Purification des relevés de notes et de métabolites Drosophila Têtes

Le but de cette procédure est d’obtenir des transcrits et des métabolites de drosophile, têtes en qualité et en quantité suffisantes pour effectuer des études cohérentes à haut débit. Pour ce faire, il faut d’abord générer et congeler des mouches du génotype et de l’âge appropriés en trois exemplaires. Ensuite, les tissus sont préparés pour l’extraction en séparant les têtes de mouches des corps tout en gardant les tissus congelés.

Ensuite, les têtes sont lyophilisées. Enfin, le tissu est traité avec du triol ou du chloroforme pour en extraire respectivement les transcrits ou les métabolites. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent qu’un ARN et des métabolites de haute qualité peuvent être obtenus par bioanalyseur et analyse RMN.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la base cellulaire de la neurodégénérescence progressive, elle peut également être appliquée à d’autres maladies telles que le cancer, le vieillissement et les troubles induits par le stress. Pour commencer, faites des croisements en combinant 10 vierges avec un transgène d’intérêt sous le contrôle d’UAS et cinq gal sensibles à la température et sans eau. Transformez quatre mâles en grandes bouteilles.

Étiquetez les bouteilles et placez-les à 25 degrés Celsius Après deux jours, retirez les adultes des bouteilles et placez les bouteilles à 18 degrés Celsius. Lorsque les ELO de la progéniture collectent des vierges et les placent dans de petits flacons de nourriture pour mouches, étiquetez les flacons et placez-les à 18 degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures à 18 degrés Celsius, déplacez les flacons à 29 degrés Celsius.

Transférez les mouches dans des flacons propres tous les deux jours jusqu’à ce qu’elles atteignent les jours 10 et 20. Lorsque les mouches atteignent l’âge souhaité, comptez-les et utilisez un petit entonnoir pour les transférer dans des flacons cryogéniques pré-étiquetés. Retournez les flacons sur le banc et attendez 30 minutes.

Puis clignotez. Congelez les flacons par immersion dans de l’azote liquide et conservez-les dans une boîte de congélation pré-étiquetée et pré-réfrigérée. Pour collecter les têtes de mouches, assemblez le tamis et pré-refroidissez-le à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes.

Réfrigérez un morceau de paraform de neuf centimètres sur 14 centimètres sur de la glace sèche pendant cinq minutes. Videz les flacons cryogéniques sur le paraform quelques-uns à la fois. Utilisez un pinceau pour compter les mouches et stockez-les dans un autre flacon cryogénique sur de la glace sèche jusqu’à ce que 100 mouches s’accumulent.

Ensuite, trempez le tamis dans de l’azote liquide, puis ajoutez les 100 mouches dans la chambre supérieure et secouez vigoureusement le tamis pendant une minute. Trempez-le à nouveau dans l’azote liquide et secouez pendant une minute supplémentaire. Ouvrez le tamis.

Récupérez les têtes de la chambre inférieure dans un micro-tube et placez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que tous les échantillons soient prêts à être lyophilisés. Ouvrez les micro-tubes, enveloppez les sommets dans du film para et faites de petits trous. Placez les échantillons dans le lyophilisateur pendant au moins deux jours pour extraire l’ARN.

Retirez les échantillons du lyophilisateur et ajoutez trois petites billes de broyage en acier stériles dans chaque microtube. Placez-le dans le broyeur de mouchoirs et exécutez à 1 500 coups par minute. Pendant une minute, ajoutez un millilitre de triazole et utilisez du paraform pour sceller les tubes, broyez pendant une minute, tapotez les tubes à l’envers pour déloger les billes d’acier si nécessaire, et broyez pendant une minute supplémentaire.

Pipetez le mélange dans un nouveau microtube sans ARN. Granulez les débris cellulaires dans une micro-centrifugeuse de table qui 12 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir transféré le surnageant S dans un nouveau microtube, ajoutez 0,1 volume d’un trois bromo chloropropane et agitez vigoureusement pendant 15 secondes.

Incuber à température ambiante pendant trois minutes, puis tourner à 12 000 fois G pendant 15 minutes À quatre degrés Celsius, transférez la couche aqueuse supérieure dans un nouveau microtube. Faites précipiter l’ARN en ajoutant 0,5 volume d’isopropanol glacé et inversez six fois pour mélanger. Incuber l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes, puis tourner après avoir retiré le surnageant S.

Lavez l’ARN en ajoutant un millilitre de glacé, 70 % d’éthanol et un bref vortex. Avant d’essorer, retirez le plomb et séchez-le à l’air libre pendant au moins 15 minutes. Ajoutez 80 microlitres d’eau DEPC et placez-le à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, conservez-le pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain. Déterminez la concentration d’ARN après avoir purifié 30 microgrammes d’ARN en vrac conformément au protocole textuel et déterminé la concentration, utilisez le test PICO de l’ARN total sur un bioanalyseur pour évaluer la qualité de l’ARN pour la purification de l’ARN. Placez un tube à microdéchets sans ARN contenant 30 microlitres de billes de dyna sur un aimant pendant une à deux minutes, puis retirez le surnageant.

Suspendez à nouveau les billes dans 15 microlitres de tampon de liaison. Incuber le tube sur l’aimant et retirer le tampon après avoir utilisé de l’eau DEPC pour ajuster le volume de cinq microgrammes d’ARN total à 15 microlitres. Chauffez l’ARN à 65 degrés C pendant deux minutes et placez-le sur de la glace.

Ajoutez 15 microlitres d’ARN total aux 15 microlitres de billes prélavées et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Placez l’aimant pendant une à deux minutes et retirez le surnageant. Une fois que l’ARN a été lavé trois fois avec 35 microlitres de tampon de lavage B et que le lavage final a été retiré, éluez le MR. NA en ajoutant 15 microlitres de chlorhydrate de tris froid de 10 millimolaires et en chauffant l’échantillon à 80 degrés Celsius pendant deux minutes.

Transférez immédiatement le surnageant S dans le tube libre d’une RN a et congelez-le à moins 80 degrés Celsius. Le rendement doit être de l’ordre de 1 à 5 % de l’ARN total pour effectuer l’extraction du méthyl chloroforme. Commencez par ajouter de l’hydroxy toluène butylé au chloroforme et à une concentration de 0,1 milligramme par millilitre.

Transférez 200 têtes dans des tubes en polypropylène coniques pré-pesés réfrigérés, congelez à moins 80 degrés Celsius et lyophilisez-les après avoir déterminé le poids sec à cinq à sept billes de zircone et homogénéisé un batteur de billes pendant deux cycles de 20 secondes à 800 hertz. À l’aide du poids sec, calculer l’eau, le méthanol et le chloroforme à ajouter dans les proportions suivantes où X est le poids de l’échantillon le plus lourd en grammes et le produit est le volume de chaque liquide en millilitres par rapport au tube contenant les têtes lyophilisées. On calcule l’addition de tout le méthanol et 45 % de l’eau totale, après homogénéisation de l’échantillon dans la bille bêta pendant deux autres cycles de 20 secondes chacun, on ajoute tout le chloroforme et l’eau restante dans un flacon conique en verre sur glace.

Transférez le mélange de perles dans le flacon en verre pendant 10 minutes, puis incubez pendant 10 minutes sur de la glace. Après un essorage de cinq minutes à 2000 fois G et quatre degrés C.Utilisez une pipette à pâtes pour retirer la phase polaire supérieure et placez-la dans un deuxième micro-tube. Après avoir congelé la phase non polaire inférieure dans un petit flacon en verre à moins 80 degrés Celsius, séchez-le sous un courant d’azote gazeux.

Ajouter 620 microlitres de chloroforme déclassé pour réhydrater la phase non polaire. Transférez 600 microlitres dans des tubes RMN étiquetés et placez le polyphasé dans le sentri VA à 30 degrés Celsius. Faites fonctionner le Sentri VA jusqu’à ce que le tube soit complètement sec, environ sept heures.

Réhydratez le polyphasé avec 620 microlitres de tampon de phosphate de sodium 0,1 molaire dans de l’oxyde de deutérium avec un TMSP millimolaire comme étalon interne et tourbillonnez pendant 30 secondes. Après une rotation à 10 000 tr/min et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférer 600 microlitres de SUPINATE dans des tubes RMN pour déterminer la dynamique d’expression des attaques d’expansion dans trois gènes de tranchée sous le contrôle de GAL A TTS et de l’échelle DOLA, quatre transferts Western ont été effectués à partir de différents points temporels à la température restrictive et, comme le montre ici, l’expression était faible à six heures et a continué à augmenter jusqu’à 48 heures où elle a atteint des niveaux saturés.

La protéine a également été détectée par immunofluorescence dans des cerveaux de mouches disséqués d’abord à 24 heures, puis atteignant des niveaux maximaux entre 48 et 72 heures après le changement de température pour déterminer la toxicité d’ATIN 3 78 Q, nous avons collecté des mouches exprimant LAX Z aax dans 3 27 Q et AAX dans 3 78 Q et enregistré leur longévité. Alors que les mouches exprimant l’absence de Z et d’ATEX dans 3 27 Q présentaient une viabilité de plus de 90 % après 20 jours, les mouches exprimant atex dans 3 78 Q présentaient un faible taux de survie au 20e jour. Dans cet exemple, deux échantillons d’ARN total avant le traitement de l’ADN ont été analysés sur une puce de bioanalyseur.

L’échantillon d’ARN de haute qualité a produit trois bandes d’ARN nettes, deux d’une taille légèrement inférieure à 2000 nucléotides et une bande plus petite inférieure à 200 nucléotides représentant les ARN ribosomiques. Ces qualités ont également été observées dans les traces du bioanalyseur. En revanche, le deuxième échantillon d’un échantillon d’ARN dégradé n’a pas produit les pics aigus des ARN ribosomiques et a accumulé plusieurs bandes de moins de 500 nucléotides.

Cette distribution de taille a été facilement distinguée dans les traces du bioanalyseur dans lesquelles de larges pics de taille plus courte ont été notés. Seul l’ARN présentant une qualité maximale est utilisé pour générer des banques. L’analyse RMN de cette figure identifie quelques pics proéminents correspondant à des métabolites très abondants, tels que le glucose et le saccharose, et deux acides métaboliques clés, le lactate et l’acétate, selon les changements chimiques dans la littérature.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des transcrits et des métabolites de haute qualité à partir de grandes collections de têtes Joss qui vous permettront de découvrir les perturbations moléculaires et cellulaires induites par les amyloïdes toxiques qui médient la perte de cellules neuronales.