  8. El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
  9. Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709 (2020).
  10. Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
  11. Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
  12. Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
  13. Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238 (2017).
  14. Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
  15. Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773 (2020).
  16. Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
  17. Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
  18. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  19. Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
  20. Zhao, L., Hartung, T. Metabonomics and toxicology. Methods in Molecular Biology. 1277, 209-231 (2015).
  21. Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
  22. Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
  23. Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
  24. Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
  25. Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763 (2021).
  26. Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642 (2021).
  27. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
  28. Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233 (2021).
  29. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  30. Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768 (2020).
  31. Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
  32. Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181 (2020).
  33. Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119 (2021).
  34. Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448 (2020).
  35. Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
  36. Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
  37. Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
  38. Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
  39. Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966 (2019).
  40. Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
  41. Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
  42. Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
  43. Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F. Adolescent dysmenorrhea. Endocrine Development. 22, 171-180 (2012).
  44. Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
  45. Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N. Prostaglandin level of primary dysmenorrhea pain sufferers. Enfermería Clínica. 30, 5-9 (2020).
  46. Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
  47. Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191 (2020).
  48. Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683 (2019).
  49. Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628 (2020).
  50. Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
  51. Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
  52. Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
  53. Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555 (2018).
  54. Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
  55. Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
  56. Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
  57. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).

Tags

Retratação Edição 190
Análise de Amostras de Cyperi Rhizoma Cru e Processadas Usando Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massas em Tandem em Ratos com Dismenorreia Primária
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., … More

Chen, Y., Li, N., Wang, D., Fan, J., Chu, R., Li, S. Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea. J. Vis. Exp. (190), e64691, doi:10.3791/64691 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter