Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי
July 1st, 2010
בסרטון הזה אנחנו מדגימים electrofusion יעילה של תאים במבחנה באמצעות שיטה הדבקות שונה באמצעות electroporation ואת גילוי מאוחר של ראיה התאים התמזגו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
היתוך חשמלי כרוך ביישום פולסים חשמליים קצרים במתח גבוה על תאים בהקשר קרוב. בסרטון זה, אנו מדגימים היתוך חשמלי של תאים במבחנה באמצעות שיטה. ניסויים בוצעו על תאי מלנומה של עכברים, BF one.
לצורך הניסוי, בצע את השלבים הבאים. לגדל תאים בשתי צלוחיות תרבית נפרדות עד למפגש של 80%. בנפרד, הוסף 2.1 מיקרוליטר מכל תמיסת מלאי.
10 מילי-מולרי C-M-F-D-A או CMRA בהתאמה לשלושה מיליליטר של Krebs Hess Buffer בצינור צנטריפוגה. שטפו תאים פעמיים עם מאגר קרבס הס ולאחר מכן הכניסו תמיסות טעינה לצלוחיות. תמיסות העמסה מכילות כשבע מיקרו-מולריות, C-M-F-D-A או CMRA בהתאמה.
דגירה של תאים למשך 30 דקות באווירה מבוקרת. במהלך הדגירה הראשונה הזו, אזורים עוברים בחופשיות דרך ממברנות התאים לתוך הציטוזול, שם הם הופכים לתוצרי תגובה קבועים של ממברנה. לאחר הדגירה הראשונה הזו, יש לשטוף ולאחר מכן לדגור את התאים במדיום תרבית למשך שעתיים נוספות.
התאים נצפים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמת CCD מקוררת בתוכנת הרכישה. הגדר את אורך גל העירור ל-548 ננומטר ובחר תמונה פלואורסצנטית מתאימה של מסנן מעבר פס של התאים הטעונים ב-CMRA עבור התאים הטעונים ב-C-M-F-D-A. הגדר את אורך גל העירור ל-492 ננומטר ובחר מסנן מעבר פס לעיני טריפסין בתמונה פלואורסצנטית ירוקה, וספור את התאים בשתי הצלוחיות וערבב תאים אדומים וירוקים יחד ביחס אחד לאחד, התאם את ריכוז התאים ל-5 מיליון תאים למיליליטר.
הניחו טיפה של 20 מיקרוליטר של תרחיף תאים באמצע כל באר. בצלחת מרובת בארות 24 דגרו תאים באטמוספירה מבוקרת למשך 20 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד מעט לפני הבאר בשכבה אחת וליצור מגעים תאיים בינם לבין עצמם. הנח את הבאר המולטי-באר עם התאים על במת המיקרוסקופ.
מקם את האלקטרודות בתחתית הבאר וחבר אותן למחולל הדופק כדי להשיג היתוך חשמלי אופטימלי ולשמור על כדאיות התאים, יש להשתמש בפרמטרים נאותים של פולסים חשמליים. פרמטרים אלה תלויים בקו התא ויש לקבוע אותם בניסויים ראשוניים. הסר את מדיום התרבות ושטוף את התאים עם מאגר אשלגן פוספט ISO אחד של מיליליטר ב-350 מיקרוליטר היפו מילר אשלגן פוספט על מנת לגרום לנפיחות בתאים.
השאירו את התאים במאגר היפראוסמלי למשך שתי דקות לפני הפעלת פולסים חשמליים. יש להפעיל פולסים חשמליים כאשר התאים קרובים לנפח המקסימלי שלהם. זה לפני שהם מתחילים בנפח רגולטורי.
ירידה בניסוי שלנו. הופעלה רכבת של שמונה פולסים מלבניים עם משך של 100 מיקרו-שניות בהרץ אחד. לאחר לידת דופק.
השאירו את התאים ללא הפרעה למשך 10 דקות לאחר 10 דקות. קבעה את תפוקת הדיפוזיה באמצעות ניגודיות פנים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. E רוכש שלוש תמונות, ניגודיות פנים, פלואורסצנטיות אדומה וירוקה בחמישה שדות ראייה שנבחרו באופן אקראי.
בכל אחד מהם, ובכן צור תמונות של שלושה ערוצים מכל שלישיית תמונה בתוכנת image, J על מנת לשפר את האיכות החזותית של התמונות ניתן להחיל שלבי עיבוד מקדים על התמונות המקוריות, שיפורי רקע, חיסור וניגודיות עם ערכות פרמטרים המוגדרות כברירת מחדל. לבסוף, תמונות שלושה ערוצים מורכבות באמצעות תוסף RGB לתמונה אפורה J. בתמונה כזו ניתן לראות את הציטופלזמה במנוחה יחד עם קרומי התאים.
לפיכך ניתן לקבוע בקלות תאים מעטים בספירת התמונות של שלושת הערוצים בכל שלושת סוגי התאים, אדום, ירוק ופלואורסצנטי כפול. קבע את אחוז התאים הפלואורסצנטיים הכפולים על ידי חלוקת מספר התאים הפלואורסצנטיים הכפולים במספר כל התאים בכל תמונה. תפוקת היתוך מוגדרת אז כאחוז התאים הפלואורסצנטיים כפול שניים.
מכיוון שמחצית מתאי התצוגה אינם מזוהים כאשר תאים באותו צבע צופים.
סקירה
הסרטון הזה מדגים את האלקטרופיוזיה היעילה של תאים in vitro באמצעות שיטת הדבקה שונה בשילוב עם אלקטרופורציה. התהליך כולל את זיהוי תאים מפויזים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- טכניקות פיוזיה של תאים
- שיטות אלקטרופורציה
- יישומי מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות
רקע
- אלקטרופיוזיה היא טכניקה המשתמשת בפולסים חשמליים כדי להקל על פיוזיה של תאים.
- השיטה יכולה לשפר את היעילות של יצירת תאים היברידיים.
- מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות מאפשרת ויזואליזציה של תאים מפויזים.
- הבנת פיוזיה של תאים היא חיונית עבור יישומים ביולוגיים שונים.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה אמינה לאלקטרופיוזיה של תאים.
- להמחיש ולכמת את היעילות של פיוזיה של תאים.
- לספק פרוטוקול שניתן לשכפל במעבדות אחרות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- תאי מלנומה של עכבר טופחו והוכנו לפיוזיה.
- צבעים פלואורסצנטיים שימשו לסימון התאים לפני הפיוזיה.
- פולסים חשמליים הופעלו כדי לגרום לפיוזיה של תאים.
- מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות שימשה לניתוח תוצאות הפיוזיה.
תוצאות עיקריות
- פיוזיה מוצלחת של תאים הושגה כפי שמצוין על ידי פלואורסצנטיות.
- אחוז התאים הפלואורסצנטיים כפולים חושב כדי לקבוע את תפוקת הפיוזיה.
- פרמטרים אופטימליים של פולסים חשמליים זוהו לחיוניות התאים.
- איכות התמונות שופרה באמצעות טכניקות עיבוד תמונות.
מסקנות
- שיטת ההדבקה המשופרת יעילה לאלקטרופיוזיה של תאים.
- מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות היא כלי בעל ערך להערכת יעילות הפיוזיה.
- פרוטוקול זה ניתן להתאמה לסוגי תאים שונים במחקר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Cell electrofusion visualized by fluorescence microscopy provides a non-viral, non-chemical platform for generating hybrid cells, supporting early-stage biopharma research. Quantitative visualization of fusion events enables robust assessment of cell manipulation techniques, directly impacting target validation and assay development. This approach strengthens predictive confidence in cell-based workflows and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell fusion mechanisms relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of cell manipulation strategies for hybrid cell generation.
- Facilitates biological de-risking by quantifying fusion efficiency and specificity.
- Provides measurable outputs for portfolio triage and target confidence.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell systems for downstream screening of fusion-dependent phenotypes.
- Delivers standardized, reproducible quantification of fusion yield via dual fluorescence.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound evaluation targeting cell fusion processes.
- Supports reliable benchmarking of fusion protocols across cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational workflows by enabling generation of hybrid cells for preclinical modeling.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Reduces mechanistic ambiguity in cell manipulation strategies for therapeutic development.
- Supports risk-adjusted advancement of cell fusion-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust cell fusion quantification and visualization, supporting both early validation and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative fusion yield measurement supports hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Dual fluorescence readouts enable reproducible assay development and benchmarking.
- Analytics: Image-based quantification provides objective, comparable outputs for condition assessment.
- Translational Research: Hybrid cell generation supports preclinical modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across cell types and research programs, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fusion workflows.
- Operational Value: Standardizes fusion quantification and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to pulse generators, fluorescence microscopes, and image processing software.
- Demands cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation across cell lines may require optimization of pulse parameters and labeling conditions.
- Fusion efficiency and viability are cell line-dependent and must be empirically determined.
