Identification de haut débit synergique des associations de médicaments par la méthode2 de chevauchement

L’objectif global de cette méthodologie est d’identifier les molécules synergiques, qui amplifient l’activité de l’autre, lorsqu’elles sont combinées par criblage à haut débit. Les paires de médicaments synergiques sont une stratégie prometteuse pour lutter contre les infections résistantes aux médicaments, mais elles sont difficiles à identifier. Cette méthode permet d’identifier les molécules qui interagissent avec les médicaments antimicrobiens existants utilisés pour traiter les maladies infectieuses.

À long terme, ces combinaisons peuvent entrer dans l’évaluation préclinique et, à terme, améliorer les soins aux patients. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée avec n’importe quel organisme d’intérêt et avec n’importe quelle bibliothèque de petites molécules. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de plusieurs maladies infectieuses car elle fonctionne avec tout organisme d’intérêt.

Utilisez une feuille de calcul standard pour calculer le score de croissance moyen et l’écart-type de tous les mutants, en présence d’une concentration particulière de la petite molécule ajoutée. Ensuite, calculez les scores Z pour chacune des concentrations de petites molécules. Ensuite, mettez en évidence les mutants du gène avec des scores Z significatifs.

Tout d’abord, cultivez une culture d’E. coli dans un milieu minimal M9, pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, dissolvez les petites molécules dans du sulfoxyde de diméthyle à une concentration élevée supérieure à 10 milligrammes par millilitre. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu M9 dans chaque puits dans une plaque de 96 puits.

Pipeter 100 microlitres supplémentaires de milieu M9 dans la première colonne, de sorte que le volume de cette colonne soit de 200 microlitres. Ensuite, ajoutez environ 10 microlitres de la solution concentrée de petites molécules, dans la première colonne. Après avoir ajouté les petites molécules, commencez à le diluer sur l’axe X de la plaque.

Continuez à diluer jusqu’à ce qu’il y ait, 100 microlitres dans la colonne 11. Après avoir mélangé la colonne 11, jetez 100 microlitres de cette colonne. Qu’il n’y ait que le milieu dans la colonne 12 pour normaliser les données.

Ensuite, enregistrez la valeur de densité optique à 600 nanomètres de la culture de nuit cultivée dans le milieu minimal M9. Ensuite, ajoutez deux microlitres de la culture dans chaque puits. De sorte qu’il y a 1000 cellules par puits.

Ensuite, secouez doucement l’assiette. Et notez la lecture de la densité optique à 600 nanomètres pour le point de temps de l’heure zéro. Une fois la lecture enregistrée, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une journée.

Encore une fois, mesurez la valeur de la densité optique à 600 nanomètres pendant 24 heures. Pour effectuer le test en damier, cultivez une culture d’E. coli dans un milieu minimal M9 pendant une nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu M9 dans chaque puits et ajoutez 100 microlitres supplémentaires du même milieu dans la première colonne d’une plaque de 96 puits.

Ensuite, ajoutez les petites molécules de test, dans chaque puits de la première colonne. Et ajoutez le double de la concentration dans le puits A1. Ensuite, créez un gradient de dilution le long de l’axe X en transférant 100 microlitres, de la première à la deuxième colonne. Continuez le processus de dilution jusqu’à ce que 100 microlitres soient ajoutés dans la colonne 11.

Après avoir mélangé la colonne 11, jetez 100 microlitres de cette colonne et laissez la colonne 12 avec uniquement du milieu sans aucun médicament. Créez un autre gradient pour la deuxième dilution du médicament. Pour ce faire, ajoutez 100 microlitres du milieu contenant deux X, concentration inhibitrice minimale de la molécule d’entrée dans la rangée A.Ensuite, transférez 100 microlitres de la rangée A à B.Continuez le processus de dilution, jusqu’à ce que 100 microlitres soient ajoutés dans la rangée G.Après avoir mélangé la rangée G, jetez 100 microlitres du puits.

Ensuite, inoculez la plaque avec deux microlitres de la culture dans chaque puits. De sorte qu’il y a 1000 cellules par puits. Ensuite, mesurez la lecture de la densité optique à 600 nanomètres pour un point de temps de zéro heure.

Une fois la lecture enregistrée, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, mesurez la valeur de la densité optique à 600 nanomètres pendant 24 heures. Pour effectuer un criblage à haut débit, pour les médicaments synergiques, cultivez à la fois des cellules mutantes de type sauvage et de prédiction de synergie dans un milieu minimal M9.

Ensuite, ajoutez les médicaments de la bibliothèque au support. Ensuite, inoculez une plaque de médicaments de bibliothèque avec le type sauvage et une autre plaque avec des bactéries mutantes de prédiction de synergie. Cette planche représente le test en damier utilisé pour étudier les combinaisons de médicaments synergiques.

Dans cette plaque, bien F9 avec le score FICI le plus bas de 0,07 indique que la paire de petites molécules est synergique. Cette planche représente le test en damier pour étudier les combinaisons de médicaments sans interaction. Dans cette plaque, le puits C3 avec le score FICI le plus bas de 1,0 indique que la paire de petites molécules n’interagit pas les unes avec les autres.

Cette planche représente le test en damier utilisé pour étudier les combinaisons de médicaments antagonistes. Dans cette plaque, bien A1 avec le score FICI le plus bas de 8,0 indique que l’interaction entre les molécules médicamenteuses est antagoniste. Ensuite, Befeldin A, une petite molécule de fluconazole, est utilisée pour étudier la croissance des formines C et U.

Le graphique montre que la croissance du mutant de prédiction de type sauvage et de synergie est légèrement inhibée et dans la même mesure. Cela indique que la béfeldine A et le fluconazole sont des partenaires médicamenteux non synergiques. Au contraire, la croissance du mutant de prédiction de synergie des formines C et U est inhibée de manière significative, en présence de Refromisyn et de Fluconazole.

Indiquant que les médicaments sont des partenaires synergiques. Il est intéressant de noter que la croissance de type sauvage n’est pas du tout inhibée. Ici, la plus grande différence de croissance est observée, entre 32 et 49 heures après l’inoculation.

Une fois maîtrisée, cette technique peut raccourcir le temps d’identification des interactions médicamenteuses synergiques. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas combiner les médicaments dans la dernière colonne de la dernière rangée du test en damier. Suite à cette procédure, d’autres méthodes d’identification synergique de molécules peuvent être mises en œuvre afin d’identifier d’autres interactions médicamenteuses synergiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la méthodologie O2M pour identifier les marqueurs de synergie présumés afin de trouver des interactions médicamenteuses synergiques avec votre organisme d’intérêt. N’oubliez pas que travailler avec de petites molécules peut être dangereux et que toutes les précautions de la fiche signalétique doivent être suivies lors de l’exécution de ce protocole.