Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays
28 במאי 2007
היי, שמי אנה ואנחנו מבצעים באופן שגרתי פרופיל ביטוי גנים במעבדה. ואנו משתמשים בטכניקה זו כדי לנטר גנים מווסתים דיפרנציאליים בין מת' לסוג הבר. והיום יש לי דגימות RNA מסוג פרא ומת' וכולנו עושים C קודם.
אנו משתמשים בשיטות תיוג עקיפות והיתרון בטכניקה זו הוא מניעת הטיית עיניים שעלולה להתרחש בתיוג ישיר. וכדי לעשות זאת יש לנו דגימות RNA ואנחנו בוחרים להשיג שלושה מיקרוגרם של RNA ב-13 מיקרוליטר של נפח כולל. ואנחנו מוסיפים 2.5 מיקרו של הוא אקראי בפארקים שלנו.
ואנחנו נדגור על דגימה בשבע וחמש מעלות כדי שיהיה לאופי הרנ"א במשך שמונה דקות. ועכשיו נוסיף את, נוסיף קוקטייל תמלול הפוך המכיל AM L-D-L-D-U-T-P תערובת רציפה, מאגר טרנסקריפטאז הפוך וגם ET TT Big it down ודגירה של הדגימה ב-42 מעלות למשך ארבע שעות. אז אחרי ארבע שעות אנחנו פשוט מוציאים את הדגימות.
ועכשיו בשפופרת יש לנו תערובת CDNA ו-RNA. ומה שאנחנו רוצים לעשות זה לעשות רנ"א הידרוקסיד על ידי הוספת נתרן הידרוקסיד ו-EDTA והריכוז הסופי של נתרן הידרוקסיד צריך להיות מאה טוחנות. והריכוז הסופי עבור e BT צריך להיות חמש טוחנות.
ועכשיו נדגור דגימות באמבט מים של 65 מעלות למשך 10 דקות. אז הדגירה הסתיימה ואנו נשתמש בדגימות על ידי הוספת pH שבע ערימות מים אחת לריכוז הסופי של 500 טוחנות. בשלב זה תוכלו לאחסן את הדגימות במינוס 20 או להמשיך בניקוי.
לניקוי ה-CDNA, אנו משתמשים בערכת טיהור KaiGen PCR. עם זאת, מכיוון שמאגר בוש ומאגר יונים מכילים שחרור, אנחנו לא, אנו מכינים מאגר שיח גורל משלנו ומאגר יוני גורל ואתה תוסיף 300 ליטר PPI ואנחנו נצנר את הבריכה הזו לאט למטה אליך נעביר את התערובת לעמודות ואתה תסתובב במשך דקה אחת במהירות הגבוהה ביותר ותצפה ב, החיץ שהכנו. מאגר שטיפת פוספט, תוסיף 750 מיקרוליטר וכך, ותוסיף עוד אחד לאחד שוב.
אז נסתובב שוב רק כדי לוודא שקיבלנו את כל המיטה. ואנחנו נעביר את הצינורות האלה לצינורות עבריינים ריקים. ואני אוסיף 30 סמנים של מאגר פו פוספט E, שהם ארבעה ארבעה מולאריים של אשלגן פוספט ב-pH 8.5.
וכאן אתה רק צריך לוודא שאתה מוסיף הכל למרכז העמוד ותדגור בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. אז זה יסתובב שוב לדקה אחת ואני אוסיף עוד 30 מיקרו אפס מאגר שאני מדגר או בחדר השינה. אז אני מסיר את העמודה ויש לנו נפח כולל של 60 מיקרו או CDA.
ברגע שננקה את ה-CDNA, אתה יכול, אתה יכול לאחסן אותו במינוס 20 מעלות ואנחנו יכולים גם לייבש אותו ואז לאחסן אותו כדי שנוכל לייבש את ה-CDNA במשוב. אז עכשיו בשפופרת יש לנו CDA יבש, שהשתנה. ומה שנעשה זה להשהות את הדגימה היבשה.
אני אשהה את הדגימה ב-10 טורים של 15 LAR ביקרבונט ב-pH תשע. ואני פשוט אעשה זאת על ידי עלייה וירידה בשלב זה, חשוב מאוד להחיות את ה-cDNA. ובכן, כדי לקנות תגובת תאגיד לעבודה, תגובה זו צריכה להתרחש בחדר החושך מכיוון שתוויות פלואורסצנטיות רגישות למות.
עם זאת, הבחירה באלה ממדעי החיים והם, הם הגיעו בחבילות אישיות. ל-S 5 יש כובע סגול ובצד 3 יש כובע כתום וגם S 5 מופיע שיאון כשהוא מושעה וקארי נראה מג'נטה. אז מה שאני אעשה בחדר חשוך זה שאעביר את הדגימות האלה לתוך שפופרות צבע, אני אשהה מחדש את הצבע ואעביר אותן בחזרה לתוך השפופרת שיש לי.
ואז אני אדגור בחושך במשך שעתיים לאחר שעתיים הדגירה הללו עוצרות את התגובה על ידי הוספת 35 מחדש של מאה מילי-מולרי נתרן אצטט ב-pH 5.2. ואחרי זה ניקינו עם הליך ניקוי דומה. עם זאת, הפעם אנו משתמשים ב-Cajun המסופק מאגר כביסה ומאגר פליטה.
אתה יכול לתאר את המקומות שבהם אתה מכניס את הדגימה וזה אמור לנקות את הכלי. אז אתה יכול את הדגימה שלך או את התערובת שלך עכשיו I To, אז זו הדגימה שלי עם תווית scifi וכאן מה שאנחנו רואים זה OD two 60, שמראה את תוכן ה-CDA ו-OD 6 50, שמראה את שילוב D עבור scifi. והנה דוגמת התוויות הצדדיות שלי.
שוב, טוויסט שישה ריכוז וחמש 50 מדידות אתר שלוש התאגדות. מכיוון שתאגיד D שלי עובד ביעילות, אני אשלב דוגמאות עכשיו, גברת מתגעגעת לזה בקצרה. ועכשיו נכתוב שוב דוגמה באמצעות משוב.
אוקיי, אז לצורך איזציה של המגלשה, נחזיר לחות על ידי הנחת המגלשה באופן אוניברסלי על גבי מים וזה יהפוך את הכתמים לגדולים יותר. ואז כדי להגן על זה, פשוט נייבש במאה מעלות צלזיוס ואז נעבור הכלאה של UV או נחבר את הנקודות לתוך המגלשה ואז נדגור במאגר הגבוה שיש לנו. אז אני מניח את המגלשה עם הפנים כלפי מטה, אבל היא עדיין לא נוגעת במים.
ונחכה ככה חמש דקות. אני, אז הקופסה הזו נראית גדולה יותר, הם צריכים להיות מבריקים יותר מלפני ששמת, ואתה פשוט תייבש על ידי הנחת המגלשה על מאה מעלות ותבחין בעיבוי. ואנחנו נצליב.
אז בשביל לחות, אני פשוט טובל את המגלשה במים שלפני המלחמה. וזה אמור להיות ממש מהיר כי המטרה כאן היא שאתה רוצה להיפטר מכל הכתמים או כל האוליגו במקום שאינו מקושר. ואם אתה הולך לאט בתהליך הזה, אתה פשוט תקבל זנבות במקומות שלך.
אז רק וודא שאתה באמת עושה את זה מהר וודא שאתה לא מוציא את הטיסה שלך מהמים ועושה את הדברים האלה במשך 30 שניות ופשוט מיד בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות ו-700 אוויר אחר הצהריים קבל את זה, אנחנו מכניסים את המגלשה הזו למאגר תחנת הצינור מלפני המלחמה שהיה לנו ולאט לאט דוחפים את המגלשה לתוך הצנצנת ואנחנו נדגור את זה ב-42 מעלות למשך לפחות 45 דקות. אז הנה יש לנו את הדגימה המיובשת שלנו להכלאה. אז קודם כל נשען על ה-Resus במים.
בשלב זה אנחנו פשוט מחזירים את הדגימה למעלה ולמטה ואפשר לא לחשוף את הדגימה לבנה מדי, לבנה. ואז תוסיף DNA זרע של מישהו 1.5 והריכוז הוא 10 מיליגרם למיל. ותוסיף 1.2 משווק של TRNA.
הריכוז הוא 12.5 מיליגרם ל, אנו מוסיפים tRNA ו-DNA זרע כדי לחסום הידרו לא ספציפי. ונוסיף 5.35 סמן אפס שלוש XSSC, שנותן ריכוז סופי של שלושה x. ולבסוף נוסיף 3.5 מיקרוליטר של 1% SDS.
עכשיו נרתיח את התערובת במשך חמש דקות ונסובב במהירות הגבוהה ביותר במשך חמש דקות והיא תהיה מוכנה לקבל את זה. עברה שעה מאז שאנחנו מדגרים את המגלשה שלנו וכרגע יש לי מים ואיזופרופנול. אז אני מערבב את המגלשה במים תחילה כדי להיפטר מ-SDS ואז לשטוף את פרופנול ה-dza שלך ולהכניס ישירות למד הסטנדרטי.
וכאן, רק היזהר שלא תחשוף אור יותר מדי לאוויר כדי למנוע התייבשות. אז אני עובר ישירות ממאגר תחנת הפגיעה למים ואנחנו שוטפים את המגלשה. כמה דקות, רק וודא שהתנועה היא רק למעלה ולמטה, לא לצדדים.
וגם וודאו שהמגלשה לא נמצאת מעל המים ונעביר אותה מיד לאיזופרופנול. וזה פשוט נשאר כאן שוב כמה דקות. והאם הדף שלך יכול בבקשה לענות על הדף שלך בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות?
700 ר.מגניב. אז המגלשה שלנו מוכנה גם להיברידית ועדיף לשמור אותה בקופסת שקופיות כדי להגן עליה מפני האוטובוס. אז לתחנת הקציר נשתמש בהרמה או החלקה.
יש רצועות לבנות על פתק הכיסוי והן יספקו הרמה מסוימת והן יספקו קצת מקום לדגימה שלנו להיכנס בין החלקת הכיסוי למגלשה. ואני מנקה אותו עם אתנול ואז מניח חוט ורק מוודא שאין חלקיק בדיקה. אז ראשית ניקח את שקופית התבנית שלנו שיש לנו אזור הדפסה מסומן, ומעליו נניח את השקופית שהכנו ונוודא שהם מיושרים בצורה מושלמת.
ודא שהם מיושרים בצורה מושלמת. ואתה צריך לוודא שהרצועות בצד, שאנחנו הולכים להתמודד עם זה כלפי מטה. אז זה ממש קשה לראות, אבל ודא שאתה יכול לראות את זה.
והפסים צריכים להיות בצידי המגלשות. ונטען את הדגימה שלנו מהצדדים. אני לוקח כמויות קטנות של דגימה, אז אני לוקח תחילה 15 מיקרוליטר ומתחיל להעמיס מהפינה את תלוש הכיסוי.
ולאט לאט הייתי מושך אותו פנימה ואני פשוט זז לאורך הקצה כדי לכסות את כל האזור. בשלב הזה חשוב מאוד לא להכניס בועות ואני לוקחת עוד 15 מיגר ומורחת אותו על צדי המגלשות כדי למנוע התייבשות. אז המדגם שלנו מוכן ותדגור על המגלשות ותאי התעדוף שלנו, שיש להם תעלות מיקרו כדי להרטיב את המגלשה בזמן שהיא הכלאה.
ונוסיף 10 משווקים של שלושה XSSC לשש פינות של השקופית. היו שישה מקומות על החדר, סליחה, בכל פינה אני, ובכל צד, וודא שאתה מעביר את המגלשה ממש בעדינות כדי שהכיסוי לא יחליק. וכאשר תניח את המגלשה בצד ימין כלפי מעלה, תראה שהיא תיערם, היא תידבק למים ששמת ותשים את המכסה ותוודא שהברגים מהודקים.
אנחנו נדגור את תא השיחה בשקית מים של 65 מעלות, אבל אנחנו לא רוצים לשים אותו ישירות בתחתית. אז פשוט שמנו איזשהו מחסום פלסטיק כדי למנוע מעבר חום עודף. ואנחנו ממקמים את תא האיזון שלנו בעדינות וכדי למנוע כל תזוזה, אתה יכול גם לשים משקל כלשהו.
והדגירה הזו תימשך לילה, בדרך כלל בין 10 ל-12 שעות. אז לשטיפת פרוסה, אנו משתמשים ב-XSSC אחד עם 0.05 אחוז SDS. זה הולך להיות להסרת החלקת הכיסוי.
וזה הולך להיות לשטיפת הצעד הראשון. ואנחנו נעשה עוד שני שלבים רק עם 0.06%6 XSC דרך כל ה-SDS שיש לנו. אז כולנו דופקים את השיחה ואנחנו לוקחים שקופיות ומכניסים אותן עם הפנים כלפי מטה למיכל הארנק.
ואנחנו פשוט ננער אותו מצד לצד ונראה שהחלקת הכיסוי תיפול בעדינות. בסדר, ואנחנו פשוט נעביר למאגר כביסה אחר המכיל XES. אתה אוכל לרגע אחד.
תעבור ל-Oh Six XSSC. ורק כדי לוודא שנפטרנו מכל ה-FDS, נחזור על זה פעם נוספת. הצנטריפוגה לייבוש הייתה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות ב-700 RP. אתה שומר שקופית זו בתיבת השקופיות מכיוון שהיא רגישה לאור.
אז זה סורק שקופיות ואתה תכניס שקופית לכאן, מקום קטן ממש כאן, תניח את השקופית עם הפנים כלפי מטה, מסומנת לכיוון ו, ובשקופית השנייה פשוט תגדיר את האזור שאתה רוצה לסרוק. ואתה פשוט תיקח את האזור הזה בשקופיות שלנו. יש לנו, אנחנו משתמשים ב-16 סיכות כדי להדפיס את השקופיות שלנו.
אז כל בלוק מתאים לסיכה אחת והשקופיות שלנו מכילות למעלה מ-8,000 נקודות. ואנחנו מייצגים את הגנום של צבע vi פעמיים מכיוון שהוא בסביבות 4,000 גנים. אז יש לנו שתי נקודות לכל אוליגו שאנו משתמשים בהן.
ואם אלה מתקרבים, הייתם רואים בניסוי הספציפי הזה, אנו משווים מוטציות מווסתות שעתוק לסוג פראי, ומוטאנטים יסומנו ב-scifi, מה שנותן צבע אדום. וסוג הבר היה אתר שלוש, שנותן צבע ירוק. אז כל דבר שנראה אדום, כמו הכתמים האלה, מצביע על כך ששפע התעתיקים במוטאנט היה גבוה יותר מהסוג הפראי.
אז הם מופיעים באדום או בגוונים של אדום, וכל דבר שנראה ירוק מצביע על כך ששפע התעתיק היה גבוה יותר בסוג הפראי בהשוואה למוטאנטים. וכל נקודה שנראית צהובה מצביעה על כך, שהתעתיק הזה היה נוכח באותה מידה גם במוטאנטים וגם בסוג הפראי. אז כשהם מכסים, הם ייראו צהובים כמו האבל הזה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
ERROR: HTTPSConnectionPool(host='www.jove.com', port=443): Max retries exceeded with url: /v/206/bacterial-gene-expression-analysis-using-microarrays (Caused by NameResolutionError(": נכשל ברזולוציה של 'www.jove.com' ([Errno 11001] getaddrinfo נכשל)"))
Executive Industry Relevance
Microarray-based bacterial gene expression profiling enables high-throughput, quantitative comparison of transcriptomes between wild type and mutant strains, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. Indirect fluorescent labeling minimizes dye bias, increasing predictive confidence in differential gene expression outputs. This workflow underpins robust portfolio triage and informs downstream assay development in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene function and regulatory pathways in bacterial models.
- Supports functional target validation by quantifying transcriptomic changes in response to genetic perturbation.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing direct versus indirect gene regulation effects.
- Provides high-content data for prioritizing targets based on biological relevance.
Screening & Assay Development
- Generates validated gene expression signatures for downstream phenotypic or biochemical screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts essential for assay standardization and benchmarking.
- Enables platform reuse by supporting comparative analyses across multiple strains or conditions.
- Prepares robust biological systems for reliable compound evaluation in early screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns bacterial gene expression profiles with translational biomarker discovery when relevant.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing mechanistic insights.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on quantitative transcriptomic data.
- Strengthens predictive value for downstream functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This microarray workflow integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational data for target validation and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying gene expression changes in defined genetic backgrounds.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs that enable assay readiness and cross-condition comparisons.
- Analytics: Provides high-density, statistically analyzable readouts for robust differential expression analysis.
- Translational Research: Offers mechanistic data that can inform biomarker alignment when extending findings to disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform for repeated use across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of gene expression profiling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, unbiased data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, cDNA synthesis, and microarray hybridization.
- Demands access to fluorescence labeling reagents, microarray scanners, and analytical software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of labeling and hybridization protocols.
- May require adaptation of buffer systems and hybridization conditions for different bacterial models.
- Light sensitivity of dyes and technical handling steps are practical limitations that must be managed.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:24
cDNA synthesis
14:46
Preparation of hybridization sample
8:56
Fluorescent labeling of cDNA
10:09
Determining concentration of fluorescent probe with Nanodrop
24:51
Washing
19:28
Hybridization
28:02
Scanning
11:42
Pre-hybridization
2:02
cDNA purification
0:04
Introduction
