La synthèse in vitro de l'ARNm modifié pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules humaines

L’objectif global de cette procédure est la synthèse in vitro d’ARNm modifiés pour l’induction de l’expression des protéines dans les cellules. Ceci est accompli en amplifiant d’abord l’insert plasmidique ou la séquence d’ADN codante et en ajoutant une queue poly T de 120 thymidine en utilisant la réaction en chaîne par polymérase. La deuxième étape est la transcription in vitro de l’ADN généré en ARNm avec des queues de polyadénine.

Ensuite, l’ADN matrice est éliminé par le traitement D’S du mélange réactionnel de transcription in vitro. La dernière étape est le traitement à la phosphatase antarctique de l’ARNm produit pour éliminer cinq phosphates primaires. En fin de compte, les cellules sont transfectées par l’ARNm généré, des complexes lipidiques.

La microscopie fluorescente et l’analyse par cytométrie en flux sont utilisées pour montrer la synthèse de la GFP améliorée dans les cellules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le transfect viral, est le manque d’intégration dans le génome de la cellule hôte, ce qui prévient le risque d’oncogenèse. Cette méthode peut aider à produire des protéines manquantes ou défectueuses dans les cellules et peut être utilisée pour le traitement par vaccination des troubles génétiques.

Et dans le domaine de la médecine régénérative, Steinle, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Avant le début de cette procédure, les plasmides contenant les séquences d’ADN codantes requises ou CDS ont été amplifiés chez e coli et isolés comme décrit dans le texte du protocole. Dans cet exemple, la CDS d’intérêt est la protéine fluorescente verte améliorée ou EGFP pour amplifier et ajouter simultanément un détail poly à la CDS de l’EGFP.

Préparez un mélange PCR comme indiqué dans le texte du protocole. Placez le tube PCR dans un thermocycleur et exécutez le protocole de cyclage PCR décrit dans le texte du protocole. Lorsque la réaction PCR est terminée, nettoyez la réaction PCR à l’aide d’un kit de purification PCR disponible dans le commerce et diluez l’ADN avec 20 microlitres d’eau sans nucléases.

Pour vérifier la qualité du produit PCR, effectuez une électrophorèse sur gel d’ADN et visualisez les bandes d’ADN sur un système d’imagerie. Une bande d’ADN claire d’une longueur d’environ 1 100 paires de bases doit être détectée lors de la transcription in vitro ou IVT. L’ADN généré précédemment sera transcrit en ARNm.

Préparez le mélange analogique de capuchon NTP comme indiqué ici. Mélangez soigneusement le mélange analogique du capuchon NTP par vortex. Ensuite, tournez-le vers le bas Assemblez brièvement le mélange réactionnel IVT comme décrit dans ce tableau.

Mélangez soigneusement le mélange réactionnel IVT en pipetant doucement de haut en bas. Ensuite, centrifugez brièvement le tube PCR pour recueillir le mélange au fond du tube. Incuber le mélange réactionnel IVT à 37 degrés Celsius pendant trois heures dans un mélangeur thermique.

Après trois heures, retirez l’ADN matrice en ajoutant un microlitre d’ADN au mélange réactionnel IVT. Bien mélanger et laisser incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Purifiez le mélange réactionnel à l’aide d’un kit de purification d’ARN et diluez deux fois l’ARN MR modifié de la membrane de la colonne de spin avec 40 microlitres d’eau sans nucléases, l’ARNm modifié généré par IVT doit être traité avec de la phosphatase pour éliminer cinq triphosphates primaires, ce qui peut conduire à une activation immunitaire.

Pour commencer cette procédure, ajoutez neuf microlitres de 10 tampons de réaction à la phosphatase de l’Antarctique à 79 microlitres d’une solution d’ARNm purifiée. Ensuite, ajoutez deux microlitres de phosphatase antarctique et mélangez doucement l’échantillon. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, purifiez le mélange réactionnel à l’aide d’un kit de purification d’ARN et diluez deux fois l’ARNm modifié de la membrane de la colonne de spin avec 50 microlitres d’eau sans nucléases. Après avoir mesuré la concentration de l’ARNm modifié, ajustez la concentration à 100 nanogrammes par microlitre en ajoutant de l’eau sans nucléases. Vérifiez la qualité de l’ARNm modifié synthétisé par électrophorèse sur gel d’ARN et visualisez l’échelle et les interdictions d’ARNm sur un illuminateur trans UV.

Une bande d’ARNm claire d’une longueur d’environ 1 100 paires de bases doit être détectée. Préparez les cellules HEC 2 9 3 pour la transfection avec l’ARNm modifié synthétisé en les plaquant deux fois. Centrez les cinq cellules par puits d’une plaque de 12 puits Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur de cellules Le lendemain, la cellule devrait avoir atteint 80 à 90 % de confluence.

Générer le lipoplexus pour la transfection. Préparez suffisamment de mélange de transfection pour que tous les puits soient transfectés, chaque puits d’une plaque de 12 puits nécessite 2,5 microgrammes d’ARNm modifié, deux microlitres de réactif de transfection lipidique et 473 microlitres d’option un. Réduire le sérum moyen.

Mélangez doucement les composants par pipetage comme contrôle négatif. Préparez un mélange de transfection sans Mr.NA, incubez les mélanges de transfection à température ambiante pendant 20 minutes pour générer des lipo plexes. Pour la transfection.

Lavez les cellules avec 500 microlitres de DPBS par. Eh bien, ajoutez 500 microlitres de mélange de transfection dans chaque puits de la plaque de 12 puits, incubez les cellules pendant quatre heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone après quatre heures, aspirez le mélange de transfection et ajoutez un millilitre de culture cellulaire complète. Moyen aux cellules dans chaque puits.

Incuber les cellules pendant 24 heures dans l’incubateur cellulaire. Par la suite, effectuer une analyse microscopique à fluorescence des cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence pour préparer les cellules à la cytométrie en flux. Retirez le milieu de culture cellulaire des puits et lavez chaque puits avec l’un des DPBS sans calcium ni magnésium.

Ajouter 500 microlitres de TRIPSIN EDTA par puits pour détacher les cellules de la surface des plaques de culture cellulaire. Par la suite, ajoutez 500 microlitres de solution neutralisante de trypsine par puits pour inactiver la centrifugeuse d’essai les cellules détachées pendant cinq minutes à 300 fois G à température ambiante. Après avoir retiré le supinate de Reese, suspendez le palais cellulaire dans 150 microlitres de solution de fixation cellulaire et transférez la suspension cellulaire dans un tube de cytométrie en flux.

Analysez le pourcentage de cellules exprimant l’EGFP et l’intensité de fluorescence à l’aide de la moyenne géométrique de l’intensité de fluorescence. L’expression des protéines au fil du temps est également évaluée par l’analyse par cytométrie en flux des cellules exprimant l’EGFP à un, deux et trois jours après la transfection, comme décrit dans le texte du protocole, la fonctionnalité de l’ARNm EGFP généré a été testée par transfection de cellules HEC 2 9 3. La production d’EGFP dans les cellules a été détectée 24 heures après la transfection à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Ici, une image de contraste du visage des cellules est affichée à côté d’une image de fluorescence des cellules. L’expression de l’EGFP dans les cellules a également été détectée par cytométrie en flux 24 heures après la transfection. La ligne rose représente les cellules sans ARNm, transfection, et la ligne bleue représente les cellules positives à l’EGFP.

Après transfection de l’ARNm EGFP, 93,91 % de toutes les cellules mesurées étaient positives et la moyenne géométrique de l’intensité de la fluorescence était de 720,16. La durée de l’expression de la protéine dans les cellules HC 2 93 a été évaluée en mesurant l’expression de l’EGFP un, deux et trois jours après l’ARNm. L’expression de la protéine de transfection était la plus élevée dans les cellules 24 heures après la transfection.

La quantité a été réduite de 1,6 fois chaque jour suivant, mais même après trois jours, les cellules contenaient EGFP Une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire de l’ARNm modifié stabilisé pour l’induction de l’expression protéique souhaitée dans les cellules.