Xenopus Ovocytes: Méthodes optimisées pour microinjection, suppression des couches de cellules folliculaires, et les changements de solution rapide dans les expériences électrophysiologiques

L’objectif global de cette procédure est d’exprimer de nouvelles protéines, telles que les canaux ioniques dans les ovocytes de xénope. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans n’importe quel domaine qui nécessite un système d’expression fonctionnel. Les principaux avantages des variantes de cette technique sont la rapidité, la fiabilité et l’amélioration de la survie des ovocytes.

Cette méthode peut donner un aperçu du fonctionnement des canaux ioniques. De plus, il peut être appliqué à l’étude de toute autre protéine. Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons réalisé que les méthodes classiques permettaient d’obtenir un faible taux de survie des ovocytes.

Après avoir retiré les lobes des ovaires des grenouilles femelles conformément au protocole de texte, placez les lobes dans une solution de Barth modifiée stérile complétée par de la pénicilline et de la streptomycine. Coupez les lobes pour permettre l’accès des tissus à l’oxygène. Pour isoler les follicules de stade cinq à six, utilisez des pinces pour tenir l’ovaire, puis abaissez une boucle de platine sur les follicules et retirez doucement la boucle pour perturber le tissu conjonctif avec le follicule du tissu ovarien.

Triez les ovocytes d’apparence saine à l’aide de la boucle de platine. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, l’embout est coupé à un diamètre de 1,5 millimètre, pour transférer les follicules sélectionnés dans une boîte de Pétri de 35 millimètres de diamètre. Après avoir préparé les ARNc pour le récepteur GABA A et les pipettes de micro-injection selon le protocole de texte, utilisez de l’huile de paraffine et une seringue de 10 millilitres avec une aiguille fine pour remplir une pipette de micro-injection.

Montez ensuite la pipette sur un appareil de micro-injection fait maison. À l’aide d’une pipette munie d’un embout en plastique stérile, placez une gouttelette de solution d’ARNm sur le côté propre d’un morceau de thermoplastique résistant à l’humidité. Plongez ensuite l’extrémité de la pipette d’injection dans la gouttelette et allumez le moteur pour rétracter le piston.

La solution d’ARNm doit entrer dans la pipette et former une interface visible avec l’huile. Ensuite, rétractez l’extrémité de la pipette de la gouttelette et appliquez une pression positive à l’intérieur de la pipette d’injection. Une gouttelette de solution d’ARNm doit se former à l’extrémité de la pipette d’injection.

À l’aide d’une boîte de Pétri de 60 millimètres avec un maillage en nylon collé au fond et recouverte de MBS pour injection, alignez les follicules avec leurs pôles végétaux pointant vers le haut. À l’aide du micromanipulateur, positionnez la pipette d’injection sur un follicule individuel. Insérez l’aiguille d’injection au centre du pôle végétal et appliquez une pression positive à l’intérieur de la pipette pour injecter 50 nanolitres d’ARNm à un débit de 0,6 microlitre par minute.

Attendez cinq à 10 secondes avant de retirer l’embout de la pipette d’injection du follicule pour éviter que l’ARN messager ne s’échappe. Transférez les follicules injectés dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de deux millilitres de MBS. Placez le plat dans un refroidisseur à vin réglé à 18 degrés Celsius.

Incuber les follicules injectés pendant un à sept jours avant l’enregistrement, en fonction de l’identité de la protéine nouvellement exprimée. Pour décaper les follicules, transférez dix follicules injectés dans un tube en verre borosilicaté contenant 0,5 millilitre de MBS, un milligramme par millilitre de collagénase et 0,1 milligramme par millilitre d’inhibiteur de la trypsine. Plongez le tube dans un bain-marie à 36 degrés Celsius et incubez les follicules pendant 20 minutes.

La température ici est critique car un degré de plus peut tuer les ovocytes. Rincez les follicules en les transférant dans un second tube contenant un millilitre de MBS à température ambiante, et laissez-les dans le tube pendant une dizaine de secondes. Transférez ensuite les follicules dans un troisième tube contenant 0,5 millilitre de MBS doublement concentré contenant quatre millimolaires d’EGTA, et incubez les échantillons à température ambiante pendant quatre minutes, en secouant de temps en temps les tubes.

Le temps d’incubation de quatre minutes est essentiel pour s’assurer que les couches folliculaires se détachent de l’ovocyte. Rincez les follicules en les transférant dans un autre tube contenant un millilitre de MBS à température ambiante, et laissez-les dans le tube pendant environ 10 secondes. Transférez les ovocytes dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant deux millilitres de MBS.

Ensuite, sous un stéréomicroscope, utilisez une boucle de platine pour séparer les enveloppes externes des follicules en repoussant simplement l’ovocyte nu. Conservez les ovocytes dénudés jusqu’à utilisation. Dans cette expérience, des ovocytes de xénope isolés mécaniquement ont été micro-injectés avec un revêtement d’ARNm pour les sous-unités du récepteur GABA A.

Ensuite, les couches de cellules folliculaires ont été retirées. Les ovocytes ont été serrés à moins 80 millivolts et exposés à des concentrations croissantes de GABA et à la présence de THDOC, un puissant modulateur allostérique positif du récepteur GABA A. Ce panneau montre les amplitudes de courant induites en fonction des concentrations de GABA, indiquant la sensibilité de cette combinaison de sous-unités envers le GABA.

L’équation utilisée était I(c)Imax/n)où c est la concentration de GABA, la CE50 est la concentration de GABA en présence d’un THDOC micromolaire, provoquant une amplitude de courant demi-maximale. Imax est l’amplitude maximale du courant. I est l’amplitude du courant et n est le coefficient de Hill.

La CE50 du récepteur alpha quatre bêta deux delta GABA A s’élevait à 0,41 0,12 micromolaire et n était de 0,76 0,04 Une fois maîtrisées, les couches de cellules folliculaires peuvent être éliminées en une demi-heure si elles sont effectuées correctement. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour améliorer la procédure d’expression des protéines dans les ovocytes de xénope. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les ovocytes de xénope entourés de couches de cellules folliculaires, leur micro-injection d’ARNm et l’élimination ultérieure des couches de cellules folliculaires.