Isolation de Immunomagnetic rapide et spécifique de souris primaire Oligodendrocytes

L’objectif global de cette technique est d’utiliser l’isolement immunomagnétique pour sélectionner des oligodendrocytes positifs à l’O4 de souris nouveau-nées pour leur analyse en culture in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des sciences neuronales liées à l’étude des maladies qui affectent la myéline et la myélinisation. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite la préparation de la culture finale d’oligodendrocytes d’une pureté supérieure à 80 % en heures environ.

Commencez par utiliser de petits ciseaux à dissection pour couper la peau le long de la ligne médiane du cuir chevelu d’une souris d’un jour postnatal de cinq à sept jours. Rétractez le rabat cutané pour exposer le crâne et coupez soigneusement le crâne le long de la ligne médiane, de l’ouverture à l’arrière vers la zone frontale. À partir de l’ouverture à l’arrière du crâne, coupez vers chaque orbite le long de la base de l’os et utilisez des pinces fines pour éloigner doucement les cortex du mésencéphale.

Ensuite, transférez les cortex dans une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres contenant sept millilitres de milieu neurobasal A B-27. Lorsque tous les cerveaux ont été collectés, transférez les cortex dans une nouvelle boîte de culture tissulaire de 60 millimètres contenant cinq millilitres de tampon de dissociation, et utilisez une lame de scalpel numéro 15 pour couper les cortex en un morceau d’un millimètre cube. Incuber les morceaux de cerveau dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 20 minutes.

Ensuite, ajoutez un millilitre de sérum de croissance bovine pour arrêter la réaction enzymatique. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, transférez la boue tissulaire dans un tube conique de 15 millilitres et dissociez doucement le tissu cérébral six à huit fois avec le pipetage. Laissez les morceaux de tissu dissociés se déposer pendant deux à trois minutes.

Ensuite, transférez le surnageant dans un tube frais. Ensuite, ajoutez trois millilitres de milieu neurobasal A, complété par du sérum de croissance bovine et de la DNase I dans les tissus, et utilisez une pipette de cinq millilitres pour dissocier doucement les tissus avec plus de pipetage. Vous voyez, la force de pipetage appropriée est cruciale pour garantir un rendement élevé de cellules viables.

Si le pipetage est trop dur, la viabilité peut être faible. En revanche, si le pipetage est trop doux, le rendement cellulaire peut être faible. Laissez les morceaux de tissu reposer pendant encore deux à trois minutes.

Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube et ajoutez trois millilitres de milieu neurobasal A frais, complété par du sérum de croissance bovine et de la DNase I dans le tissu. Dissociez doucement le tissu cérébral à l’aide d’une pointe de pipette P-1000 jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gros morceau de tissu, en prenant soin d’éviter les bulles. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, filtrez la solution cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres, et portez le volume final de la suspension unicellulaire à 30 millilitres avec du milieu neurobasal A frais, complété par du sérum de croissance bovine et de la DNase I. Divisez la suspension cellulaire en deux tubes coniques de 15 millilitres, et granuler les cellules neurales par centrifugation.

Retirez tous les cinq à 10 derniers microlitres de surnageant trouble et ajoutez trois millilitres de milieu neurobasal A complété par du sérum de croissance bovine aux cellules. Remettez soigneusement les cellules en suspension et portez le volume final à 15 millilitres avec du milieu neurobasal A frais contenant 10 % de sérum de croissance bovine. Filtrez la solution cellulaire à travers une passoire cellulaire de 40 microns dans un nouveau tube conique de 50 millilitres, et portez le volume final à 30 millilitres avec du milieu neurobasal A frais contenant 10 % de sérum de croissance bovine.

Ensuite, divisez la suspension cellulaire filtrée entre deux tubes coniques de 15 millilitres pour la centrifugation. et remettez les granulés en suspension dans 2,5 millilitres de tampon de tri de cellules magnétiques glacé avant de regrouper les cellules. Après avoir compté, centrifugez à nouveau les cellules et remettez la pastille en suspension dans 90 microlitres de tampon de tri de cellules magnétiques frais par une fois 10 aux sept cellules.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres de billes anti-04 par fois 10 aux sept cellules et mélangez la solution cellulaire en effleurant doucement. Après 15 minutes à quatre degrés Celsius avec un léger effleurement toutes les cinq minutes, ajoutez doucement deux millilitres de tampon de tri cellulaire magnétique tous les 10 fois 10 aux sept cellules pour un lavage par centrifugation, et jetez le surnageant par aspiration sous vide soigneuse. Remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon de tri de cellules magnétiques fraîches pour chaque fois 10 à sept cellules, et placez une colonne de tri de billes magnétiques de taille appropriée dans son séparateur magnétique correspondant.

Placez une passoire de 40 microns sur la colonne et pré-rincez la crépine avec trois millilitres de tampon de tri de cellules magnétiques, en laissant le tampon traverser la colonne sans laisser la colonne sécher. Ajoutez les cellules dans la passoire, puis effectuez un lavage d’un millilitre avec un tampon de tri de cellules magnétique. Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon de tri cellulaire magnétique par lavage, et une fois avec un milieu de prolifération d’oligodendrocytes.

Ensuite, transférez la colonne dans un tube de 15 millilitres et utilisez le piston pour rincer immédiatement cinq millilitres de milieu de prolifération d’oligodendrocytes frais à travers la colonne. Après le comptage, diluez les cellules à une densité de placage appropriée et remplacez la laminine des lamelles de recouvrement pré-enrobées dans une plaque à 24 puits avec 100 microlitres de milieu de prolifération des oligodendrocytes. Incuber les oligodendrocytes à 37 degrés Celsius et à 5 % de CO2 pendant 45 minutes au maximum pour favoriser l’adhésion des oligodendrocytes aux lamelles.

Ensuite, inondez chaque puits de la plaque de 24 puits avec 500 microlitres de milieu de prolifération des oligodendrocytes pour une incubation de 24 heures. Le lendemain, remplacez les surnageants par un milieu de différenciation des oligodendrocytes et retournez les cellules dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la fixation. 24 heures après le placage, les cellules semblent être bipolaires ou tripolaires sous microscopie à contraste de phase, une caractéristique des oligodendrocytes proliférants à un stade précoce.

La coloration par immunofluorescence montre que 24 heures après le placage, la majorité de ces pré-oligodendrocytes présentent également un marquage NG2 et O4, tandis que le marquage avec GFAP et l’anticorps anti-01 est beaucoup moins fréquent, suggérant que la majorité des cellules à ce stade sont des pré-oligodendrocytes avec peu d’oligodendrocytes immatures ou matures. À 72 heures, la morphologie des oligodendrocytes semble être plus complexe qu’à 24 heures, et il y a une fréquence beaucoup plus faible de cellules positives pour le marqueur précoce des oligodendrocytes, NG2. De plus, la plupart des cellules présentent un marquage O4, et près de la moitié des cellules ont été colorées pour l’anticorps 01 à ce stade, ce qui suggère que les cellules se différencient en un phénotype plus mature.

Notamment, la présence d’astrocytes reste extrêmement faible. Ces résultats indiquent qu’au fil du temps, les oligodendrocytes isolés immunomagnétiquement sont capables de se différencier in vitro jusqu’au troisième stade de maturation avec très peu de contamination d’autres types de cellules, tels que les astrocytes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les oligodendrocytes primaires des bébés souris nouveau-nés en utilisant l’isolement immunomagnétique.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures, si elle est exécutée correctement. Merci d’avoir regardé. Bonne chance dans vos expériences.