Didermique co-culture de neurones de rat corticale primaire et des cellules gliales

Le but de cette procédure est de cultiver des neurones primaires en présence d’une couche de glie qui soutient leur croissance. Ces neurones peuvent ensuite être isolés en tant que population pure de neurones pour l’analyse. Ceci est accompli en cultivant d’abord les cellules gliales primaires.

La deuxième étape consiste à sous-cultiver les cellules gliales sur une surface, qui s’opposera aux neurones cultivés. Ensuite, les couches de cellules gliales neuronales sont combinées en un système de co-culture stable. En fin de compte, l’analyse cytochimique montre le développement d’une couche pure de neurones matures.

Bonjour, je m’appelle Anna T et je suis étudiante au laboratoire Dr.Olympia Muci à l’Université Drexel. Ici, nous allons montrer comment cultiver des neurones corticaux en présence d’une couche d’alimentation gliale. Il s’agit d’une technique qui a été développée à l’origine par Gary Banker et ses collègues et apprise par le laboratoire du Dr Muci et de Richard Miller à l’Université de Chicago, que nous avons ensuite adaptée à nos besoins expérimentaux.

Le principal avantage de cette technique par rapport à la culture neuronale pure est que les facteurs de trophée libérés par la glie soutiennent la croissance et la différenciation neuronales. Alors que les neurones peuvent ensuite être isolés en tant que population pure. Pour préparer la dissection, placez les outils stériles dans de l’éthanol à 70 %, ajoutez quatre millilitres de dissection à froid, des plats moyens à 60 millimètres, puis décongelez 2,5 % de voyages et d’ADN sur de la glace.

Après avoir décapité les chiots âgés de deux à quatre jours, placez les têtes dans un plat stérile de 100 millimètres pour chaque tête. Faites une coupe médiane à travers la peau et tirez la peau vers l’arrière afin d’exposer le crâne. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux incurvés pour faire une coupe médiane et deux coupes latérales à travers le crâne sans endommager le tissu cérébral en dessous.

Ensuite, retirez la partie supérieure du crâne pour exposer le cerveau, puis extrayez le cerveau et placez-le dans la boîte de 60 millimètres avec quatre millilitres de dissection froide, milieu préparé plus tôt sous un stéréomicroscope. Séparez les hémisphères, retirez le mésencéphale et décollez les méninges. Collectez tous les cortex cérébraux disséqués dans une nouvelle boîte de 60 millimètres avec un milieu de dissection frais à froid.

Ensuite, émincez le tissu avec une paire de ciseaux incurvés. Transférez ensuite le tissu haché dans un tube stérile de 15 millilitres. Portez le volume à 4,5 millilitres avec un milieu de dissection à froid et ajoutez 500 microlitres de 2,5 % de déclenchements.

Ensuite, enveloppez le tube dans un film para et placez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pendant ce temps, mélangez-le en inversant le tube toutes les cinq minutes. Ensuite, transférez le tissu dans un nouveau tube de 15 millilitres et essayez de minimiser le trébuchement contenant le milieu de dissection transféré dans le tube.

Amenez maintenant le volume final à 4,8 millilitres avec un milieu de dissection frais, et ajoutez 200 microlitres d’ADN à une concentration finale de 60 microgrammes par millilitre. Ensuite, triturez doucement avec une pipette stérile de cinq millilitres environ 20 fois et ajoutez 10 millilitres de milieu de placage glio. Attendez quatre à cinq minutes pour que les gros morceaux de tissu se déposent au fond.

Après cela, transférez les 80 % supérieurs de la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres. Répétez ensuite la durée du tissu avec deux à trois millilitres supplémentaires de placage GL. Douleur moyenne. Encore une fois, laissez le tissu se déposer.

Transférez ensuite les 80 % supérieurs à la collection précédente. Portez le volume total à 20 millilitres. Ensuite, centrifugez-le pendant 15 minutes à 280 fois G.Après cela, aspirez le supinate et remettez en suspension la palette cellulaire dans cinq à sept millilitres de milieu de placage ggl.

Ajoutez ensuite un placage supplémentaire, moyen à 10 millilitres pour chaque cerveau disséqué et mélangez bien les cellules. Plaque de 10 millilitres de suspension cellulaire dans chaque fiole de 75 centimètres carrés. Ensuite, incubez le ballon de culture à 37 degrés Celsius.

Changer le milieu de culture au bout de 24 à 48 heures, puis tous les trois à quatre jours pour préparer les lamelles Therman. Les lamelles de recouvrement en plastique utilisées une culture secondaire ggl ajoutent trois petites gouttes de cire para plast fondue autour de la circonférence de chaque thermadox lavé et autoclave. Les cellules seront plaquées de ce côté du thermadox.

Nos thermons sont des inserts de 60 millimètres réutilisables et fabriqués à la main avec des trous d’environ 52 millimètres percés. Bien qu’ils soient disponibles dans le commerce, des inserts de puits de culture peuvent également être utilisés. L’étape suivante consiste à laver le ggl primaire avec du PBS deux fois.

Agitez vigoureusement chaque flacon pour enlever les cellules non attachées. Chaque fiole avec une ggl primaire confluente fournira environ 10 millions d’astroglies. Par conséquent, nous utilisons souvent deux à quatre flacons par expérience.

Ensuite, détachez les cellules avec 0,05 % de trajets en EDTA. Combinez les cellules de deux flacons dans un tube conique de 50 millilitres et ajoutez une quantité égale de milieu de placage ggl, puis centrifugez pendant 15 minutes à 280 fois la gravité. Aspirez le supinate et dissolvez les pastilles GL dans quelques millilitres de placage GL. Douleur moyenne.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et diluez la suspension cellulaire au besoin. Ensuite, plaquez 500 000 cellules soit sur des paraboles de 60 millimètres, soit sur des lamelles thermiques à l’aide d’un support de placage GL pour plaque thermon. 600 microlitres de cellules sur chaque couvercle se glissent en goutte à goutte, et après deux heures, retournez chaque thermadox pour immerger les cellules dans le milieu de placage glial.

Si vous préparez des boîtes de 60 millimètres de glie secondaire pour les feuillets de couverture neuronale, changez le milieu pour en terminer deux la veille de la dissection neuronale. Dans cette procédure, pour préparer les lamelles de verre de 15 millimètres, ajoutez trois petites gouttes de parablasts fondus. Appliquez de la cire sur la circonférence de chaque lamelle stérile afin de séparer physiquement les couches cellulaires et d’éviter le grattage de la couche cellulaire.

Le couvercle glisse toutes les paraboles de 60 millimètres avec 0,5 milligramme par millilitre de polylysine pendant deux heures ou toute la nuit. Ensuite, lavez-les deux à trois fois à l’eau stérile et laissez-les sécher complètement pour préparer la dissection neuronale. Euthanasier une rat enceinte de 17 jours.

Vaporisez-le avec de l’éthanol à 70 % et coupez médialement à travers la peau pour exposer l’utérus. Après cela, retirez tous les fœtus et placez-les dans une boîte stérile de 100 millimètres. Après avoir disséqué et décapité rapidement chaque fœtus, placez chaque tête dans une boîte de 60 millimètres avec quatre millilitres de milieu de dissection à froid sous le stéréomicroscope.

À l’aide d’une paire de pinces, isolez les cortex cérébraux en ouvrant la peau et le crâne, en extrayant le cerveau, en séparant les hémisphères et en enlevant le mésencéphale et les méninges. Rassemblez tous les cortex disséqués dans une boîte fraîche de 60 millimètres avec un milieu de dissection à froid. Ensuite, émincez le tissu avec une paire de ciseaux incurvés en morceaux d’environ un millimètre.

Transférez le tissu haché dans un tube stérile de 15 millilitres. Portez le volume à 4,5 millilitres avec un milieu de dissection à froid et ajoutez 500 microlitres de 2,5 % de voyages dans le tissu. Suite à cela.

Enveloppez le tube dans un film para et placez-le dans un bain-marie à 36 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pendant ce temps, mélangez-le en inversant le tube toutes les cinq minutes. Par la suite, transférez le tissu dans un nouveau tube de 50 millilitres et essayez de minimiser les trébuchements contenant le milieu de dissection transféré dans le tube.

Portez le volume à 4,8 millilitres avec un milieu de dissection frais, et ajoutez 200 microlitres de D Ns à une concentration finale de 60 microgrammes par millilitre. Ensuite, triturez environ 10 fois avec une pipette stérile de cinq ou deux millilitres. Répétez cette étape si nécessaire.

À l’aide d’une pipette à pâtes polie au feu pour dissocier la majeure partie du tissu, laissez les morceaux de tissu restants se déposer au fond pendant quatre à cinq minutes. Ensuite, retirez la suspension supérieure à cellule unique tout en laissant derrière vous les morceaux de tissu déposés. Transférez-le dans un nouveau tube avec un volume égal de milieu de placage de neurones et mélangez-les doucement.

Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et plaquez-les soit sur des lamelles de 15 millimètres comme environ 35 000 cellules dans 200 microlitres, soit sur des boîtes de 60 millimètres comme environ 1 million de cellules dans trois millilitres. Incuber les cellules à 36,5 degrés Celsius pendant trois à quatre heures après l’incubation. Combinez la couche de neurones et le ggl secondaire pour les neurones sur des paraboles de 60 millimètres.

Lavez les cellules avec du DMEM chaud. Changez le milieu à quatre millilitres de N deux milieu et ajoutez un thermon avec ggl dans chaque assiette. Avec le GL face aux neurones pour les lamelles neuronales, transférez trois à cinq lamelles dans chaque boîte de 60 millimètres de ggl secondaire avec les neurones vers le bas 24 heures après le placage les neurones, ajoutez 10 micromolaires de cytosine Beta D Arab azi à chaque boîte pour empêcher la prolifération gliale montrée ici comme exemple de neurones de la neuroglie par co-culture laminaire.

Cinq heures après le placage, les processus continuent de s’allonger à ce stade. Voici un exemple de neurones issus de la co-culture de neuroglie bi lanar 12 jours après le placage. À ce stade, les axones et les nites étendus des cellules sont clairement visibles.

Au fur et à mesure que les neurones mûrissent, les ABA dendritiques deviennent plus élaborés et développent des contacts synaptiques environ deux à trois semaines après la mise en boîte. De nombreuses épines dendritiques sont visibles, comme le montre cette figure. Lors de l’exécution de cette technique, il est important de travailler rapidement et de maintenir la stérilité de chaque réactif est un manque d’antibiotiques dans notre culture.

Le milieu rend les cellules très sensibles à la contamination.