Isolement et différenciation des cellules souches adipeuses de porcines sous-cutanée des tissus adipeux

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules souches dérivées du tissu adipeux à partir de tissus adipeux blancs sous-cutanés porcins afin d'évaluer leur capacité à se différencier en adipocytes, ostéocytes et chondrocytes mésenchymateux. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de la recherche sur l'obésité. C'est un bon outil pour découvrir les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation du développement du tissu adipeux.

Le principal avantage de cette technique est qu'un grand nombre de cellules stromavasculaires peut être récolté, permettant une analyse approfondie de la différenciation et de la biologie des adipocytes. L'implication de cette technique s'oriente vers la recherche sur la thérapie par cellules souches, car les cellules souches dérivées du tissu adipeux du porc présentent une multipotence leur permettant une transdifférenciation en plusieurs lignées cellulaires. Commencez par placer le porcelet en position prone sur une table chirurgicale propre.

Raser tous les poils le long de la ligne médiane du cou jusqu’à la queue, puis frictionner la peau dorsale avec de la bétadine (7,5 % de povidone-iodée) trois fois. Après la troisième friction, laisser l’iodée agir à la surface de la peau pendant environ 10 minutes. Ensuite, pulvériser la peau avec de l’éthanol à 70 %.

Et utilisez des compresses imbibées d'éthanol pour essuyer la peau dans un seul sens afin d'éliminer le désinfectant jusqu'à ce qu'aucune couleur visible ne soit observée. Ensuite, pratiquez une incision depuis la région du cou jusqu'à la jambe. Puis, tout en soulevant la graisse et la peau avec une pince, utilisez un scalpel pour séparer la couche graisseuse dorsale porcine des tissus adipeux sous-cutanés et la couche cutanée adjacente des muscles.

Immerger immédiatement le tissu cutané et adipeux dans un bécher stérilisé de 200 millilitres contenant du DMEM sans sérum, à 37 degrés Celsius, et vaporiser l'extérieur du bécher avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, placer le bécher dans une hotte de culture cellulaire à flux laminaire et disposer à côté du bécher une couverture en aluminium stérile, triple épaisseur, de 40 par 30 centimètres. Transférer le tissu, la peau vers le bas, sur la feuille d'aluminium.

Et utilisez une pince et des ciseaux pour retirer les tissus musculaires résiduels du tissu adipeux. Coupez la graisse en morceaux carrés de 7 sur 7 centimètres, puis transférez les morceaux de graisse dans un nouveau bécher stérilisé de 200 millilitres contenant du DMEM sans sérum, à 37 degrés Celsius. Placez maintenant un support de découpe personnalisé, équipé d'une lame en acier au carbone, sur la feuille de couverture et déposez un des morceaux de graisse sur le dispositif de découpe, la couche grasse tournée vers le bas.

Trancher la graisse en morceaux d'environ 1 millimètre d'épaisseur, en s'approchant au maximum de la peau sans la couper. Ensuite, utiliser des ciseaux pour hacher finement les morceaux de tissu adipeux, puis ajouter ces morceaux à un ballon Erlenmeyer de 250 millilitres contenant le milieu de digestion filtré enrichi en collagénase. Incuber le ballon sous agitation rotative pendant 90 minutes à 45 tr/min, dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius.

Lorsque le milieu de digestion devient une suspension sans agrégats tissulaires importants, arrêter la digestion en ajoutant un volume égal de milieu de culture contenant le DMEM F-12 avec 10 % de FBS. Pour recueillir les cellules souches dérivées du tissu adipeux du porc, filtrer la suspension de tissu adipeux digéré à travers une seule couche de mousseline dans un flacon stérilisé de 250 millilitres, en utilisant une pince pour appuyer au centre de la mousseline afin de guider et faciliter le passage du digest. Égoutter et tordre la mousseline à l’aide de la pince pour achever le passage et répartir le milieu dans quatre tubes coniques de centrifugation de 50 millilitres.

Recueillir les cellules stromales-vasculaires par centrifugation. Ensuite, retirer délicatement le surnageant sans perturber les culots afin d'éliminer la majeure partie de la couche lipidique supérieure contenant les adipocytes matures. Puis, resuspendre les culots dans 10 millilitres de DMEM à l'aide d'une pipette et en agitant doucement.

Centrifuger à nouveau les cellules et resuspendre les culots dans 10 millilitres de tampon de lyse ACK. Après sept minutes à température ambiante, arrêter la lyse des globules rouges par l'ajout de 10 millilitres de DMEM dans chaque tube, en agitant doucement les tubes pour homogénéiser. Puis, centrifuger à nouveau les cellules.

Laver les cellules deux fois supplémentaires avec 10 millilitres de DMEM, puis rassembler les surnageants à l’aide d’un tamis de 100 microns dans un tube conique unique de 50 millilitres. Prélever doucement la suspension cellulaire plusieurs fois au pipetteur afin de répartir uniformément les cellules, puis dénombrer les cellules par exclusion au bleu de Trypan. Enfin, semer les cellules souches adipeuses porcines à une densité de 6 fois 10 à la puissance 4 par centimètre carré dans un récipient de culture de taille appropriée contenant du milieu de culture cellulaire.

Et incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % CO2, afin de favoriser la formation d'une monocouche. La morphologie des cellules souches adipeuses porcines dérivées de la fraction stromale-vasculaire est similaire à celle des cellules souches adipeuses murines ou humaines, avec une morphologie étendue, semblable à de la fibre de verre, observée 24 heures après l'ensemencement. Les cellules souches adipeuses porcines deviennent confluentes en moins de 72 heures, moment auquel elles sont prêtes à subir une différenciation en adipocytes ou en d'autres types de cellules mésenchymateuses.

Ces cellules présentent également un fort potentiel adipogénique après induction chimique, et des adipocytes matures peuvent être observés après neuf jours de différenciation, plus de 90 % des cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux du porc montrant une différenciation adipogénique. Les marqueurs dits de surface des cellules souches mésenchymateuses, notamment CD 29, CD 44, CD 90 et MHC 1, sont fortement exprimés sur les cellules souches dérivées du tissu adipeux du porc, tandis que CD 4a, CD 31, CD 45 et MHC II sont à peine détectables, ce qui démontre que ces cellules souches dérivées du tissu adipeux du porc présentent des caractéristiques de type mésenchymateux, sans contamination significative par des cellules endothéliales ou des cellules souches hématopoïétiques. En outre, les cellules souches dérivées du tissu adipeux du porc différenciées peuvent être identifiées comme des adipocytes, des ostéocytes ou des chondrocytes à l’aide de colorants tissulaires spécifiques, démontrant ainsi que ces cellules issues de la fraction stromale-vasculaire conservent une pluripotence typique des progéniteurs de type mésenchymateux.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien respecter les règles d’asepsie en culture cellulaire et d’effectuer toutes les étapes le plus rapidement possible afin de maximiser la viabilité des cellules. Une fois la technique maîtrisée, les cellules peuvent être récupérées à partir de deux à trois porcs en six heures, si la procédure est correctement appliquée.

Cette technique standard a ouvert la voie aux chercheurs en obésité dans le domaine du diabète pour explorer les interrupteurs moléculaires, tels que les facteurs de transcription, qui contrôlent la différenciation des adipocytes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode d'isolement des cellules souches dérivées du tissu adipeux porcin et de l'évaluation de la pluripotence de ces cellules à se différencier en adipocytes, ostéocytes et chondrocytes.