Name: Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: למדו שיטת אלקטרופיוז'ן יעילה לתאים בתרבית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפרוטוקול מדגים יצירת תאי היברידיים מתאי מלנומת עכברים ומאפשר הערכת יעילות ההיתוך בצורה ויזואלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות למחקר סלובנית (פרויקט J2-9764 תוכנית P2-0249). וידאו זה מהווה חומר משלים עבור &quot;electroporation מבוססי טכנולוגיות וטיפולים&quot; סדנה מדעית קורס אקדמי, המאורגן על ידי הפקולטה להנדסת חשמל באוניברסיטת ליובליאנה, סלובניה.

אני טוען את התאים עוקבים Cell CMFDA ו CMRA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויים שבוצעו על תאים שהוכנו בעבר שורה של מלנומה תא העכבר (B16-F1). התאים גדלים בשני מופרדות 25 ס"מ 2 צלוחיות תרבות (TPP, ZDA) כדי מפגש 70-80% במדיום תרבות DMEM (מדיום שונה Dulbecco של הנשרים) בתוספת סרום 10% שור עוברית, 0.15 מ"ג / מ"ל L-גלוטמין, 16 מ"ג / ml גנטמיצין (כולם סיגמא אולדריץ, גרמניה), 200 יחידות / מ"ל crystacillin (Pliva, קרואטיה), ו מודגרות ב 5% CO 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין שתי מניות 10 mM פתרונות של עוקבים Cell (Invitrogen, ארה"ב) על ידי הוספת 10.76 μl ו 9 μl (עבור גרין CMFDA עבור אורנג' CMRA, בהתאמה) של DMSO (סיגמא אולדריץ, גרמניה) עד 50 מיקרוגרם של צבע במקור Invitrogen בקבוקון. הפתרון המניה ניתן לאחסן במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. לפני שמתחילים את הניסויים, לחמם את הפתרון עד גבישים של DMSO להתמוסס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ביקרבונט ללא קרבס-Hepes חיץ (130 mM NaCl, KCl mM 4.7, 1.2 mM MgSO 4, 1.2 mM KH 2 PO 4, 11.7 מ"מ D-גלוקוז, 1.3 mM CaCl 2, 10 HEPES מ"מ, pH 7.4). בשני 15 מ"ל Eppendorf צינורות בנפרד לערבב 2.1 μl של כל פתרון המניות (10 mM CMFDA או CMRA, בהתאמה) מ"ל 3 של חיץ קרבס-Hepes ביקרבונט חינם. זה מניב "פתרון טעינת" המכיל כ 7 מיקרומטר CMFDA (או CMRA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ קרבס-Hepes ביקרבונט חינם ולאחר מכן הכנס טעינת פתרונות לתוך צלוחיות. דגירה התאים במשך 30 דקות ב 5% CO 2 ב 37 ° C. במהלך זה ריאגנטים הדגירה first לעבור בחופשיות דרך קרום התא, אבל פעם בתוך התא, ריאגנטים הופכים תאים impermeant תוצרי התגובה ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה ראשונה, לשטוף דגירה תאים בינוניים עם תרבות לעוד שעתיים 5% CO 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים צלוחיות שניהם (עמוסה CMFDA ו CMRA) ומערבבים תאים אדום וירוק יחד יחס 01:01 בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל (TPP, ZDA). התאם את הריכוז התא 5 x 10 6 תאים / מ"ל ידי דילול עם המדיום DMEM או על ידי ריכוז עם צנטריפוגות. מניחים ירידה של 20 μl ההשעיה תא היטב כל אחד 24 multiwell צלחת (TPP, ZDA). דגירה תאים 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לאפשר להם מעט לצרף אל פני השטח של הבאר קשרים התא. </li></ol> השנייה. Electrofusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ isoosomolar פוספט אשלגן (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mm MgCl 2, סוכרוז 250 מ"מ) פוספט hypoosmolar חיץ אשלגן (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mm MgCl 2, סוכרוז 75 mM) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את multiwell עם תאים על העמדה הבמה, המיקרוסקופ אלקטרודות בתחתית הבאר לחבר אותם מחולל את הדופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים מ"ל 1 של חיץ isoosomolar פוספט אשלגן. הוסף 350 μl של חיץ hypoosmolar פוספט אשלגן על מנת לגרום לנפיחות התא. המאגר אמור לכסות את האלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו תאים חיץ hypoosmolar 2 דקות לפני החלת פולסים חשמליים. במהלך הזמן הזה זרם של מולקולות המים לתוך התאים בשל חוסר איזון אוסמוטי בין הפנים לבין החוץ של התאים לגרום לעלייה של נפח התא. פולסים חשמליים צריך להיות מיושם כאשר תאים קרובים כרכים המקסימלי שלהם, לפני תחילת הירידה בהיקף הרגולציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג electrofusion האופטימלי ולשמור על כדאיות התא, פרמטרים אופטימליים של פולסים חשמליים אמור לשמש. אלה תלויות שורת תאים המשמשים [1]. בניסוי זה רכבת של 8 פולסים מלבני (כל אחד עם משך 100 μs בבית הרץ 1) מוחל על כל דגימה באמצעות מכשיר electroporation (ב Cliniporator במקרה שלנו, איג'יאה, איטליה). פולסים מועברים לשני Pt / עיר אלקטרודות מקבילות חוט בקוטר 0.8 מ"מ ו - 5 מ"מ המרחק ביניהם, יצירת שדה חשמלי של כ 1200 V / ס"מ בין האלקטרודות בכל טוב, למעט לשלוט היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את התאים ללא הפרעה במשך 10 דקות לאחר הלידה הדופק. קבע את התשואה היתוך באמצעות מיקרוסקופ לעומת הניאון שלב. </li></ol> ג. תמונה הרכישה קביעת התשואה היתוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים הם נצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במקרה שלנו Zeiss AxioVert 200, Zeiss, גרמניה) מצויד אובייקטיבי (X20) ומצלמה מקורר CCD (VisiCam 1280, Visitron, גרמניה). התמונות הן רכשה MetaMorph 7.1.1 (התקנים מולקולריים, ארה"ב), אך רכישת תוכנה דומה אחרת יכול לשמש גם. CMFDA מתרגש עם monochromator (צבעוני IV, Visitron, גרמניה) ב 492 ננומטר CMRA ב 548 ננומטר. הקרינה של CMFDA ו CMRA נרכש באמצעות שני מסנני פליטה, אחד מרוכז ב 535 ננומטר (HQ535/30m, עבור CMFDA) ואת מרוכז אחרים 510 ננומטר (D605/55m, עבור CMRA, הן Chroma, ארה"ב). השימוש dichroic במראה (Q515LP) מנעו לדבר לעבור ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת שלוש תמונות (לעומת שלב, אדום וירוק פלואורסצנטי) במשך חמישה שדות שנבחרו באקראי היטב כל אחד. יצירת ערוץ שלוש תמונות מתוך שלישיה כל התמונה. בתמונה כגון הציטופלסמה fluorescing ניתן לראות יחד עם קרום התא. התאים התמזגו ולכן יכול להיקבע בקלות [תמונה 1]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת כל שלושת סוגי התאים (אדום, ירוק ניאון dually) בתוך תמונה תלת כל ערוץ. לקבוע את אחוז התאים פלורסנט dually על ידי חלוקת מספר התאים פלורסנט dually עם מספר תאים כל אחת מהתמונות. תשואה Fusion מוגדר כאחוז של תאים פלורסנט dually כפול 2 מאז מחצית התאים התמזגו לא מזוהים (כאשר תאים של הפתיל באותו צבע). </li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 שלושה מיקרוסקופיה ערוץ תמונה של B16F1 תאים לאחר electrofusion:. בניגוד שלב, CMRA פלואורסצנטי (עירור ב 548 ננומטר) CMFDA פלואורסצנטי (עירור ב 492 ננומטר), הגדלה 20x אובייקטיבי

<ol><li>Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Electro.+Magnetobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li>
<li>Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li>
<li>Rols, M. -P., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li>
<li>Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeil%2C+G+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 220, 174-196 Forthcoming.</li>
<li>Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+cell+pellets%3A+II.+Osmotic+properties%2C+electroporation%2C+and+related+phenomena%3A+Membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li>
<li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li>
<li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li>
<li>Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li>
<li>Teissié, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

היכולת של קרום התא אל הפתיל הלא ספציפית, למשל, על ידי שדות חשמליים חיצוניים, חשוב הרפואה והביוטכנולוגיה, מחקר בביולוגיה. היתוך ספציפי כזה מאפשר ייצור של תאים היברידית יקר מאוד את המוצרים שלהם, כגון נוגדנים חד שבטיים, מספק מידע על המנגנונים הבסיסיים של היתוך [2]. Electrofusion היא שיטה פוטנציאלי יעיל מאוד שכן הוא יכול להיות מותאם כראוי לסוגים שונים של תאים. Electrofusion מושגת כאשר תאים מגע פיזי קרוב מובאים למצב fusogenic שלהם (מועדים היתוך) באמצעות מתח גבוה פולסים חשמליים. את היעילות של electrofusion תלוי פרמטרים שונים המשפיעים על שני חלקים של תהליך electrofusion. חלק ראשון של תהליך electrofusion הוא הישג של מגע פיזי קרוב בין התאים, אשר ניתן להשיג עם שיטות שונות [3-8]. שיטה דבקות (תאים גוברת מפגש) יכול להיות מנוצל ביעילות בשל הקשר תא הוקמה באופן ספונטני באזורי גדול בין תאים, אך היא מייצרת תאים התמזגו גדול מאוד עם גרעינים רבים. אנו בשיטת דבקות שונה, שבו תאים קטנים (עם הגרעינים 2-5), אשר יש סיכוי גבוה יותר לשרוד להתרבות, מתקבלים (איור 1). קשר בין תאים גם ליהנות נפיחות האוסמוטי של תאים, עקב טיפול אוסמוטי השתמשו בניסוי [9]. החלק השני של התהליך electrofusion הוא הישג של מדינת fusogenic של קרום התא. המדינה Fusogenic וקושרת היטב עם המדינה electropermeabilized של הממברנה (תאים שאינם דווקא permeabilized מולקולות שבדרך כלל לא יכול לעבור דרך הממברנה ללא פגע), והוא נשלט על ידי הפרמטרים זהה של פולסים חשמליים (אמפליטודה, אורך מספר ותדירות) [10] . הערכים של הפרמטרים החשמליים הדרושים electroporation אופטימלי [1] electrofusion שונים בין תאים שונים, תלוי בגודל תאים התכונות הביולוגיות שלהם. פרמטרים חשמל וכך צריך להיות מותאם עבור שורות תאים שונים, אשר משמשים כשותפים היתוך, כדי להשיג היתוך.

<table><tbody><tr><td>CMRA</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td>צבע פלואורסצנטי ציטוסולי</td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td>צבע פלואורסצנטי ציטוסולי</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>מצע Eagle המשופר של Dulbecco&amp;rsquo;&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>crystacillin</td><td>ריאגנט</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>ריאגנט</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A124873 927</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ריאגנט</td><td>Fluka</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ריאגנט</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A154336 908</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>מחולל פולסים חשמליים</td><td>כלי</td><td>IGEA</td><td></td><td>Cliniporator VITAE</td></tr><tr><td>פלטה רב-בארית</td><td>כלי</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה לצנטריפוזון 50 ml</td><td>כלי</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה לצנטריפוזון 15 ml</td><td>כלי</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>כלי</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודות</td><td>כלי</td><td>הזמנה מיוחדת</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

electrofusion cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Electrofusion Cell היא שיטה בטוחה, לא ויראלי ולא כימי שיכול לשמש להכנת תאים היברידית לטיפול אנושי. Electrofusion כולל יישום של מתח גבוה בפולסים קצרים חשמליים לתאים הנמצאים במגע קרוב. יישום קצר, מתח גבוה פולסים חשמליים גורם היציבות של ממברנות פלזמה התא. ממברנות ערער הם חדירים יותר עבור מולקולות שונות ונוטים גם איחוי הקרומים ערער עם כל השכנים. Electrofusion הוא אפוא דרך נוחה להשיג היתוך הלא ספציפית של תאים שונים מאוד<em&gt; במבחנה</em&gt;. על מנת לקבל, איחוי קרום התא, ערער על ידי שדה חשמלי, חייב להיות קשר הדוק כדי לאפשר מיזוג של bilayers השומנים שלהם וכתוצאה מכך הציטופלסמה שלהם. בסרטון הזה אנחנו מדגימים electrofusion יעילה של תאים<em&gt; במבחנה</em&gt; באמצעות שיטה הדבקות שונה. בשיטה זו, תאים מותר לצרף רק מעט אל פני השטח של הבאר, כך בינוני ניתן להחליף תאים עדיין לשמר את הצורה הכדורית שלהם. ויזואליזציה Fusion נבחנת על ידי סימון מראש של הציטופלסמה של תאים שונים עם צבעי ניאון גשש התא; מחצית התאים מסומנים עם כתום CMRA ואת החצי השני עם ירוק CMFDA. תשואה Fusion נקבע במספר התאים פלורסנט dually מחולק למספר של כל התאים מוכפל לשניים.

בסרטון הזה אנחנו מדגימים electrofusion יעילה של תאים<em&gt; במבחנה</em&gt; באמצעות שיטה הדבקות שונה באמצעות electroporation ואת גילוי מאוחר של ראיה התאים התמזגו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

מיזוג תאים חשמלי (Cell electrofusion) הוא שיטה בטוחה, לא ויראלית ולא כימית, שניתן להשתמש בה להכנת תאים היברידיים לטיפול בבני אדם. מיזוג חשמלי כולל...

מיזוג חשמלי (Electro fusion) כולל יישום של פולסים חשמליים קצרים במתח גבוה על תאים הנמצאים במגע הדוק. בסרטון זה, אנו מדגימים מיזוג חשמלי של תאים in vitro באמצעות שיטת היצמדות (Adherence Method) שונה. הניסויים בוצעו בתאי מלנומה של עכבר, BF one.עבור הניסוי, פעל לפי השלבים הבאים. גדל תאים בשני מבקחורי תרבית נפרדים עד להגעה ל-80% confluence. בנפרד, הוסף 2.1 µL מכל אחד מתמיסות המלאי.10 מילימולר C-M-F-D-A או CMRA בהתאמה לשלושה מיליליטר של Krebs Hess Buffer בתוך מבחנה לצנטריפוגה. שטפו את התאים פעמיים ב-Krebs Hess buffer ולאחר מכן הכניסו את תמיסות הטעינה לבקבוקים. תמיסות הטעינה מכילות בערך שבעה מיקרומולר C-M-F-D-A או CMRA בהתאמה.דגרו את התאים למשך 30 דקות באטמוספירה מבוקרת. במהלך דגירה ראשונה זו, חומרים חודרים בחופשיות דרך קרומי התאים אל תוך הציטוזול, שם הם הופכים לתוצרי תגובה חדירים לקרומי IMP. לאחר דגירה ראשונה זו, שטפו ולאחר מכן דגרו את התאים עם מצע גידול למשך שעתיים נוספות.את התאים בוחנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה המצויד במצלמת CCD מקוררת בתוכנת הרכישה. הגדירו את אורך גל העירור ל-548 nanometers ובחרו מסנן band pass מתאים לתמונת פלואורסצנציה של תאים הטעונים ב-CMRA. עבור תאים הטעונים ב-C-M-F-D-A, הגדירו את אורך גל העירור ל-492 nanometers ובחרו מסנן band pass לתמונת פלואורסצנציה ירוקה. ספרו את התאים בשני הבקרוחים וערבבו תאים אדומים וירוקים יחד ביחס של אחד לאחד, והתאימו את ריכוז התאים ל-5 million cells per milliliter.הניחו טיפה של 20 µL מתלי תאים במרכזו של כל באר. בתוך פלטת 24 באערים, דגרו את התאים באטמוספירה מבוקרת למשך 20 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד קלות לפני השטח של הבאר בשכבה אחת (monolayer) וליצור מגעים בין התאים. הניחו את הפלטה עם התאים על במה המיקרוסקופ.מקמו את האלקטרודות בתחתית הבאר וחברו אותן למחולל הפולסים. כדי להשיג אלקטרו-היתוך (electro fusion) אופטימלי ולשמור על חיות התאים, יש להשתמש בפרמטרים מתאימים של פולסים חשמליים. פרמטרים אלו תלויים בסוג תרבית התאים ויש לקבוע אותם בניסויים מקדימים. הסירו את מצע התרבית ושטפו את התאים ב-1 mL של חוצץ פוטסיום פוספ antioxidant ISO omu, ולאחר מכן ב-350 µL של חוצץ פוטסיום פוספ antioxidant hypos Miller, כדי להשרות נפיחות של התאים.השאירו את התאים בבופר היפראוסמולי למשך שתי דקות לפני הפעלת הפולסים החשמליים. יש להפעיל את הפולסים החשמליים כאשר התאים קרובים לנפח המקסימלי שלהם, כלומר לפני שהם מתחילים בתהליך של ויסות נפח.ירידה בניסוי שלנו. הופעל רצף של שמונה פולסים מלבניים במשך 100 microseconds בתדירות של one hertz. לאחר הגשת הפולסים.השאירו את התאים ללא הפרעה למשך 10 דקות לאחר 10 דקות. קבעו את נבגי הדיפוזיה באמצעות מיקרוסקופ פאזה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. רכשו שלוש תמונות, פאזה, פלואורסצנציה אדומה וירוקה, בחמישה שדות ראייה שנבחרו באופן אקראי.בכל מקרה, ניצור תמונות תלת-ערוציות מכל שלשיית תמונות בתוכנת Image J כדי לשפר את האיכות הוויזואלית של התמונות לפני יישום שלבי עיבוד מקדמי על התמונות המקוריות, הכוללים הסרת רקע ושיפור ניגודיות עם מערכי פרמטרים ברירת מחדל. לבסוף, תמונות תלת-ערוציות מורכבות באמצעות תוסף RGB to gray של Image J. בתמונה כזו ניתן לראות את הציטופלזמה במצב מנוחה יחד עם ממברנות התאים.כך ניתן לקבוע בקלות מספר מצומצם של תאים בתמונה בעלת שלושה ערוצים; ספרו את שלושת סוגי התאים: האדומים, הירוקים והפלואורסצנטיים הכפולים. קבעו את אחוז התאים הפלואורסצנטיים הכפולים על ידי חלוקת מספר התאים הפלואורסצנטיים הכפולים במספר כל התאים בכל תמונה. ניצול ההיתוך (Fusion yield) מוגדר לאחר מכן כאחוז התאים הפלואורסצנטיים הכפולים כשהוא מוכפל בשניים.מאחר שמחצית מתאי התצפית אינם מזוהים כאשר תאים של אותו צבע נצפים.

cell-electrofusion-visualized-with-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו תיאר תכונות מבניות של גליה-neuromuscular הסינפסות הכנה בתוך-out רקמת הרומן של זחלי זבוב חי באמצעות צבעי ניאון עם מיקרוסקופיה confocal. אנחנו שכותרתו מסופי נוירון לחיות עם נוגדנים העיקרי ניאון HRP, וגם דמיינו את החלל perisynaptic עם Dextrans ניאון.

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

טכניקת קלם הותאמה לנתח מורפולוגיה ultrastructural של קרומים, האברונים, ומבני subcellular מושפעים מולקולות microinjected. שיטה זו משלבת טכניקות רבות העצמה של המיקרומניפולציה / microinjection, מיקרוסקופיה confocal ניאון, וכן במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לאפשר מילימטר לרזולוציה רבה ננומטר. טכניקה זו היא נוחה למגוון רחב של יישומים.

אור גומל ומיקרוסקופי אלקטרונים (קלם) ככלי למדמיינים מולקולות Microinjected והיעדים האיקריוטים תת סלולריים

מקור: אייגריין, ל. , ואחרים. הפנמה ותצפית על מולקולות ביולוגיות פלואורסצנטיות במיקרואורגניזמים חיים באמצעות אלקטרופורציה.  J. Vis. Exp. (2015)הסרטון מדגים את העברת מולקולות ביולוגיות פלואורסצנטיות לתאים מיקרוביאליים בעלי יכולת אלקטרופוטית באמצעות אלקטרופורציה. התהליך מתחיל בהכנסת DNA או חלבונים מסומנים בפלואורופור לתוך תליית תא מקורר. לאחר מכן מופעל פולס במתח גבוה ליצירת נקבוביות ממברנה זמניות, המאפשרת כניסת ביומולקולה לציטופלזמה. לאחר ההתאוששות, התאים עוברים שטיפה וסינון להסרת מולקולות שאינן...

אספקה מבוססת אלקטרופורציה של ביומולקולות פלואורסצנטיות לתאי חיידק

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

מתוארת שיטה מבוססת חלבון פלואורסצנטי של תאים חיים להארת ואקואולים תאיים (תכלילים) המכילים כלמידיה. אסטרטגיה זו מאפשרת קביעה מהירה ואוטומטית של זיהום כלמידיה בדגימות וניתן להשתמש בה כדי לחקור כמותית את דינמיקת הצמיחה של הכללה.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

פרוטוקול זה משתמש באלקטרופורציה כדי להציג ולבטא חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית בסיבי שריר עכברים. לאחר ההתאוששות לאחר אלקטרופורציה, הסיבים מבודדים. לאחר מכן מדמים סיבים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה כדי להמחיש את מבנה השרירים.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

מטרת פרוטוקול זה היא לנתיך שני סוגי תאים שונים כדי ליצור תאים היברידיים. ניתוח מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית של תאים התמזגו משמש כדי לעקוב אחר התא של המקור של אורגלים הסלולר. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי לחקור כיצד המבנה התאי והפונקציה מגיבים להפרעות באיחוי התאים.

תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד

למדו שיטת אלקטרופיוז'ן יעילה לתאים בתרבית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפרוטוקול מדגים יצירת תאי היברידיים מתאי מלנומת עכברים ומאפשר הערכת יעילות ההיתוך בצורה ויזואלית.

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

גלה סרטונים נוספים