Weitfeld-Einzelphotonen optische Aufnahme in Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff

Die optische Aufnahmemethode mit spannungsempfindlichem Farbstoff gilt als ideale Technologie, um die Funktionsweise des Gehirns zu visualisieren. Diese Methode ermöglichte es uns, eine neuropsychische Dynamik stabil und zuverlässig über 12 Stunden aufzuzeichnen, da wir einen Blick auf die psychische Aktivität erhielten. Wir versuchen, die Anwendung zu erweitern, um Schaltungsänderungen zu erkennen, die durch Chemikalien auf der gesamten Entwicklungsstufe verursacht werden, wie z. B. wertvolle Säureanwendung bei Müttern.

Die Technik ist bereits etabliert. Bitte versuchen Sie, Studien zu reproduzieren, indem Sie die hier vorgestellte Methode befolgen. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauchen Sie den enthaupteten Kopf in eiskalte ACSF in einem chirurgischen Tablett aus Edelstahl ein.

Extrahieren Sie das Gehirn innerhalb einer Minute und legen Sie es in einem Becher mit gekühltem ACSF für fünf Minuten. Als nächstes teilen Sie den Gehirnabschnitt an der Mittellinie mit einem Skalpell und legen Sie beide Hemisphären auf einen 4%Agar-Block. Legen Sie dann den Hirnblock mit beiden Hemisphären auf einen 4%Agar-Block.

Wischen Sie den überschüssigen ACSF mit einem Filterpapier aus dem Block. Anschließend Superkleber auf die Vibratome-Plattform auftragen. Legen Sie den Agarblock darauf und wischen Sie den übermäßigen Klebstoff mit einem Filterpapier ab.

Tragen Sie vorsichtig eine kleine Menge eiskalten ACSF von der Oberseite des Gehirnagarblocks auf, um überschüssigen Superkleber zu festigen und zu verhindern, dass der Kleber das Gehirn bedeckt und das Schneiden stört. Befestigen Sie anschließend die Plattform am Vibramtablett und gießen Sie den modifizierten ACSF. Stellen Sie das Vibratom auf eine langsame Geschwindigkeit ein und haben Sie die Klingenfrequenz bei ihrer maximalen Einstellung.

Dann beginnen Sie zu schneiden. Legen Sie die Scheiben in der Ecke der Scheibenkammer nacheinander, damit die Reihenfolge der Scheiben leicht unterschieden werden kann. Normalerweise können drei bis fünf Scheiben aus einer Hemisphäre gewonnen werden.

Als nächstes schneiden Sie den Hirnstammteil mit einer 30-Meter-Nadel ab. Mit einem kleinen gekippten Pinsel die Scheibe auf den Membranfilter legen, der mit einem Plexiglasring gehalten wird. Legen Sie den Ring in eine feuchte Rückgewinnungskammer und sichern Sie die Abdeckung, um den Innendruck hoch zu halten.

Wenn Sie die Scheibe auf den Membranfilter legen, passen Sie die Richtung und Position der Scheibe innerhalb des Rings an, um sicherzustellen, dass sie gut zentriert ist und eine konsistente Richtung hat. Lassen Sie die Probe bei 28 Grad Celsius für 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur für mindestens 10 bis 30 Minuten für die Erholung. Um die Scheiben zu färben, tragen Sie 100 Mikroliter der Färbelösung vorsichtig auf jede Scheibe auf und brüten bei 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Als nächstes bereiten Sie 50 bis 100 Milliliter ACSF in einem Behälter vor. Legen Sie den Ring mit der Probe darin, um die Färbelösung zu spülen. Dann übertragen Sie die vorgespülten Scheiben in eine andere Inkubationskammer.

Warten Sie mehr als eine Stunde auf die Wiederherstellung vor dem Experiment. Um mit diesem Vorgang zu beginnen, schalten Sie den Verstärker, den Computer und das Kamerasystem ein, und öffnen Sie die Software. ACSF in ein 50-Milliliter-Rohr gießen und mit Carbogen blasen.

Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, um den ACSF zu zirkulieren und den Durchfluss auf etwa einen Milliliter pro Minute einzustellen. Passen Sie dann die Höhe der Saugpipette so an, dass der Flüssigkeitsstand in der Experimentierkammer immer konstant ist. Legen Sie die Masseelektrode in die Kammer.

Anschließend die Glaselektrode mit einer kleinen Menge ACSF füllen und in den Elektrodenhalter legen. Befestigen Sie den Halter an der Stange des Manipulators. Achten Sie mit einem Verstärker darauf, dass der Elektrodenwiderstand etwa ein Megaohm beträgt.

Übertragen Sie in der Aufnahmesitzung eine Scheibe aus der feuchten Kammer in eine Versuchskammer. Drücken Sie die Kante des Rings fest in den Silikon-O-Ring. Achten Sie darauf, die Membran oder den Boden der Experimentierkammer nicht zu brechen.

Unter dem Mikroskop legen Sie die Spitze der stimulierenden Elektrode und die Feldpotential-Aufnahmeelektrode auf die Scheibe. Überprüfen Sie die evozierte Antwort, indem Sie einen Stimulus bereitstellen. Vergewissern Sie sich, dass das Sichtfeld den richtigen neuronalen Schaltkreis im optischen Aufzeichnungssystem abdeckt.

Passen Sie als Nächstes die Anregungslichtintensität auf ca. 70 bis 80 % der maximalen Kapazität an der Kamera an. Passen Sie mit der Fluoreszenzlichtquelle den Fokus mit dem Erfassungssystem an. Starten Sie dann die Aufzeichnung und analysieren Sie die Daten in einer Bildaufnahmesoftware nach der Erfassung.

Diese Abbildung zeigt das repräsentative optische Signal bei elektrischer Stimulation des Schaffer-Collaterols im Bereich CA1 einer Maus-Hippocampusscheibe. Diese aufeinanderfolgenden Bilder zeigen das optische Signal, bevor räumliche und zeitliche Filter angewendet wurden, während diese Bilder die gleichen Daten zeigen, nachdem sie zweimal einen fünf mal fünf kubischen Filter angewendet haben. Aufgrund der hohen Bildrate und der hohen räumlichen Auflösung änderte die Anwendung des Filters das Signal nicht, sondern filterte das Rauschen heraus, das auch im in Pixel aufgezeichneten Zeitverlauf in einer einzigen Versuchsstudie beobachtet werden kann.

Hier ist der Vergleich der typischen Antworten im Bereich CA1 der Hippocampus-Scheiben zwischen Maus und Ratte. Die kleine hyperpolarisierende Reaktion wird in der distalen Seite des CA1 nach 24 Millisekunden in der Maus Hippocampus-Scheibe beobachtet, aber massivere hyperpolarisierende Reaktion überholt die depolarisierende Reaktion in der Ratte Hippocampal-Scheibe. Sobald die Scheiben gefärbt sind, sollten sie über 12 Stunden dauern und Sie können andere elektrophysiologische Aufnahmen auf ihnen durchführen.