宫内电穿孔诱导小鼠大脑皮质中氧合酶的重组

该程序的总体目标是通过子宫内电穿孔诱导 Cre-Lox 重组，在小鼠大脑皮层中产生遗传马赛克。这种生成遗传镶嵌的方法可以帮助回答神经生物学中的关键问题。例如以细胞自主方式确定给定神经元表型是否需要基因。

该技术的主要优点是有效的 Cre-Lox 重组系统与子宫电穿孔中同样有效的基因递送技术相结合。虽然这种方法侧重于靶向第 2-3 层皮层神经元，但它可用于靶向其他皮层深度的神经元。当我们试图在脑组织中制作基因马赛克时，我们在让实验动物出生后存活时遇到了几个问题，因此我们对我们的技术进行了一些简化和改进。

首先将玻璃毛细管插入移液器拉拔器，准备一个具有非常长锥度和非常细尖端的移液器，典型的用于胚胎干细胞注射或核转移的移液器。拧紧夹子后，激活程序以拉动协议，在玻璃毛细管上创建一个锥形。使用复合光学显微镜确保锥度长度在 10 到 15 毫米之间。

接下来，要打破移液器中心的尖端，请在 50 mL 烧杯上擦拭单层任务，然后用一只手将其拉紧。用另一只手，将拉出的移液器锥度面向下，垂直穿过湿巾的中心，使锥度彻底断裂。在复合光学显微镜下检查开口的大小。

然后通过将 1 mcL 的 0.4%台盼蓝和 PBS 吸入部分填充的移液器中来校准移液器，并根据移液器中 1 mcL 的高度用 1-mcL 标记刻度移液器。丢弃前，使用校准的移液器将其他拉出的移液器刻度。将移液器放入移液器支架中，避免灰尘和其他颗粒。

在 E-15.5 深度麻醉怀孕的小鼠后，通过轻轻倾斜感应室并注意小鼠的反应来测试扶正反射。如果没有扶正反射，将鼠标转移到手术准备区域，并通过鼻锥施用吸入的异氟醚，以维持手术麻醉平面。使用镊子测试踏板反射以验证麻醉。

努力监测呼吸频率，寻找深而规律的呼吸，以及粘膜呈粉红色且湿润。在眼睛上涂抹足够的兽用眼药膏，使其完全覆盖，以防止干燥。用棉签将脱毛膏按摩到腹部区域，直到腹部皮毛溶解。

然后擦去腹部的皮毛。用 70% 乙醇和棉签小心清理任何残留的残留物和脱毛霜。以圆周运动将碘基磨砂膏涂抹在腹部区域。

然后使用手术单隔离手术区域并保持无菌状态。在皮肤上做一个 2 厘米的腹侧中线切口后，找到白线以观察腹直肌的中线。将肌肉向上拉离腹部，并使用无菌技术做一个 2 厘米的中线切口，露出腹腔。

使用无菌的 10 mcL 微量移液器吸头，将卡洛芬分配到腹腔中以进行镇痛。接下来，将一把 Hartmann 蚊子镊子夹在腹直肌切口的左边缘。将镊子放在切口左侧翻转的培养皿上，保持切口左侧开放。

以类似的方式夹住切口的右侧后，将纱布海绵放在切口区域周围。使用没有连接限位螺钉的环形镊子，拉动任意两个相邻胚胎之间的子宫，而不会压碎或伤害任何组织。开始通过切口拉出所有胚胎，将它们放在纱布海绵上。

将校准的移液器连接到抽吸管组件，并将通过子宫壁制备的 1 mcL DNA 溶液精确注入每个胚胎的侧脑室。用拇指和食指作胚胎，在注射过程中让胚胎轻轻地推向子宫壁。侧脑室在胚胎的端脑背侧表现为两个较暗的斑块。

通过观察台盼蓝填充侧脑室来确认注射成功。注射所有胚胎后，将镊子型电极的阴极放在子宫上，直接放在内侧和尾部皮层上，以瞄准视觉皮层。将阳极放在胚胎头部的下方和前方。

使用脚踏板触发 50 伏特的 550 毫秒脉冲的传输，间隔为 950 毫秒。对所有胚胎进行电穿孔后，将子宫以与发现时相同的方向放回腹腔。使用盐水润滑子宫，同时手动极其轻柔地引导子宫，注意不要将胚胎从子宫中的位置移位。

用可吸收缝合线闭合腹部肌肉。使用简单的间断针法，用外科医生的结打结。用可吸收缝合线闭合皮肤层。

涂抹少量组织粘合剂以密封伤口。将组织粘合剂涂在结上以防止解开。使用微量移液器去除伤口周围可抽吸的任何组织粘合剂。

组织粘合剂干燥后，将动物从异氟醚中取出，让雌性在温暖的笼子中单独恢复。继续监视鼠标，直到它完全恢复并正常运行。取出后，将雌性与雄性一起放回笼子中。

将头骨放在平坦的表面上，用 1-x PBS 湿润的单层任务湿巾。首先使用镊子去除枕骨。然后小心地去除顶骨，将镊子从大脑表面取出。

小心去除任何脑膜，以防止损伤皮质。将镊子的后部沿颅骨楔入大脑下方，以切断任何颅神经并切除大脑。使用单刃剃须刀片在喙部约 0.5 毫米处进行冠状切割，在尾部约 0.5 毫米处切开感兴趣组织。

组织块现在可以进行切片了。注射 1 mcL 的 2 mg/mL GFP Cre 导致标记细胞稀疏分布，其中一些可能是明亮的。因为组织被切成 100 微米，所以大部分树突状乔木被保留下来。

当在胚胎第 15.5 天进行宫内电穿孔时，标记发生在皮质第 2 层和第 3 层。树突棘可以在高放大倍率下观察到。注射 1.5 mcL 的 2 mg/mL GFP Cre 会导致非常密集的标记，这可能是次优的，因为很难追踪神经突和树突棘的来源。

然而，通过在标记区域的外围选择一个明亮的细胞，仍然可以对神经元及其过程进行成像。或者，注射 SuperNova 构建体导致标记非常明亮的第 2-3 层神经元的稀疏分布。一旦掌握，如果作得当，子宫内电穿孔手术将花费不到 30 分钟。

在尝试使用其他 DNA 构建体进行此过程时，请务必记住尝试不同的浓度和体积，这将有助于实现嵌合分析所需的标记稀疏性。我们的代表性结果使用了单个构建体或最近发明的 SuperNova 构建体。在后者中，我们发现我们可以实现出色的稀疏标记，同时最大限度地提高神经元的亮度。

这项技术可以适应以其他方式创建马赛克脑组织。例如，CRISPR 和 Cas9 基因编辑可以与宫内电穿孔相结合，或者 Cre-Lox 重组可以与脑室内注射病毒载体相结合。看完这个视频，你应该对用于实现稀疏遗传镶嵌的几种简化和细化的技术有很好的了解，这样你就可以把Cre-Lox重组和子宫内电穿孔结合起来。

我们祝您好运。