À haut débit de dosage de phénotype Salmonella enterica Association Typhimurium, Invasion, et la réplication dans les macrophages

L’objectif général de l’expérience suivante est de cribler et d’évaluer les gènes nécessaires à l’invasion et/ou à la survie à l’intérieur des cellules de macrophages in vitro, à haut débit, et d’identifier les gènes mécanistes de la pathogenèse de la salmonelle. Ceci est réalisé en ajoutant des souches de salmonelles de type sauvage ou mutantes à des cultures de cellules de macrophages. Dans 96, les plaques de puits pendant 30 minutes comme une infection in vitro comme deuxième étape après l’incubation de 30 minutes, les salmonelles qui ne se sont pas attachées aux cellules macrophages sont lavées et fraîches.

Un milieu contenant une forte concentration d’antibiotique Gentamycine est ajouté pendant une heure, ce qui tue toutes les bactéries extracellulaires qui ne sont pas internalisées. Ensuite, la culture de cellules de macrophages est lavée à nouveau et un milieu frais contenant une faible concentration de gentamycine est ajouté pour une incubation supplémentaire de 22,5 heures afin de maintenir un environnement extracellulaire exempt de bactéries et de permettre uniquement à la salmonelle intracellulaire de survivre et de proliférer. Les résultats montrent qu’en comparant la salmonelle mutante avec la souche de type sauvage, le phénotype in vitro des souches mutantes pour l’invasion et la réplication de l’association est déterminé sur la base de la mesure des unités de formation de colonie par cellules de macrophage obtenues par le test de dilution en série pour chaque point temporel.

Le principal avantage de notre technique est qu’elle mesure l’association, l’invasion et la réplication des cellules salmonelles et phagocytaires et qu’elle peut mesurer plusieurs souches simultanément pour un débit plus élevé. La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Jing Wu, chercheur postdoctoral dans mon laboratoire, et Mme Roberta Pugh, associée de recherche dans mon laboratoire. Pour commencer la rangée, le faible nombre de passage reflétant les cellules de macrophages brutes 2 64 0,7 dans un flacon de culture cellulaire T 75 avec un capuchon filtrant ventilé dans un milieu d’aigles modifiés Delcos complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 0,5 % de bicarbonate de sodium et 1 % 100 x acides aminés non essentiels NEAA à 37 degrés Celsius dans un Incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.

Lorsque les cellules atteignent 60 à 80 % de confluence, récoltez les cellules dans le DMEM à l’aide d’un grattoir cellulaire, puis comptez les cellules dans un hémocytomètre et calculez la concentration cellulaire, diluez la suspension cellulaire à une concentration de 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de culture cellulaire DMEM fraîche. Plaque moyenne de 200 microlitres de suspension cellulaire diluée à l’aide d’une pipette multicanaux dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 96 puits Plaque de cellules en trois plaques distinctes de 96 puits pour un ensemble de test d’invasion de cellules phagocytaires et étiquetez chaque plaque avec l’association, l’invasion et la réplication. Quatre puits par plaque sont utilisés pour chaque souche de salmonelle.

Placez les plaques dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour permettre aux cellules macrophages de se fixer au fond des puits le même jour. Les cellules brutes du macrophage 2 6 4 0,7 sont plaquées dans des plaques de 96 puits. Choisissez des colonies uniques de sérotype sauvage Salmonella entera, tyria 1, 0, 4, 2, 8, delta, INVA, mutant, delta, quatre, P mutant, et la culture souhaitée des souches mutantes testées.

Chacune des souches de salmonelle dans cinq millilitres de bouillon LB et compléter le bouillon LB pour les souches mutantes Avec 50 microgrammes par millilitre de mycine en conserve, faites croître les bactéries pendant 14 heures à 37 degrés Celsius en agitant à 220 tr/min dans des tubes à fond rond en polypropylène de 14 millilitres légèrement bouchés. Après l’incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius, chacune des souches de salmonelle se développe dans un rapport de un à 50 dans cinq millilitres de bouillon respectif. Faites pousser les cultures pendant quatre heures supplémentaires à 37 degrés Celsius en secouant à 220 tr/min.

Lire les valeurs OD 600 de chaque culture bactérienne sur un spectrophotomètre. Chaque culture doit avoir une valeur OD 600 comprise entre 0,6 et 1,2 pour optimiser la pathogénicité de la salmonelle : système de sécrétion insulaire un à trois, SPI, un type trois, système de sécrétion, expression génique pour l’invasion. Calculez la concentration bactérienne à l’aide de la formule un OD 600 égale 7,5 fois 10 puissance huit unités formant colonie par millilitre.

Retirez ensuite de l’incubateur de dioxyde de carbone 3 plaques de culture cellulaire de 96 puits contenant des macrophages et lavez chaque puits une fois avec 200 microlitres d’un XPBS. Une fois que le lavage PBS est complètement éliminé de chacun, ajoutez bien 200 microlitres de bactéries dans un milieu DMEM dans chaque puits. Il en résulte une fois 10 pour les six cellules de salmonelle dans chaque puits et une multiplicité de MOI d’infection de 20 pour une centrifugeuse les plaques dans un récipient scellé à 1000 fois G pendant 10 minutes.

Placez ensuite les plaques dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois l’incubation de 30 minutes terminée, retirez les plaques de l’incubateur et lavez chaque puits trois fois avec 200 microlitres d’un XPBS pour éliminer les bactéries non associées. Ensuite, à 200 microlitres de milieu DMEM contenant 100 microgrammes par millilitre de gentamycine à chaque puits des plaques marquées d’invasion et de réplication afin de tuer la salmonelle extracellulaire.

Remettez ensuite les plaques dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure supplémentaire. Pour la plaque d’association, conservez un puits de chaque souche infectée pour l’enregistrement du nombre de cellules de macrophages et traitez les puits restants avec 200 microlitres d’un XPBS contenant 1 % de tritton X 100 pendant 10 minutes. Pour trancher les cellules, récoltez la salmonelle de chaque puits et placez-les dans des tubes de 1,5 millilitre et orph Faites trois dilutions de céréales dix fois supérieures avec 900 microlitres d’un XPBS sur les échantillons récoltés de chaque puits et vortex entre chaque vortex de dilution la troisième dilution, 10 à moins trois pour chaque bactérie et placez 10 microlitres de l’échantillon sur des plaques LB pour le type sauvage ou des plaques LB

Avec peut mycine pour les souches mutantes. Répétez cette étape quatre fois pour un total de cinq gouttes de 10 microlitres espacées uniformément sur les plaques après que les gouttes aient trempé dans l’agar, retournez les plaques et incubez toute la nuit Dans un incubateur à 37 degrés Celsius, traitez les puits restants conservés pour compter les macrophages avec 150 microlitres d’un XPBS contenant 0,25 % d’EDTA pendant 10 minutes. Après trypsinisation, transférez les macrophages dans des tubes de 1,5 millilitre et traitez-les avec 50 microlitres de FBS pour neutraliser la solution d’EDTA d’essai.

Retirez ensuite 10 microlitres de suspension cellulaire d’un tube EOR dans un nouveau tube. Ajoutez 10 microlitres de bleu trian à 0,4 % pour colorer les cellules et comptez-les dans un hémocytomètre lorsque les plaques d’invasion et de réplication ont terminé l’incubation d’une heure dans l’incubateur de dioxyde de carbone. Retirez les plaques de l’incubateur et lavez chaque puits trois fois avec 200 microlitres d’un XPBS.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de milieu DMEM contenant 10 microgrammes par millilitre de gentamycine dans la plaque de réplication pour maintenir l’élimination de la salmonelle extracellulaire dans le milieu. Placez ensuite la plaque dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 22,5 heures supplémentaires. Ensuite, récoltez et reflâtrez la salmonelle de la plaque d’invasion sur des plaques de gélose et comptez les macrophages d’un puits de chaque souche infectée en suivant les étapes décrites pour la plaque d’association le lendemain.

Retirez la plaque de réplication de l’incubateur et lavez chaque puits trois fois avec 200 microlitres d’un XPBS. Ensuite, récoltez et faites réfrigérer la salmonelle de la plaque de réplication sur des plaques de gélose et comptez les macrophages d’un puits de chaque souche infectée en suivant les étapes décrites pour la plaque d’association. Une fois que les plaques de gélose ont incubé pendant la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius, retirez les plaques de l’incubateur et notez le nombre de colonies bactériennes par plaque.

En comptant chaque plaque, la répartition des colonies doit se situer entre 10 et 100 colonies. Si le nombre est trop élevé ou trop faible, reminéralisez l’échantillon avec une dilution dix fois supérieure ou inférieure selon les besoins. L’essai d’invasion de cellules phagocytaires identifie de manière appropriée le phénotype des mutants de délétion de la salmonelle, comme on le voit pour la souche de contrôle de l’invasion delta INVA, un mutant d’invasion défectueux connu, et la souche de contrôle de réplication delta quatre P.

Une réplication connue défectueuse mutant Mutant A et Mutant B sont deux souches représentatives test utilisant ce protocole qui présentent des phénotypes modifiés pour la réplication dans les macrophages 20 sur 38. Les mutants de Salmonella testés jusqu’à présent dans le test d’invasion de cellules phagocytaires présentent des défauts variables mais significatifs d’association, d’invasion et/ou de réplication dans les macrophages bruts de 2, 6, 4 0,7. Ce protocole n’a été testé que pour certaines cellules statiques nala et à effet hôte.

Ainsi, la modification et l’optimisation seront nécessaires pour d’autres bactéries et cellules hôtes.