Name: Isoler les cellules épithéliales bronchiques du tissu pulmonaire réséqué pour les biobanques et établir des cultures d’interface air-liquide bien différenciées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Apprenez à isoler des cellules épithéliales bronchiques à partir de tissu pulmonaire humain pour établir des cultures d'interface air-liquide bien différenciées. Cette méthode robuste et économique permet d'étudier la fonction épithéliale dans la santé et la maladie.

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Les études utilisant le modèle décrit dans cette contribution ont été soutenues par divers organismes de financement, notamment la Lung Foundation Netherlands, l’Organisation néerlandaise pour la recherche et le développement en santé (ZonMw, subvention COVID-19 MKMD), la Société néerlandaise pour le remplacement des tests sur les animaux (Stichting Proefdiervrij, subvention #114025007), ainsi que des subventions de recherche d’entreprises comme Boehringer Ingelheim et Galapagos. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflits d’intérêts pertinents.

Le protocole présenté ici décrit l’isolement de cellules épithéliales bronchiques humaines à partir de tissu pulmonaire réséqué, une méthode pour l’expansion optimale des cellules sans perte de potentiel de différenciation, une procédure de cryoconservation et une procédure pour générer des cultures ALI-PBEC bien différenciées. En outre, une description du contrôle de la qualité est fournie, ainsi que des instructions pour le suivi et l’évaluation des ALI-PBEC différenciées.
Le protocole décrit commence par un anneau bronchique macroscopiquement normal, exempt de tumeur, qui est réséqué à partir d’un lobe pulmonaire de patients subissant une intervention chirurgicale liée à leur diagnostic de cancer du poumon. Il convient donc de noter que ces anneaux ne peuvent strictement pas être considérés comme des tissus sains, ce qui peut donc affecter les caractéristiques de la culture cellulaire. Les sources alternatives pour obtenir des cellules épithéliales bronchiques comprennent l’utilisation de biopsies bronchiques, de brossages bronchiques ou de tissus provenant de poumons de donneurs ou de receveurs de greffe. Quelle que soit la source, lors de l’utilisation de tissu pulmonaire, un risque de contamination microbienne doit être pris en compte et, par conséquent, des antibiotiques sont utilisés dans les différents milieux de culture pour réduire le risque de contamination microbienne de la culture cellulaire. En particulier, les mycoplasmes présentent un risque élevé et courant en culture cellulaire, en raison de sa grande variété d’effets sur la culture cellulaire, de sa résistance aux antibiotiques couramment utilisés en culture cellulaire et du fait que la contamination par les mycoplasmes ne peut être confirmée que par des tests de détection des mycoplasmes. Par conséquent, au stade initial de la culture cellulaire après l’isolement des cellules du tissu pulmonaire, la formulation antimicrobienne à large spectre Primocin est utilisée et, au cours du processus de culture, des échantillons sélectionnés au hasard sont testés pour détecter la présence de mycoplasmes.
La procédure d’isolement commençant par un anneau bronchique fournit suffisamment de matériel de départ pour permettre le degré d’expansion de ces cellules primaires nécessaire pour démarrer les cultures à l’ALI sans compromettre la capacité de différenciation. Cependant, le démarrage de l’expansion des cellules épithéliales isolées avec un nombre limité de cellules peut poser des problèmes pour obtenir un nombre suffisant d’inserts avec suffisamment de cellules pouvant être ensemencées pour la culture ALI. Une culture prolongée et le passage répété de cellules primaires peuvent entraîner une sénescence réplicative. Diverses solutions ont été proposées pour surmonter cette limitation. Horani et al. ont montré que l’inhibiteur de la Rhokinase (ROCK) Y-27632 augmentait la prolifération des cellules basales30, Mou et al. ont utilisé une double inhibition de Smad pour développer les cellules souches basales tout en maintenant les caractéristiques de la couche de cellules épithéliales différenciées 31, et Sachs et al. ont développé un système organoïde des voies respiratoires qui peut être utilisé pour dilater les cellules épithéliales des voies respiratoires et maintenir leur potentiel de différenciation au cours de multiples passages32. Cette dernière méthode a également été utilisée pour développer les cellules à partir de sources à très faible nombre de cellules, telles que les aspirations trachéales (AT) de nouveau-nés prématurés (âge de gestation &lt;28 semaines) et le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BAL), avant transfert vers la culture ALI comme décrit ici33. Il a été constaté que les cellules isolées de BAL et TA présentaient une capacité de différenciation similaire aux cellules générées à partir du tissu bronchique, bien que des différences aient été observées lorsque la différenciation était biaisée vers des cultures contenant plus de cellules calicinées ou plus caliciformes utilisant l’inhibition de la signalisation Notch ou la cytokine Th2 IL-1333. Il est donc recommandé, si les ALI-PBEC sont cultivés à partir d’une matière première avec un faible nombre de cellules épithéliales en utilisant des approches similaires, de toujours vérifier les cultures pour les critères de qualité de base, comme indiqué à la section 6 du protocole. Il est important de noter que l’utilisation de cellules nourricières peut également aider à obtenir un plus grand nombre de cellules, ce qui est essentiel dans un contexte d’ingénierie d’échafaudage transplantable où le temps et le nombre de cellules sont essentiels. Ceci est illustré par une étude dans laquelle des cellules épithéliales autologues ont été cultivées à partir de biopsies dérivées d’un patient atteint d’une maladie trachéale et les cellules ont été rapidement dilatées en présence d’une couche nourricière embryonnaire murine (fibroblastes 3T3-J2 inactivés mitotiquement) et de l’inhibiteur susmentionné de la voie Rho/ROCK (Y-27632)34. La culture cellulaire résultante s’est avérée utile pour le repeuplement des échafaudages trachéaux, et cela pourrait donc être considéré comme un protocole approprié pour un modèle de transplantation.
Lors de l’utilisation du protocole décrit dans cette contribution, mais aussi lors de l’utilisation d’autres protocoles de culture, inévitablement un biais de sélection est introduit. Il est important de réaliser que les différences dans les détails du protocole, tels que l’origine des cellules utilisées pour initier les cultures, la composition du milieu et d’autres détails du protocole, peuvent entraîner des changements dans la composition cellulaire des cultures et, par conséquent, des changements dans la réponse de la culture ALI33,35. En outre, des différences dans les propriétés cellulaires ont également été observées lors de la comparaison de différents milieux pour différencier les cellules des voies respiratoires10,11. En comparant PneumaCult et le milieu cBD, des différences ont été observées dans les marqueurs d’ARNm des cellules caliciformes et des cellules club, les valeurs TEER et l’épaisseur de la couche cellulaire. Sur la base de ces observations, malgré l’absence de fondement statistique, en raison du faible nombre de donneurs utilisés, de la composition du milieu est inconnue des clients et des coûts plus élevés du milieu PneumaCult, la décision a été prise dans notre laboratoire d’utiliser le milieu cBD.
Comme nous l’avons vu, les cellules peuvent être initialement étendues à l’aide d’une culture organoïde, puis transférées dans le système d’insertion ALI 2D. Ceci est important, car les organoïdes épithéliaux des voies respiratoires ne conviennent pas à l’exposition à des substances en suspension dans l’air, alors que l’utilisation du système ALI 2D permet d’évaluer l’impact de substances en suspension dans l’air telles que la fumée de cigarette23,36 sur les cellules épithéliales des voies respiratoires en culture. Une approche différente pour établir des cultures de cellules épithéliales des voies respiratoires ALI consiste à générer des cellules épithéliales des voies respiratoires par la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines (CSPhi)37. Dans de tels protocoles, au stade final du protocole de différenciation après différenciation en progéniteurs proximaux des voies respiratoires, les cellules peuvent être différenciées par culture à l’ALI en utilisant des procédures similaires à celles décrites ici.
Dans le protocole actuel, le milieu cBD est utilisé pour la culture à l’ALI. Le milieu cBD est un milieu sans sérum qui est préparé en ajoutant un mélange de différents suppléments, inspiré de Fulcher et al.38 ainsi que d’autres études. La solution de supplément contient 52 μg/mL d’extrait hypophysaire bovin (BPE), 0,5 μg/mL d’hydrocortisone, 0,5 ng/mL d’EGF humain, 0,5 μg/mL d’épinéphrine, 10 μg/mL de transferrine, 5 μg/mL d’insuline, 6,5 ng/mL de triiodothyronine et 0,1 ng/mL d’AR39. Étant donné que le BPE est un extrait de tissu et qu’il est soumis à des variations par lots, le milieu ne peut pas être considéré comme un milieu entièrement défini, ni exempt d’animaux. Un milieu de culture cellulaire entièrement défini est préférable pour minimiser les différences entre les lots. Compte tenu de la transition vers une recherche sans animaux, il est important que des efforts soient faits pour produire des milieux définis qui ne contiennent pas de produits animaux et qui sont abordables pour la communauté scientifique.
Diverses configurations expérimentales peuvent être utilisées sur la base du modèle ALI, en fonction de la question de recherche. Par exemple, pour étudier l’impact des composés qui peuvent influencer le processus de différenciation, cela peut être abordé en ajoutant les composés à la culture pendant les différentes étapes de la culture immergée, pendant la différenciation ou au stade bien différencié. La composition cellulaire de la culture ALI-PBEC peut être influencée par l’ajout de composés spécifiques; par exemple, la différenciation des ALI-PBEC en présence d’IL-13 génère une culture avec plus de cellules caliciformes et moins de cellules ciliées, tandis que le traitement avec l’inhibiteur de la γ-sécrétase DAPT (utilisé pour bloquer la signalisation Notch) pendant la différenciation aboutit à une culture avec plus de cellules ciliées au détriment des cellules caliciformes 23,40,41,42.
De plus, les agents pour stimuler les cellules ou bloquer certains processus peuvent être appliqués soit sur le compartiment basal, soit (dans un très petit volume) sur le compartiment apical de la culture. Les cellules peuvent également être exposées à des substances en suspension dans l’air du côté apical. De tels modèles d’exposition ont été utilisés pour étudier l’effet des gaz d’échappement des moteurs diesel ou de la fumée de cigarette entière sur les CSPE23,43,44. Le milieu peut être récolté chaque fois qu’il est modifié pour surveiller les protéines sécrétées du côté basal; il en va de même pour la face apicale des cellules qui est lavée avec du PBS tout en rafraîchissant le milieu basal. Le soi-disant lavage apical est récolté et le dithioérythritol facultatif (DTE) est ajouté pour dissocier plus efficacement le mucus produit par les cellules caliciformes. Les lysats cellulaires peuvent être obtenus pour isoler la protéine totale, l’ARN et l’ADN chromosomique et mitochondrial. Les cellules peuvent être étudiées plus avant à l’aide d’anticorps pour marqueurs spécifiques, en coupant la membrane de polyéthylène téréphtalate (PET) de l’insert en plastique et en coupant davantage cette membrane en morceaux plus petits pour de multiples colorations par immunofluorescence45. En outre, la cytométrie de flux ou FACS peut également être utilisée après trypsinisation des cellules dans les inserts. Au cours de la phase ALI, le développement de la barrière cellulaire peut être surveillé en mesurant la résistance électrique et en calculant ensuite le TEER, où la résistance électrique est inversement proportionnelle à la surface de l’insert membranaire. Le calcul est basé sur la loi d’Ohm en utilisant la formule suivante: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65102/65102eq01.jpg" style="margin: auto;">, dans laquelle Rm est la résistance électrique mesurée, Rb est la résistance électrique de base d’un insert sans revêtement ni cellules, et SA est la surface de la membrane de l’insert. La mesure de la résistance électrique à l’aide d’électrodes EVOM2 et STX/baguettes est simple, mais dépend fortement des procédures de manipulation lors de son introduction dans le puits. En outre, il a été suggéré que la forme de l’électrode affecte la mesure de la fonction barrière de la surface relativement grande17.
L’amélioration du système de culture cellulaire ALI, visant à accroître la représentation précise des tissus, comprend la coculture de types cellulaires supplémentaires tels que les leucocytes, les fibroblastes ou les cellules endothéliales46,47,48. Il a été observé que la co-culture d’ALI-PBEC avec le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) ou les macrophages différenciés M-CSF affecte nettement les réponses épithéliales innées et la réparation48. Il est important de noter que dans de tels modèles de coculture, la compatibilité des supports peut être un problème. Étant donné que le milieu utilisé pour la culture de cellules épithéliales des voies respiratoires est développé spécifiquement pour les CSPE et peut ne pas être adapté de manière optimale à d’autres types de cellules, une optimisation est nécessaire. Un autre type de progrès observé dans le domaine de la biologie des voies respiratoires pour lequel des PBEC isolés peuvent être utilisés est l’utilisation de la technologie des organes sur puce (OoC) 49,50. En utilisant cette technologie, l’influence des forces mécaniques de la respiration et du flux sanguin, telles que l’étirement, l’air et le débit moyen, peut être étudiée 29.
La variabilité entre donneurs peut être importante lors de l’utilisation de CSPE de divers donneurs, et il est donc important d’envisager l’utilisation de cellules de plusieurs donneurs pour tenir compte de cette variabilité dans les études de culture de cellules épithéliales. Étant donné que la culture des ALI-PBEC prend beaucoup de temps et entraîne des coûts considérables, la possibilité d’établir des cultures ALI-PBEC en mélangeant des cellules de différents donneurs dans un seul encart de culture cellulaire est examinée. De cette façon, des expériences pilotes peuvent être facilement réalisées à l’aide de cellules primaires, avant d’analyser les réponses de cultures dérivées de divers donneurs individuels. De plus, les donneurs ayant des caractéristiques différentes (p. ex. catégorie d’âge ou sexe différent) peuvent être regroupés pour des études exploratoires. Lors de l’utilisation de mélanges de donneurs, il est important de s’assurer qu’un nombre égal de cellules de donneurs différents est présent, afin d’éviter la possibilité qu’un donneur domine les résultats en raison d’un taux de prolifération plus élevé. Par conséquent, les cellules provenant de donneurs individuels sont développées séparément et ensemencées à une densité plus élevée dans l’insert par rapport aux cellules d’ensemencement d’un donneur individuel, afin de minimiser la prolifération dans l’insert avant la transition vers la LAI. Les réponses des mélanges de donneurs et des donneurs individuels correspondants ont été comparées en étudiant la cinétique d’infection du SRAS-CoV-2. En utilisant la RT-qPCR et la coloration par immunofluorescence, il a été observé que le mélange de donneurs fournissait une bonne représentation des différents donneurs individuels, en montrant un nombre similaire de particules virales produites et un nombre similaire de cellules infectées28.
Pour devenir une alternative acceptable pour les modèles animaux, l’édition de gènes de cellules épithéliales bronchiques en culture devrait être réalisable51. La technologie d’interférence ARN par l’utilisation de petits ARN interférents (siRNA) dans les ALI-PBEC est examinée, mais comme les cellules doivent être transfectées avec siRNA pendant la phase immergée de la culture, le knockdown n’est pas suffisamment maintenu pendant la culture ALI en raison de la longue durée de culture, à moins que la transfection siRNA ne soit fréquemment répétée pendant la culture52. Néanmoins, les siRNA peuvent être utilisés avec succès pour modifier l’expression des gènes dans les cellules basales submergées. D’autres ont utilisé avec succès la technologie CRISPR/Cas9 pour réaliser l’édition de gènes dans des cultures de cellules épithéliales primaires des voies respiratoires ALI avec administration de ribonucléoprotéine (RNP) 53. Lors de l’utilisation de telles techniques, il est essentiel que les cellules conservent leur pleine capacité de différenciation. Parce que les cultures de cellules des voies respiratoires primaires ne peuvent pas être transmises indéfiniment, l’expansion clonale des cellules génétiquement modifiées n’est pas facile et l’ajout de milieu pour sélectionner les cellules transfectées est fastidieux. Par conséquent, il est difficile d’obtenir le knockdown souhaitable dans toutes les cellules en culture. Une alternative pour générer des clones knockout est l’utilisation de stratégies knock-out dans lesCSPhi 54 et l’utilisation de ces cellules pour générer des cellules épithéliales des voies respiratoires. Une autre alternative, bien que sous-optimale, consiste à établir une lignée PBEC immortalisée afin d’étendre clonalement les cellules génétiquement modifiées55.
Le protocole présenté ici est un moyen de générer un ALI-PBEC pseudostratifié bien différencié, mais d’autres protocoles ont également été trouvés pour établir une telle culture, avec des différences de plus en plus grandes par rapport au protocole présenté. À notre avis, la validation en laboratoire des méthodes de culture et un contrôle de qualité rigoureux sont essentiels pour que le système ALI-PBEC et les systèmes de culture similaires de cellules épithéliales des voies respiratoires deviennent une alternative valable pour les expériences sur les animaux.

Le rôle de l’épithélium des voies respiratoires dans une variété de maladies pulmonaires aiguës et chroniques a été décrit dans diverses revues 1,2,3,4,5,6,7. Des cultures bien différenciées de cellules épithéliales des voies respiratoires sont un outil important pour démêler le rôle de l’épithélium des voies respiratoires. La culture de cellules épithéliales des voies respiratoires de l’interface air-liquide (ALI) est largement appliquée pour favoriser la différenciation des cellules épithéliales basales des voies respiratoires et ainsi étudier l’épithélium des voies respiratoires de manière fiable in vitro 8,9. Au cours des dernières années, l’utilisation de tels modèles a encore augmenté en raison de nouvelles initiatives de recherche liées à la pandémie de COVID-19 et d’une transition mondiale vers une recherche sans animaux. Par conséquent, l’utilisation accrue de cette lignée cellulaire modèle souligne la nécessité de partager les procédures et les expériences pour obtenir des résultats solides. Cela permettra également de comparer les résultats entre les groupes de recherche. La robustesse de la procédure est la caractéristique clé et doit donc être soumise à un contrôle de qualité. Plusieurs laboratoires ont investi dans l’élaboration de protocoles pour la culture de cellules épithéliales primaires des voies respiratoires à l’ALI. Le temps, les efforts et le budget requis peuvent être réduits lorsque ces procédures sont partagées en détail. Ces détails incluent, par exemple, le choix des plastiques et des milieux de culture cellulaire fournis par divers fabricants, car il a été constaté que cela influençait les caractéristiques des cultures obtenues10,11,12. Cela souligne l’importance de partager les expériences et les détails des procédures de culture, car en l’absence de telles informations, les résultats peuvent être affectés et / ou les efforts de validation dans divers laboratoires peuvent être entravés.
L’épithélium pulmonaire humain comprend divers types de cellules, y compris des types majeurs tels que les cellules basales, les cellules ciliées, les cellules caliciformes et les cellules de club. Afin d’imiter de manière fiable la couche de cellules épithéliales dans les voies respiratoires in vitro, ces types de cellules doivent être représentés dans les modèles de culture, et leur polarisation et leur fonction maintenues13,14,15,16. Il est tout aussi important de réaliser que les caractéristiques du donneur (y compris l’état pathologique) et l’origine anatomique des cellules (c.-à-d. nasale, trachéale, grande et petite voie respiratoire) peuvent influer sur la composition cellulaire et les réponses fonctionnelles de la culture cellulaire. Une expertise et une pratique pertinentes sont une condition préalable à la culture réussie de cellules épithéliales primaires des voies respiratoires et à l’évaluation de la qualité de la culture à la fois intuitivement (par inspection visuelle pendant la culture) et quantifiable. L’objectif de cette contribution est de fournir une méthode rentable et rapide pour l’isolement et la culture de cellules épithéliales bronchiques humaines primaires (PBEC) qui peut également être appliquée à la culture de cellules épithéliales trachéales et de petites voies respiratoires. En plus de décrire une méthode pour isoler de telles cellules à partir de tissu pulmonaire réséqué, une méthode d’expansion et de biobanque, et enfin pour l’établissement et la caractérisation d’une culture d’ALI bien différenciée dans un coût et une période de temps raisonnables est présentée et discutée.

<table><tbody><tr><td>Résistance de test de 1 000 ohms</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour étalonner le voltohmmètre épithélial EVOM2</td></tr><tr><td>4-[2-(5,6,7,8-Tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtalényl)éthynyl)-acide benzoïque (EC 23)</td><td>Tocris</td><td>4011</td><td>Utilisé dans le milieu cBD</td></tr><tr><td>Plaques multiples à 6 puits clairs traités par TC Corning</td><td></td><td>3506</td><td>Utilisé dans la première étape pour développer les cellules isolées des bronches anneau&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de milieu de croissance des cellules épithéliales des voies respiratoires</td><td>PromoCell</td><td>C-21160</td><td>Utilisé pour comparer au milieu cBD</td></tr><tr><td>Bain de billes 20 litres</td> Lab <td>Armor</td><td>74220-720</td><td>Utilisé pour préchauffer les solutions de culture cellulaire</td></tr><tr><td>BEGM Milieu de croissance des cellules épithéliales bronchiques BulletKit</td><td>LONZA</td><td>CC-3170</td><td>Utilisé pour comparer au milieu cBD</td></tr><tr><td>Albumine bovine fraction V (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260037</td><td>Utilisé dans une solution d’enrobage</td></tr><tr><td>Extrait hypophysaire bovin (BPE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Utilisé dans c-KSFM</td></tr><tr><td>Supplément de croissance des cellules épithéliales bronchiques (BEpiCGS)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>3262</td><td>Utilisé dans le milieu cBD</td></tr><tr><td>Cellule épithéliale bronchique moyenne-basale (BEpiCM-b)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC3211-b</td><td>Utilisé dans le milieu</td></tr> <tr><td>cBDInserts de culture cellulaire ; Transwell de 12 mm avec 0,4 & micro ; insert à membrane polyester poreux Corning</td><td></td><td>3460</td><td>Inserts de culture cellulaire utilisés dans le protocole Inserts de</td></tr><tr><td>culture cellulaire ; inserts à 12 puits, 0,4 & micro ; m PET transparent</td><td>CellQART fabriqué par SABEU</td><td>9310412</td><td>Inserts de culture cellulaire utilisés pour comparer avec les inserts de culture cellulaire Corning Inserts</td></tr> de <tr><td>culture cellulaire ; 12 puits ThinCert Inserts de culture tissulaire</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-032</td><td>Inserts de culture cellulaire utilisés pour comparer avec les inserts de culture cellulaire Corning</td></tr><tr><td>Flacon CELLSTAR, TC, PS, 250 ml, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td>Utilisé pour augmenter le nombre de cellules</td></tr><tr><td>CFX Maestro 1.0</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>Programme logiciel pour l’analyse des données qPCR générées avec le système CFX384</td></tr><tr><td>Système de détection PCR en temps réel CFX384 Touch</td> Système de <td>détection 1855484 qPCR</td><td>Bio-Rad</td><td></td></tr> Jeu <tr><td>d’électrodes</td> World <td>Precision Instruments</td><td>STX2</td><td>Utilisé pour mesurer la résistance électrique dans ALI-PBEC</td></tr><tr><td>CO2-Incubateur</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td>Incubateur de culture cellulaire utilisé pour les cultures de cellules libres de mycplasmes</td></tr><tr><td>CO2-Incubateur</td><td>Hereaus</td><td>Heracell 150</td><td>Incubateur de culture cellulaire utilisé pour les cultures cellulaires potentiellement infectées par des mycplasmes</td></tr><tr><td>Conteneur Coolcell</td><td>Corning</td><td>432006</td><td>Utilisé pour cryoconserver les cellules à -80 &deg ; C avant transfert dans le liquide N2</td></tr><tr><td>Comtesse 3 Compteur de cellules automatisé</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td>Utilisé pour compter les cellules et déterminer la concentration</td></tr> cellulaire <tr><td>Cryovials</td><td>Nalgene</td><td>479-3224</td><td>Utilisé pour cryoconserver les cellules dans le</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>101174Y</td><td>Utilisé dans la trypsine molle</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Avantor VWR</td><td>0231</td><td>Utilisé dans le milieu de congélation cellulaire</td></tr><tr><td>dNTP (10 mM)</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>Utilisé dans la synthèse de l’ADNc</td></tr><tr><td>Milieu modifié d’Eagle de Dulbecco (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36250</td><td>Utilisé dans le milieu cBD</td></tr><tr><td>Milieu modifié d’aigle de Dulbecco (DMEM) 4,5 g/l de glucose avec l-glutamine</td><td>LONZA</td><td>LOBE12-604F</td><td>Utilisé dans le milieu cBD pour comparer avec le DMEM d’autres fabricants&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), à haute teneur en glucose, pyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966029</td><td>Utilisé dans le milieu cBD pour comparer avec le DMEM d’autres fabricants.</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique (EGF)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Utilisé dans l’acide</td></tr><tr><td>éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>443885J</td><td>Utilisé dans la trypsine molle</td></tr><tr><td>EVOM2 Voltohmmètre épithélial</td><td>World Precision Instruments</td><td>91799</td><td>Utilisé avec le jeu d’électrodes de baguette pour mesurer la résistance électrique dans la solution de</td></tr><tr><td>fibronectine ALI-PBEC, humaine&nbsp ;</td><td>PromoCell</td><td>C-43060</td><td>Utilisé dans la solution d’enrobage</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>Utilisé dans le milieu cBD</td></tr> Solution <tr><td>saline équilibrée de Hanks (HBSS)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0313</td><td>Utilisé pour dissoudre la protéase XIV&nbsp ;</td></tr><tr><td>IQ SYBR Green Super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170887</td><td>réactif qPCR</td></tr><tr><td>Chlorhydrate d’isoprotérénol, (-)-</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6504</td><td>Utilisé dans c-KSFM</td></tr><tr><td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Utilisé dans c-KSFM</td></tr><tr><td>Maxwell RSC Instrument</td><td>Promega</td><td>AS4500</td><td>Système automatisé d’isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyKit de tissus ARN</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td>Utilisé pour isoler l’ARN total avec l’instrument Maxwell RSC</td></tr><tr><td>M-MLV Transcriptase inverse</td><td>Promega</td><td>M5301</td><td>Utilisé dans la synthèse de l’ADN cDNA</td></tr><tr><td>M-MLV Transcriptase inverse 5X tampon de réaction</td><td>Promega</td><td>M531A</td><td>Utilisé dans la synthèse de l’ADNc</td></tr><tr><td>MycoStrip</td><td>InvivoGen</td><td>rep-mys-10</td><td>Utilisé pour détecter la présence de mycoplasmes dans les échantillons de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique (HEPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td>Utilisé dans le milieu cBD</td></tr><tr><td>Oligo(dT)15</td><td>Qiagen</td><td>79237</td><td>Utilisé dans la synthèse de la solution d’ADNc</td></tr><tr><td>de pénicilline/streptomycine (Pen/Streptomycine)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0513</td><td>Utilisé comme antibiotique dans le milieu c-KSFM et cBD</td></tr><tr><td>Tamponné au phosphate solution saline (PBS)</td><td>Pharmacie LUMC</td><td>N/A</td><td>Utilisé dans différentes étapes du protocole</td></tr><tr><td>Pneumacult-ALI Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05002</td><td>Utilisé pour cultiver des cellules au stade de différenciation par rapport au milieu cBD</td></tr><tr><td>Pneumacult-Ex Plus Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05040</td><td>Utilisé pour cultiver des cellules au stade immergé par rapport au milieu cBD</td></tr><tr><td>Primer, ATP5B,</td><td>avant ADN intégré Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : TCACCCAGGCTGGTTCAGA</td></tr><tr><td>Primer, ATP5B, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : GGAGGGGACGTAAATCCCTA</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC</td></tr><tr><td>Primer, MUC5AC, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : CCTTCGACGGACAGAGCTAC</td></tr><tr><td>Primer, MUC5AC, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : TCTCGGTGACAACACGAAAG</td></tr><tr><td>Primer, MUC5B, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : GGGCTTTGAGAGAGAGT</td></tr><tr><td>Primer, MUC5B, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : AGGATGGTCGTGTTGATGCG</td></tr><tr><td>Primer, RPL13A, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : AAGGTGGTGTGTACGCTGTG</td></tr><tr><td>Primer, RPL13A, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : CGGGAAGGGTGTTGTGTGTTCATCC</td></tr><tr><td>Primer, SCGB1A1, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : ACATGAGGGAGGCAGGGGGGCTC</td></tr><tr><td>Primer, SCGB1A1, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA</td></tr><tr><td>Primer, TP63, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : CCACCTGGACGTATTCCACTG</td></tr><tr><td>Primer, TP63, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Séquence nucléotidique : TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>Utilisé comme agent antimicrobien contre les bactéries, les mycoplasmes et les champignons dans le milieu c-KSFM</td></tr><tr><td>Protéase XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>Utilisé pour le traitement enzymatique de l’anneau bronchique</td></tr><tr><td>ARNAsine Inhibiteur de la ribonucléase recombinante</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td>Utilisé dans la synthèse de l’ADNc</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine de soja ( SBTI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td>Utilisé pour inhiber l’action de la trypsine molle</td></tr><tr><td>Thermocycleur T100</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>Utilisé dans la synthèse de l’ADNc</td></tr><tr><td>TissuSAFE plus</td><td>MILESTONE MEDICAL</td><td>N/A</td><td>Système de transfert sous vide pour les échantillons biologiques</td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Utilisé pour compter les cellules vivantes et mortesnbsp ;</td></tr><tr><td>Trypsine 1:250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250-018</td><td>Utilisé dans une solution de collagène de trypsine molle</td></tr><tr><td>de type I (PureCol)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>Utilisé dans une solution d’enrobage</td></tr><tr><td>Récipient universel, PP, avec bouchon à vis en PE</td><td>Avantor VWR</td><td>216-2053</td><td>Utilisé dans le protocole pour le traitement de la protéase XIV de l’anneau bronchique</td></tr></tbody></table>

isoler les cellules épithéliales bronchiques du tissu pulmonaire réséqué pour les biobanques et établir des cultures d’interface air-liquide bien différenciées

Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures

La couche cellulaire épithéliale des voies respiratoires forme la première barrière entre le tissu pulmonaire et l’environnement extérieur et est donc constamment exposée aux substances inhalées, y compris les agents infectieux et les polluants atmosphériques. La couche épithéliale des voies respiratoires joue un rôle central dans une grande variété de maladies pulmonaires aiguës et chroniques, et divers traitements ciblant cet épithélium sont administrés par inhalation. Comprendre le rôle de l’épithélium dans la pathogenèse et comment il peut être ciblé pour la thérapie nécessite des modèles robustes et représentatifs. Les modèles de culture épithéliale in vitro sont de plus en plus utilisés et offrent l’avantage de réaliser des expériences dans un environnement contrôlé, exposant les cellules à différents types de stimuli, de toxiques ou d’agents infectieux. L’utilisation de cellules primaires au lieu de lignées cellulaires immortalisées ou tumorales présente l’avantage que ces cellules se différencient en culture d’une couche cellulaire épithéliale polarisée pseudostratifiée avec une meilleure représentation de l’épithélium par rapport aux lignées cellulaires.
Un protocole robuste, optimisé au cours des dernières décennies, est présenté ici pour l’isolement et la culture de cellules épithéliales des voies respiratoires à partir de tissus pulmonaires. Cette procédure permet d’isoler, d’étendre, de cultiver et de différencier mucociliaire avec succès les cellules épithéliales bronchiques primaires (PBEC) par culture à l’interface air-liquide (ALI) et comprend un protocole de biobanque. De plus, la caractérisation de ces cultures à l’aide de gènes marqueurs spécifiques aux cellules est décrite. Ces cultures ALI-PBEC peuvent être utilisées pour une gamme d’applications, y compris l’exposition à la fumée de cigarette entière ou aux médiateurs inflammatoires, et la co-culture / infection par des virus ou des bactéries. 
Le protocole fourni dans ce manuscrit, illustrant la procédure étape par étape, devrait fournir une base et/ou une référence pour ceux qui s’intéressent à la mise en œuvre ou à l’adaptation de tels systèmes de culture dans leur laboratoire.

Expansion utilisant la culture immergée En utilisant la méthode présentée ici, une moyenne de huit cryovials avec 400 000 cellules/cryovial peut être obtenue à partir d’une plaque de 6 puits pour un stockage à long terme dans l’azote liquide (Figure 2A). Pour ce faire, des PBEC isolés sont cultivés en plaques à 6 puits pendant un minimum de 7 jours et un maximum de 14 jours (Figure 2B) en présence de Primocin pour exclure toute contamination microbienne (en particulier mycoplasmique). La figure 2A,B donne un aperçu du nombre de cellules obtenues et du temps de culture requis parmi différents isolements de divers donneurs. Avant de récolter les cellules par trypsinisation pour les stocker dans de l’azote liquide, la confluence doit être supérieure à 80%. Si cela n’est pas réalisé dans les 14 jours, les cellules ne doivent pas être cryoconservées. Il est important de noter que lors de la récolte pour le stockage et le passage, la confluence de la couche cellulaire ne doit pas dépasser ~95% (Figure 2C). Après stockage dans de l’azote liquide, les cellules peuvent être décongelées et cultivées pour l’expansion jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de cellules soit obtenu pour les cultures ALI. Le milieu utilisé pour l’expansion des cellules à ce stade est c-KSFM, similaire à la culture initiale suivant la récolte de l’anneau bronchique18. Primocin n’est cependant pas nécessaire à ce stade, car le risque de contamination microbienne supplémentaire provenant du tissu pulmonaire est absent, et donc Primocin peut être changé pour la pénicilline / streptomycine. Ce milieu favorise les cellules épithéliales par rapport aux fibroblastes et empêche donc une éventuelle prolifération de la culture par prolifération plus rapide des fibroblastes 19,20,21. En utilisant le milieu c-KSFM, les cellules sont réparties dans le flacon et ne se connectent pas les unes aux autres, ce qui est nettement différent de la morphologie des cellules en culture immergées à ce stade dans le milieu cBD (Figure 2D,E). Après 5 ou 6 jours de culture des cellules décongelées dans un flacon T75, la couche cellulaire doit être confluente à 80 % à 95 %, ce qui se traduit par environ 3 x 106 cellules au total (figure 2F). À partir de là, environ 75 inserts (taille de plaque de 12 puits) peuvent être générés pour la culture ALI.
La méthode d’isolement et de culture décrite dans cette contribution peut également être adaptée pour être utilisée avec des biopsies bronchiques ou des brosses bronchiques comme matière première.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig02.jpg"> Figure 2 : Expansion des cellules basales avant et après cryoconservation. Les cellules ont été isolées selon le protocole décrit et cultivées à l’aide de c-KSFM. Le nombre de cellules générées par donneur a été surveillé, le comptage des cellules vivantes a été effectué à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (A) lors de la récolte des cellules de passage 0 (P0) des plaques à 6 puits (étape 2 du protocole), n = 123 donneurs, le nombre de cellules a été présenté comme le nombre de cellules récoltées par puits; Chaque point représente un donneur et la médiane est indiquée par une barre horizontale. (B) Dans le cadre du contrôle de la qualité, le temps nécessaire aux cellules P0 pour atteindre une confluence de 80 % à 90 % dans les plaques à 6 puits a été surveillé et indiqué en jours après le début de la culture immergée dans c-KSFM (n = 127 donneurs différents). Chaque donateur individuel est indiqué par un point, tous les points appartenant à 1 jour fusionnent en une ligne; plus la ligne de démarcation est large, plus il représente de donateurs; Le nombre médian de jours pendant lesquels les cellules sont en culture est indiqué par une barre horizontale plus fine. (C) Image représentative en fond clair de cellules P0 cultivées immergées dans c-KSFM au moment où les cellules ont été récoltées pour la cryoconservation à long terme. (D) Image représentative en fond clair des cellules P1 cultivées immergées dans c-KSFM au moment où les cellules ont été récoltées et transférées dans des inserts et (E) cellules P1 cultivées immergées dans un milieu cBD. F) Le nombre de cellules vivantes produites par donneur a été surveillé à l’aide d’un compteur de cellules automatisé lors du prélèvement de cellules P1 dans le ballon T75 (section 4 du protocole), n = 63 donneurs différents; le nombre de cellules est présenté comme le nombre de cellules par fiole T75, chaque donneur est indiqué par un point et le nombre médian de cellules est indiqué par une barre horizontale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Culture d’interface air-liquide (ALI) 7 jours après le début de la culture ALI, la résistance électrique de la couche cellulaire est mesurée et doit être supérieure à 300 Ω (Figure 3A); Si cela n’est pas réalisé, la culture est considérée comme un échec en raison d’un éventuel manque de formation de jonctions serrées. Il est recommandé d’exclure la possibilité d’obtenir de faibles valeurs TEER causées par des dommages à la couche épithéliale dans des inserts individuels résultant, par exemple, d’endommagements de la couche cellulaire pendant le lavage et l’aspiration. Cela peut être vérifié par une inspection microscopique visuelle des inserts de culture. D’après notre expérience, la variabilité inter-donneurs de la résistance électrique peut être significative (Figure 3B), qui est également rapportée dans la littérature14, et comme observé est également nettement influencée par l’origine du milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco utilisé (Figure 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig03.jpg"> Figure 3 : Résistance électrique transépithéliale comme contrôle de qualité des cultures ALI-PBEC. Les PEPE ont été isolées et élargies, et des cultures ALI-PBEC bien différenciées ont été établies. À plusieurs moments de la culture, la résistance électrique a été mesurée, puis le TEER a été calculé (Ω·cm2). (A) La résistance électrique a été mesurée au cours des 14 jours suivant l’ALI. n = 4 donneurs différents. Les données sont représentées comme la valeur moyenne ±écart type (ET). (B) Dans le cadre du contrôle de la qualité de la culture cellulaire ALI-PBEC, la résistance électrique a été mesurée au jour 7 (n = 50) et au jour 14 après l’ALI (n = 25); chaque point représente un donneur et le TEER médian (Ω·cm2) est indiqué par une barre horizontale. La signification des données a été testée à l’aide d’un test de Mann-Whitney non paramétrique, et aucune différence significative n’a été trouvée. (C) Les milieux de trois fournisseurs différents de DMEM ont été testés pour évaluer l’influence sur la formation de TEER. n = 4 donneurs différents; Les valeurs moyennes sont représentées ± <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig03large.jpg" target="_blank">écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tout en établissant une culture ALI-PBEC bien différenciée, dès le début de l’exposition à l’air, la concentration de PR augmente22. De cette façon, les cellules passent de la prolifération à la différenciation mucociliaire, qui est visible dès 9 jours (dépendante du donneur) après l’exposition à l’air à l’aide de la microscopie à fond clair. Le mouvement des premiers cils est visible à ce stade, et un peu plus tôt lorsqu’il est basé sur l’expression génique de marqueurs de cellules luminales différenciées23 (Figure 4).
Comme décrit dans le protocole, la production de mucus peut également être observée lors du rinçage de la surface apicale pendant le changement de milieu. La PR est très sensible à la lumière, ce qui entraîne une activité très variable à la même concentration de stock. Pour cette raison, la PR est remplacée par l’analogue synthétique de la PR EC 23 et utilisée à la même concentration, avec des résultats similaires à ceux déterminés expérimentalement. Pour cette raison et pour éviter de modifier la procédure, la concentration EC 23 sélectionnée a été maintenue égale à la concentration RA (c’est-à-dire 50 nM) précédemment utilisée24,25 (figure 5). La figure 5A illustre les valeurs TEER obtenues en utilisant différentes concentrations de EC 23, montrant une TEER maximale à 50 nM dans cette plage de concentrations testées. Les résultats présentés à la figure 5B confirment que l’expression génique des marqueurs des cellules ciliées et caliciformes est similaire lors de l’utilisation de 50 nM EC 23 ou RA. EC 23 est également nécessaire pendant la culture au stade immergé (bien qu’à une concentration beaucoup plus faible), car l’omettre à ce stade submergé et ne l’ajouter qu’au stade ALI donne une culture qui n’atteint jamais sa pleine confluence. Le temps nécessaire pour générer une culture ALI-PBEC bien différenciée avec une activité visible de battement ciliaire et une production de mucus est d’environ 14 jours, et la plupart des expériences sont donc initiées entre 14 et 21 jours de cultures ALI (Figure 4). Tous les principaux types de cellules (cellules basales, ciliées, gobelets et massues) sont observés après 14 jours de culture ALI, bien que les niveaux d’expression dépendent fortement du donneur. Ceci est démontré en évaluant l’expression génique de TP63, FOXJ1, MUC5AC et SCGB1A1 par RT-qPCR, ou l’expression des protéines à l’aide d’anticorps dirigés contre p63, α-tubuline, Muc5AC et CC-16 par coloration par fluorescence immunitaire (IF), afin de détecter des marqueurs pour les cellules basales, ciliées, gobelet et massues, respectivement25,26. Cependant, alors que 14 à 21 jours peuvent être considérés comme une règle empirique pour la plupart des expériences, pour certaines expériences, une durée de différenciation plus longue peut être envisagée, comme on l’a constaté pour le métabolisme xénobiotique, l’infection par le SRAS-CoV-2 et l’évaluation de la clairance mucociliaire27,28,29.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig04.jpg"> Figure 4 : Culture de l’interface air-liquide (ALI). Les PEPE ont été isolées et élargies, et des cultures ALI-PBEC bien différenciées ont été établies. Les cultures de l’ALI-PBEC ont été surveillées au cours des 14 jours suivant l’ALI. Des cultures cellulaires ont été lysées pour l’isolement de l’ARN aux jours 0, 7 et 14 post-ALI. Les données de deux donneurs différents sont affichées, chaque point représente un donneur individuel surveillé au fil du temps et la médiane est indiquée par une barre horizontale. L’expression génique des marqueurs basaux, ciliés, gobelets et de cellules de club (TP63, FOXJ1, MUC5B et SCGB1A1, respectivement) a été mesurée par qPCR et normalisée pour l’expression des gènes RPL13A et ATP5B (voir référence 23 pour plus de détails). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig05.jpg"> Figure 5: Comparaison de l’acide rétinoïque (RA) et de son analogue synthétique EC 23. Les PEPE ont été isolées et élargies, et des cultures ALI-PBEC bien différenciées ont été établies. Au début de l’exposition à l’air des cultures PBEC, le PR (50 nM) a été remplacé par diverses concentrations de EC 23. (A ) La résistance électrique a été mesurée au jour 14 après l’ALI, puis le TEER a été calculé (Ω·cm 2), n =2 donneurs, les barres représentent la valeur moyenne ± écart-type. ( B ) Au jour 14 post-ALI, des cultures cellulaires ont été lysées pour l’isolement de l’ARN et l’analyse ultérieure de l’expression génique des marqueurs cellulaires pour les cellules ciliées et caliciformes respectivement (FOXJ1, MUC5AC) en utilisant qPCR, et normalisé pour la RPL13A (n = 3 donneurs). Une augmentation de pli est montrée par rapport à ALI-PBEC cultivé avec 50 nM RA et représenté comme la valeur moyenne ± écart-type. (Voir référence 23 pour plus de détails) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Au cours des dernières années, la performance des produits alternatifs dans le système de culture a été examinée, tels que les milieux et les plastiques de culture. Diverses raisons justifiaient ces évaluations, notamment les changements dans la composition des milieux par les fabricants, l’introduction de nouveaux médias, ainsi qu’une pénurie de produits pendant la pandémie de COVID-19 (2020-2022). On a observé que des produits similaires provenant de différents fournisseurs donnent lieu à des cultures de cellules épithéliales différenciées sur la base de l’évaluation des marqueurs des types de cellules épithéliales, bien que la composition cellulaire finale puisse varier considérablement (figure 6A), alors que les différences dans le TEER étaient moins prononcées (figure 6B). D’autre part, le milieu de différents fournisseurs a entraîné des différences substantielles dans la composition cellulaire; lors de l’utilisation d’inserts de différentes marques, ces différences étaient limitées (figure 6C). En particulier, lors de l’utilisation du milieu de culture de cellules épithéliales des voies respiratoires PneumaCult de STEMCELL Technologies, une morphologie différente et une formation plus rapide de l’activité ciliaire visible ont été observées. Outre ces observations, une différence dans les valeurs TEER et une différence dans la composition cellulaire de l’ALI-PBEC par rapport au milieu cBD ont également été notées (Figure 6D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig06.jpg"> Figure 6 : Comparaison de différents fournisseurs de milieu cellulaire épithélial et d’inserts de culture cellulaire. Les CEPP ont été isolées, élargies et des cultures ALI-PBEC bien différenciées ont été établies. (A) Les ALI-PBEC ont été cultivés pendant 14 jours, puis les couches cellulaires ont été lysées pour l’isolement de l’ARN. L’expression génique des marqueurs basaux, ciliés, gobelet et de cellules bots (TP63, FOXJ1, MUC5AC et SCGB1A1, respectivement) a été mesurée par qPCR et normalisée pour RPL13A et ATP5B. n = 2 donateurs; les barres représentent la valeur moyenne ± écart-type. (B) Au cours des 9 jours suivant l’ALI, la résistance électrique a été mesurée et le TEER a ensuite été calculé (Ω·cm2). n = 3 donneurs différents; Les valeurs moyennes sont représentées ± écart-type. (C) Les ALI-PBEC ont été cultivés pendant 14 jours à l’aide d’inserts de culture cellulaire achetés auprès de trois fournisseurs différents, puis les couches cellulaires ont été lysées pour l’isolement de l’ARN. L’expression génique des marqueurs ciliés, gobelets et de cellules de club (FOXJ1, MUC5AC et SCGB1A1, respectivement) a été mesurée par qPCR et normalisée pour RPL13A. n = 18 donneurs différents, les barres représentent la valeur moyenne ± écart-type. Les données ont été testées pour la signification à l’aide d’un test de Kruskal-Wallis non paramétrique ANOVA unidirectionnel et aucune différence significative n’a été trouvée. (D) Les ALI-PBEC ont été cultivés soit en milieu cBD, soit en milieu PneumaCult (technologies STEMMCELL) pendant 14 jours après l’ALI, puis les couches cellulaires ont été lysées pour l’isolement de l’ARN. L’expression génique des marqueurs basaux, ciliés, gobelet et de cellules de club (TP63, FOXJ1, MUC5B et SCGB1A1, respectivement) a été mesurée par qPCR et normalisée pour RPL13A (les barres représentent la valeur moyenne ± écart-type), et la résistance électrique a été mesurée aux jours 5 et 12 post-ALI et utilisée pour calculer le TEER (Ω·cm2). n = 2; la valeur moyenne est représentée ± ET (voir la référence 23 pour plus de détails). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Composition des solutions et des milieux utilisés dans le protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Présenté ici est une méthode reproductible, abordable et robuste pour l’isolement et l’expansion des cellules épithéliales bronchiques primaires pour la biobanque à long terme et la génération de cellules épithéliales différenciées par culture à l’interface air-liquide.

Isoler les cellules épithéliales bronchiques du tissu pulmonaire réséqué pour les biobanques et établir des cultures d’interface air-liquide bien différenciées

The airway epithelial cell layer forms the first barrier between lung tissue and the outside environment and is thereby constantly exposed to inhaled ...

Ce protocole est une méthode robuste et rentable qui peut être utilisée pour répondre à une variété de questions de recherche liées à la fonction et au rôle des cellules épithéliales des voies respiratoires dans la santé et la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle donne une couche cellulaire qui représente bien la couche de cellules épithéliales humaines, y compris la production de mucus et l’activité ciliaire. Cette technique est polyvalente et peut être utilisée pour étudier les insultes liées à la maladie ou les thérapies.Pour commencer, rincez l’anneau bronchique isolé du tissu pulmonaire humain avec 10 millilitres de PBS stérile dans une boîte de Petri de 10 centimètres. Tout en tenant l’anneau avec une pince à épiler, utilisez de petits ciseaux pour enlever tout excès de tissu conjonctif et de restes de sang. Couper l’anneau en deux et plonger deux moitiés dans 10 millilitres de solution de protéase 14 préchauffée dans HBSS contenant Primocin dans un récipient stérile fermé.Incuber les pièces de l’anneau bronchique à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après l’incubation, transférer les morceaux dans une boîte de Petri contenant 10 millilitres de PBS chaud et, à l’aide d’une pince à épiler pliée, gratter l’intérieur de l’anneau pour obtenir une solution cellulaire. Jetez l’anneau.Transférer la solution cellulaire dans un tube de 50 millilitres et ajouter du PBS chaud pour obtenir un volume final de 50 millilitres. Centrifuger la solution cellulaire et aspirer le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 10 millilitres de PBS chaud. Porter le volume à 50 millilitres avec du PBS et répéter la centrifugation.Re-suspendre la pastille dans du KSFM complet chaud contenant de la Primocine. Ensuite, remplacez la solution de revêtement de la plaque à six puits par deux millilitres de suspension cellulaire par puits. Laisser les cellules se développer jusqu’à ce que la confluence soit atteinte de 80 à 90%, Pour la cryoconservation des PBEC, aspirer le milieu des puits et laver les cellules une fois avec deux millilitres de PBS chaud par puits.Trypsiniser les cellules en ajoutant 500 microlitres de trypsine molle par puits, et incuber pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius. Faire tourbillonner la solution de trypsine et libérer les cellules en tapotant doucement la plaque. Transférer les cellules détachées dans un tube centrifuge de 50 millilitres contenant un inhibiteur de trypsine de soja.Centrifuger la suspension et jeter le surnageant avant de remettre en suspension la pastille dans 10 millilitres de KSFM contenant de la pénicilline et de la streptomycine. Après avoir compté les cellules sur un compteur de cellules automatisé, re-suspendre les cellules à une concentration de 400 000 cellules par millilitre dans un milieu de congélation et ajouter un millilitre de cette suspension dans un cryovial. Transférer les flacons dans un récipient à cellules froides et le placer à moins 80 degrés Celsius.Après 24 heures, transférer les flacons à moins 196 degrés Celsius azote liquide pour un stockage à long terme. Pour enduire un flacon de culture cellulaire T75, ajouter 10 millilitres de solution d’enrobage dans du PBS et fermer hermétiquement le couvercle avant de placer le ballon dans un incubateur à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez la solution de revêtement du ballon par 10 millilitres de KSFM complet.Laissez le milieu se réchauffer à 37 degrés Celsius dans l’incubateur avec un couvercle légèrement ouvert pour laisser entrer l’air de l’incubateur. Décongeler rapidement les PTEC cryoconservés dans un bain de perles de 37 degrés Celsius. Ajouter la totalité du contenu au cryovial dans la fiole T75 préchauffée et répartir uniformément les cellules.Après vous être assuré que les cellules sont fermement attachées, remplacez le milieu par 10 millilitres de KSFM complet frais et chaud et cultivez-les jusqu’à ce que la confluence soit atteinte à 80 à 90%. Enduire les inserts de culture cellulaire en ajoutant 400 microlitres de solution d’enrobage par insert et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Trypsiniser les PCE dans la fiole en ajoutant deux millilitres de trypsine molle et incuber pendant cinq à 10 minutes.Faciliter le détachement des cellules en faisant tourbillonner et en tapotant doucement la fiole. Ensuite, ajoutez quatre millilitres d’inhibiteur de trypsine de soja dans le flacon et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 25 millilitres. Centrifuger la suspension et remettre en suspension la pastille dans six millilitres de milieu BD complet.Comptez les cellules sur un compteur de cellules automatisé. Après le revêtement, retirez la solution de revêtement des inserts. Diluer la suspension cellulaire avec un milieu BD complet complété par une nanomole EC 23 et ajouter 500 microlitres sur le dessus de la membrane des inserts.Ajouter 1,5 millilitre de milieu BD complet dans le puits sous l’insert. Lorsque les cellules sont prêtes à être transférées à l’interface air-liquide, ou ALI, retirez le milieu des inserts et du puits, et ajoutez un nouveau milieu BD complet complété par 50 nanomolaires EC 23 uniquement au puits. Changez le milieu dans les puits trois fois par semaine.Pour éliminer l’excès de mucus et de débris cellulaires, ajoutez doucement 200 microlitres de PBS chaud sur la face apicale de la couche cellulaire à l’intérieur de l’insert et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, aspirer le PBS contenant l’excès de mucus et de débris cellulaires. TEER a été mesuré pour évaluer la qualité des cultures PBEC ALI.À sept jours, la résistance électrique de la couche cellulaire supérieure à 300 ohms est considérée comme une culture réussie. De plus, la variabilité inter-donneurs de la résistance électrique a diminué au fil du temps entre le septième et le jour 14 de culture à l’interface air-liquide, et est nettement influencée par l’origine du DMEM utilisé. Tous les principaux types de cellules, telles que les cellules basales, ciliées, gobelets et massues, ont été observés après 14 jours de culture ALI, et les niveaux d’expression dépendaient du donneur.Parmi les différentes concentrations d’EC 23 testées, le TEER maximal a été observé à 50 nanomolaires. Une comparaison de l’acide rétinoïque et de son analogue synthétique, EC 23, confirme que l’expression génique des marqueurs des cellules ciliées et caliciformes était similaire entre 50 nanomolaires EC 23 et l’acide rétinoïque. L’utilisation de supports provenant de différents fournisseurs a entraîné des différences substantielles dans la composition cellulaire, tandis que les différences dans le TEER étaient moins prononcées.D’autre part, l’utilisation d’inserts de différents fournisseurs n’a pas entraîné de différences substantielles dans la décomposition cellulaire. De plus, une différence dans les valeurs TEER et la composition cellulaire de l’ALI PBEC et du milieu PneumaCult par rapport au milieu BD complet a également été observée. Lorsque les cellules sont prêtes à être transférées à l’ALI, augmenter les concentrations EC 23.De plus, ne centrifugez pas les cellules après la décongélation et retirez rapidement les cellules des plastiques de culture cellulaire après avoir ajouté SBTI. En utilisant des cultures de cellules épithéliales des voies respiratoires de la manière prévue dans ce protocole, vous pouvez suivre cela en utilisant une variété de méthodes d’analyse pour examiner, par exemple, la fonction, l’expression des gènes, la production de médiateurs des cellules épithéliales des voies respiratoires, et ainsi, par exemple, obtenir un aperçu des conséquences de l’exposition, par exemple, à la fumée de cigarette. Les prochaines étapes de ce protocole de culture cellulaire sont l’intégration de types cellulaires supplémentaires, tels que les cellules immunitaires ou les cellules vasculaires, ce qui contribuera à augmenter la représentation tissulaire.

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Décrit est la culture cellulaire et la méthode d’exposition d’un modèle bronchique in vitro pour l’exposition réaliste et répétée par inhalation aux particules pour l’essai de toxicité.

Un modèle épithélial bronchique d’interface air-liquide pour l’exposition réaliste et répétée par inhalation aux particules aéroportées pour l’essai de toxicité

Cet article fournit une méthodologie détaillée pour les approches de dissociation tissulaire et de fractionnement cellulaire permettant l’enrichissement de cellules épithéliales viables à partir de régions proximales et distales du poumon humain. Ici, ces approches sont appliquées pour l’analyse fonctionnelle des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires grâce à l’utilisation de modèles de culture d’organoïdes 3D.

Isolement et enrichissement des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires humaines pour la culture organoïde

Le protocole décrit un bioréacteur basé sur l’imagerie qui permet l’élimination sélective de l’épithélium endogène de la trachée du rat et la distribution homogène des cellules exogènes à la surface de la lumière, suivie d’une culture in vitro à long terme de la construction du tissu cellulaire.

Bioréacteur guidé par imagerie pour la génération de tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie

Les progrès récents dans les protocoles de différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme permettent la dérivation par étapes de types de cellules spécifiques à un organe. Ici, nous fournissons des étapes détaillées pour la maintenance et l’expansion des cellules basales des voies respiratoires dérivées de l’iPSC et leur différenciation en épithélium mucociliaire dans des cultures d’interface air-liquide.

Génération de cultures d’interface air-liquide de cellules épithéliales des voies respiratoires à partir de cellules souches pluripotentes humaines

La culture d’interface air-liquide est couramment utilisée pour développer un épithélium des voies respiratoires pseudostratifié en différenciant les cellules épithéliales bronchiques humaines normales primaires qui imitent la face apicale des voies respiratoires pulmonaires. Nous décrivons ici un protocole simple pour déterminer sa qualité en surveillant ses propriétés biophysiques, telles que la fonction ciliaire et l’intégrité de la membrane.

Détermination de la fonction ciliaire et de l’imperméabilité membranaire de l’épithélium des voies respiratoires pulmonaires pseudostratifié

Cet article décrit la génération d’un modèle complexe de barrière respiratoire multicellulaire composé d’épithélium pulmonaire, de mésenchyme, de cellules endothéliales et de macrophages dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans une culture d’interface air-liquide.

Co-culture de cellules épithéliales, mésenchymateuses, endothéliales et immunitaires dérivées d’iPSC pour modéliser l’intégrité de la barrière des voies respiratoires dans la santé et les maladies pulmonaires

Apprenez à isoler des cellules épithéliales bronchiques à partir de tissu pulmonaire humain pour établir des cultures d'interface air-liquide bien différenciées. Cette méthode robuste et économique permet d'étudier la fonction épithéliale dans la santé et la maladie.

Isoler les cellules épithéliales bronchiques du tissu pulmonaire réséqué pour les biobanques et établir des cultures d’interface air-liquide bien différenciées (Vidéo) | JoVE Journal

Isoler les cellules épithéliales bronchiques du tissu pulmonaire réséqué pour les biobanques et établir des cultures d’interface air-liquide bien différenciées

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