Isolement et différenciation des cellules souches adipeuses de porcines sous-cutanée des tissus adipeux

Ce protocole décrit l’isolement de cellules souches dérivées du tissu adipeux de porc (pADSC) dans des tissus adipeux sous-cutanés avec examen de la multipotence. Les pADSC multipotents sont utilisés pour délimiter les processus de différenciation des adipocytes et étudier la transdifférenciation en plusieurs lignées cellulaires de mésenchyme mésodermique ou d’autres lignées d’ectoderme et d’endoderme pour des études régénératives.

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des cellules souches dérivées du tissu adipeux blanc sous-cutané porcin afin d’évaluer leur capacité à se différencier en adipocytes mésenchymateux, ostéocytes et chondrocytes. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de la recherche sur l’obésité. C’est un bon outil pour découvrir le mécanisme moléculaire impliqué dans la régulation du développement du tissu adipeux.

Le principal avantage de cette technique est qu’un nombre abondant de cellules stromovasculaires peut être récolté, ce qui permet une analyse approfondie de la différenciation et de la biologie des adipocytes. L’implication de cette technique est pour la recherche sur la thérapie par cellules souches, car les cellules souches dérivées du tissu adipeux de porc présentent une multipuissance pour la transdifférenciation en plusieurs lignées cellulaires. Commencez par coucher le porcelet en position couchée sur une table d’opération propre.

Rasez tous les poils sur la ligne médiane, du cou à la queue, et frottez la peau dorsale avec 7,5 % de povidone iodée trois fois. Après le troisième gommage, laissez l’iode reposer à la surface de la peau pendant environ 10 minutes. Ensuite, vaporisez la peau avec de l’éthanol à 70 %.

Et utilisez des tampons de gaze imbibés d’éthanol pour essuyer la peau dans une direction afin d’éliminer le désinfectant jusqu’à ce qu’aucune couleur évidente ne soit observée. Ensuite, faites une incision de la région du cou jusqu’à la jambe. Ensuite, en tenant la graisse et la peau avec une pince, utilisez un scalpel pour séparer la couche de graisse dorsale porcine des tissus adipeux sous-cutanés et la couche cutanée adjacente des muscles.

Immergez immédiatement la peau et les tissus adipeux dans un bécher stérilisé de 200 millilitres, contenant du DMEM sans sérum à 37 degrés Celsius et vaporisez l’extérieur du bécher avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, placez le bécher dans une hotte de culture cellulaire à flux laminaire et placez une couverture en aluminium stérilisé à trois couches de 40 x 30 centimètres à côté du bécher. Transférez le tissu, la peau vers le bas, sur la feuille.

Et utilisez des pinces et des ciseaux pour couper le tissu musculaire restant du tissu adipeux. Coupez la graisse en carrés de 7 x 7 centimètres, puis transférez-les dans un nouveau bécher stérilisé de 200 millilitres contenant du DMEM sans sérum à 37 degrés Celsius. Maintenant, placez un porte-tranche personnalisé, équipé d’une lame de trancheuse en acier au carbone sur la feuille de couverture et placez l’un des morceaux de graisse sur la trancheuse avec la couche de graisse vers le bas.

Coupez la graisse en morceaux d’environ 1 millimètre d’épaisseur aussi près que possible, mais sans couper la peau. Ensuite, à l’aide de ciseaux, émincez les morceaux de tissu adipeux aussi finement que possible et ajoutez-les dans un erlenmeyer de 250 millilitres contenant un milieu de digestion filtré complété par de la collagénase. Inclubez le ballon en le remuant pendant 90 minutes à 45 tr/min, dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius.

Lorsque le milieu de digestion devient une boue, sans amas de tissus significatifs, arrêtez la digestion avec un volume égal de milieu de culture contenant du DMEM F-12 avec 10 % de FBS. Pour collecter les cellules souches dérivées du tissu adipeux de porc, filtrez la suspension de tissu adipeux digérée à travers une seule couche de mousseline dans un flacon sérologique stérilisé de 250 millilitres, à l’aide d’une pince pour enfoncer le milieu de la mousseline, afin de guider et d’aider au passage de la digestion. Égouttez et tournez la mousseline avec la pince pour terminer le passage et répartissez le fluide dans quatre tubes à centrifuger coniques de 50 millilitres.

Collecter les cellules stromo-vasculaires par centrifugation. Ensuite, décampez le surnageant sans déranger les granules pour enlever la majeure partie de la couche graisseuse supérieure contenant les adipocytes matures. Ensuite, remettez les granulés en suspension dans 10 millilitres de DMEM avec pipetage et agitation douce.

Faites tourner à nouveau les cellules et remettez les granulés en suspension dans 10 millilitres de tampon de lyse ACK. Après sept minutes à température ambiante, arrêtez la lyisis des globules rouges en ajoutant 10 millilitres de DMEM dans chaque tube, en secouant doucement les tubes pour mélanger. Et puis, faites tourner à nouveau les cellules.

Lavez les cellules deux fois de plus avec 10 millilitres de DMEM, puis regroupez les surnageants à travers une passoire de 100 microns dans un seul tube conique de 50 millilitres. Pipetez doucement la suspension cellulaire plusieurs fois pour répartir uniformément les cellules et comptez les cellules par exclusion Trypan Blue. Enfin, ensemencez les cellules souches dérivées du tissu adipeux de porc à une densité de 6 fois 10 à 4 par centimètre carré dans le récipient de culture de taille appropriée dans un milieu de culture cellulaire.

Et incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2, pour faciliter la formation d’une monocouche. La morphologie des cellules souches dérivées de la fraction stromale-vasculaire dérivée du tissu adipeux de porc est similaire à celle des cellules souches dérivées du tissu adipeux de souris ou d’homme, avec une morphologie expansée semblable à celle de la fibre de verre observée 24 heures après l’ensemencement. Les cellules souches dérivées du tissu adipeux de porc deviennent confluentes dans les 72 heures, moment où elles sont prêtes pour la différenciation des adipocytes ou d’un autre type mésenchymateux.

Ces cellules présentent également un fort potentiel adipogénique après induction chimique et des adipocytes matures peuvent être observés après neuf jours de différenciation, avec plus de 90 % des cellules souches dérivées du tissu adipogène de porc présentant une différenciation adipogénique. Les marqueurs de surface des cellules souches mésenchymateuses, notamment CD 29, CD 44, CD 90 et CMH 1, sont fortement exprimés sur les cellules souches dérivées du tissu adipeux de porc, tandis que les cellules souches CD 4a, CD 31, CD 45 et CMH II sont à peine détectables, ce qui démontre que ces cellules souches dérivées du tissu adipeux de porc présentent des caractéristiques de type mésenchymateux sans contamination significative des cellules souches endothéliales ou hématopoïétiques. De plus, les cellules souches différenciées dérivées du tissu adipeux de porc peuvent être identifiées comme des adipocytes, des ostéocytes ou des chondrocytes, grâce à l’utilisation de colorants tissulaires spécifiques, démontrant que ces cellules dérivées de fractions stromales-vasculaires conservent une multipotence typique des progéniteurs de type mésenchymateux.

Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler d’avoir une bonne technique d’asepsie pour la culture cellulaire et d’effectuer toutes les étapes le plus rapidement possible. Pour maximiser la viabilité des cellules. Une fois maîtrisées, les cellules peuvent être récoltées sur deux à trois porcs en six heures, si la technique est correctement exécutée.

Cette technique standard a ouvert la voie aux chercheurs sur l’obésité dans le domaine du diabète pour explorer les commutateurs moléculaires, tels que les facteurs de transcription qui contrôlent la différenciation des adipocytes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules souches dérivées du tissu adipeux de porc et d’évaluer la multicapacité de ces cellules à se différencier en adipocytes, ostéocytes et chondrocytes.