Name: Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 29 min 41 s
Description: למדו פרופיל ביטוי גנים בחיידקים באמצעות שיטת תיוג עקיף ומערכי DNA. השיטה מאפשרת זיהוי הבדלי ביטוי בין זנים פראיים למוטנטים עם דיוק גבוה ואמינות מחקרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

היפוך תגובה transcriptase הפעל לחסום חימום 70-80 מעלות צלזיוס, 42 ° C. אמבטיות מים יכול לשמש גם בשלב זה. אם אתה משתמש חוסם חימום, לשים קצת מים, כך החום הוא אחיד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחול תגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 3 מיקרוגרם של רנ&quot;א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עוצמת הקול μl 13 עם מים חינם RNase </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 2.5 μl של אקראיות hexamer primers (2mg/mL) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב לדגור על 70-80 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות. ואז, במקום על קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו קוקטייל RT (14.5 μl / rxn): <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> נפח </td></tr><tr><td> 5X סטרנד ראשון חיץ </td><td> 6 μl </td></tr><tr><td> 0.1 מ DTT </td><td> 3 μl </td></tr><tr><td> לערבב 25X aminoallyl-dNTP </td><td> 1.2 μl </td></tr><tr><td> עילי ב RT (200U/μl) </td><td> 2.3 μl </td></tr><tr><td> מים </td><td> 2.0 μl </td></tr></tbody></table> * לקבלת תגובות n, להכין מיקס מאסטר עבור n 0.5 aliquots של קוקטייל להבטיח כי אתה לא ייגמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 14.5 לתגובות מקורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים (לא מערבולת) ו לדגור על 42 מעלות צלזיוס במשך 3-4 שעות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C במידת הצורך. </li></ol> Hydrolyze RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי מדגם זה, להוסיף 3 μl של 1 N NaOH ו 0.6 μl של 0.5 M EDTA. (סופי conc.s = NaOH 100mm, 10mm EDTA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל על ידי הוספת 33.6 HEPES 1M μl, pH = 7.0 (הסופי קונצרט כלשהו .= HEPES 500mm) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C, במידת הצורך. </li></ol> טיהור התגובה: הסרת מאוגדים aa-dUTP ו אמינים חינם הערה: פרוטוקול הטיהור הוא שונה מן הפרוטוקול QIAquick Qiagen PCRpurification הערכה. לשטוף את פוספט מאגרים elution מחליפים מאגרים Qiagen מסופק כי מאגרים Qiagen מכילים אמינים חופשי להתחרות עם תגובת הצימוד סיי לצבוע. העמודות מתיק מיני הכנה יכול לשמש גם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים התגובה cDNA עם μl 300 (או נפח תגובה 5X = 336 μl) חיץ PB (Qiagen מסופק) ולהעביר לטור QIAquick. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטור בצינור אוסף 2 מ&quot;ל (Qiagen מסופק) ו - 13,000 צנטריפוגות בסל&quot;ד ~ דקה 1. אוסף שפופרת ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשטוף, להוסיף 750 פוספט μl לשטוף חיץ (לא של Qiagen) לעמודה ו צנטריפוגות בסל&quot;ד 13,000 ~ דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן את צינור איסוף לחזור על לשטוף μl 750 צעד צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן את צינור איסוף צנטריפוגות העמודה 1 דקה נוספת במהירות המרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עמודה צינור חדש mL 1.5 microfuge בזהירות להוסיף 30 חיץ μl elution פוספט. (ראה סעיף פתרון הכנה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דקה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 13,000 ~ דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute בפעם השנייה (עם עוד 30 μl של חיץ elution פוספט) לתוך הצינור אותו על ידי חזרה על שלבים 6-8. נפח elution הסופי צריך להיות ~ 60 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמות cDNA ניתן לכמת בשלב זה: ng cDNA = (גורם לדילול) (OD260) (37) (הנפח הכולל eluted מהעמודה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם יבש במהירות VAC ב 45 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C במידת הצורך. </li></ol> צימוד aa-cDNA לסי אסתר דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend aminoallyl שכותרתו cDNA עם 10 μl pH 50 מ&quot;מ, Na-ביקרבונט = 9.0 במידת הצורך. (זה חוצץ צריכה להיעשות טרי לשבועיים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במקום חשוך, מוסיפים את החללית אל שפופרת של צבע סיי המתאים. Pipet למעלה ולמטה כמה פעמים resuspend לצבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה לשעה 1 בחושך בטמפרטורת החדר. (דגירה יכול ללכת עד שעתיים) </li></ol> טיהור התגובה השנייה: הסרת צבע זוגיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף את תגובת 35 מ&quot;מ μl 100 NaOAc pH 5.2. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl (או נפח תגובה 5X = 225 μl) הצפת PB (Qiagen מסופק) לדגום כל ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טור ספין QIAquick בצינור אוסף 2 מ&quot;ל (Qiagen מסופקת), להחיל את המדגם כדי הטור, ו צנטריפוגות ב ~ 13,000 דקה 1. אוסף שפופרת ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשטוף, להוסיף 0.75 מ&quot;ל הצפת PE (Qiagen מסופק) לעמודה ו צנטריפוגות ב ~ 13,000 דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף שפופרת ריק ועמודה צנטריפוגות במשך דקה 1 נוסף במהירות המרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעמודה מקום צינור נקי mL 1.5 microfuge בזהירות להוסיף 30 הצפת EB μl (Qiagen מסופק) למרכז הממברנה העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דקה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 13,000 ~ דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute בפעם השנייה לתוך הצינור אותו על ידי חזרה עלצעדים 7-9. נפח eluted הסופי צריך להיות ~ 60 μl. </li></ol> ניתוח של תגובת תיוג כמות cDNA ו תווית ניתן לכמת בשלב זה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת OD 260, 550 ו - 650 (בלנק הוא מים.) השתמש בתוכנית microarray nanodrop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב pmol ההתאגדות צבעים ו-DNA ו nuc pmol / צבע יחס עם משוואות כדלקמן: נוקלאוטידים pmol = [OD260 * נפח (μL) * 37 ng / μL * 1000 pg / ng] / 324.5 pg / pmol </li></ul> הערה: 1 OD260 = 37 ng / μL עבור cDNA: 324.5 pg / pmol משקל מולקולרי ממוצע של dNTP) pmol Cy3 OD550 = נפח * (μL) / 0.15 pmol Cy5 OD650 = נפח * (μL) / 0.25 נוקלאוטידים / יחס לצבוע = cDNA pmol / pmol סיי צבע אם אתה משתמש nanodrop, זה כבר נותן pmol / μl עבור כל צבע. אתה רק צריך להכפיל את המספר הזה על ידי היקף לקבל צבע מסך ההתאגדות pmol. הערה:&gt; 150-200 pmol ההתאגדות לכל צבע מדגם יחס של פחות מ -20 נוקלאוטידים / מולקולות צבען הוא אופטימלי עבור הכלאות. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C עם חשיכה. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב בדיקות להיות הכלאה יחד ויבש למטה speedvac ב 42 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד מוכן hyb. </li></ul></li></ul> קדם שקופיות hyb <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק מטה על פני המקום RT 100 מ&quot;ל מים מחזיק שקופיות נקי אדום עבור 3-5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד יבש השקופית ידי הצבת להתמודד על בלוק 100 מעלות צלזיוס חימום למשך כמה שניות - להיזהר עיבוי להיעלם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> UV צולבות הקישור לשקופית ב 250 mJoules (הזן 2500 כדי crosslinker UV) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מימה ידי טבילה מראש חיממו מים 42 מעלות צלזיוס. ספין 5 דק &#39;ב 700 סל&quot;ד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות דגירה בצנצנת המכילה 50 מ&quot;ל Coplin מראש חימם מראש hyb (5XSSC, BSA 1%, 0.1% SDS) לפחות 45 דקות @ 42 ° C, ו הדגירה יכול להימשך זמן רב יותר במידת הצורך. 50 מ&quot;ל חיץ מראש hyb: 12.5 מ&quot;ל 20x SSC, 10 מ&quot;ל BSA 5%, 0.5 מ&quot;ל SDS 10%, 27 מ&quot;ל מים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים מגלשות מים מראש התחמם (42 ° C) להתסיס כמה דקות כדי להסיר מראש hyb חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף ב isopropanol ספין 5 דקות על 700 סל&quot;ד, טמפ &#39;החדר, להתייבש. </li></ol> דגימות הכנה הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקה Resuspend במים (כרכים הם כדלקמן) <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> במשך כרך הכולל. = 30μl </td><td> במשך כרך הכולל. = 35μl </td><td> עבור סך כרך .= 40μl </td><td></td></tr><tr><td> 19.8 μl מים </td><td> 23.55 μl מים </td><td> 27.2 μl מים </td><td> </td></tr><tr><td> 1.5 μl </td><td> 1.5 μl </td><td> 1.5 μl </td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​זרע סלמון DNA (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1.2 μl </td><td> 1.2 μl </td><td> 1.2 μl </td><td> 12.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​tRNA </td></tr><tr><td> 4.5 μl </td><td> 5.25 μl </td><td> 6 μl </td><td> 20XSSC (סופי 3X) </td></tr><tr><td> 3 μl </td><td> Μl 3.5 </td><td> 4 μl </td><td> 1% SDS </td></tr></tbody></table> הערה: הסדר של תוספת של חומרים כימיים חשובים. אין להכין תערובת מאסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסתובב 5 דקות ב 14,000 סל&quot;ד. מגניב 2 דקות על טמפ החדר. </li></ol> הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10-12 μl של 3X SSC אל הבארות של החדר הכלאה על קצה כל באמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת להחליק מרים נקי לאזור המתאים של השקופית בעדינות לטעון פתרון הכלאה (30 -40 μl). לא צריך להיות מדגם נוסף על קצה אחד להחליק את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החלק בתא. הדקו את הברגים ומניחים אמבטיה 65 מעלות צלזיוס מים למשך הלילה. אין למקם את חדר ישירות על תחתית האמבטיה במים. מניחים בלוק על גבי תא עליון להחזיק הכל במקום. שמור את המכסה על אמבט מים כדי להגן על דגימות רגיש לאור. </li></ol> Hyb רוחצת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החוצצים הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X SSC, SDS 0.05% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.06 X SSC </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קאמרית הכלאה unseal הדגירה. הסר את השקופית מן החדר, נזהרת שלא להפריע coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר coverslips, מגלשות לצלול בצלחת המכילה חם 1X SSC, 0.05% SDS coverslip לשטוף חיץ מול התחתון של המנה. Coverslip תיפול על ידי הזזת לצד שקופית לצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר coverslip מוסר, במקום להחליק במעמד אמבטיה חמה עם טרי 1XSSCm SDS 0.05%. להתסיס במשך כמה דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות בתוספת מתלה לאמבטיה של 0.06 X SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות תואר ראשון אחרה של 0.06 X SSC המכיל מתלה טריים, סופג את השקופית על מגבת נייר כדי להסיר כמה SDS המכילים חיץ ככל האפשר לפני הצבת באמבטיה טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתסיס שקופיות במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מיד בטמפרטורת החדר למשך 5 דק &#39;700 סל&quot;ד @, אז שקופיות מוכנים לסריקה. חנות בחושך עד סרוקות. </li></ol>

<ol><li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays+%26+TIGR+Microarray+Labeled+Probe+Hybridization%22%5BJournal%5D)">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.</li>
<li>Gilbert,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+%26+Hybridization+of+probed+labels%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Hedge,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , Forthcoming.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AA-dUTP</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0410</td><td>5-(3-aminoallyl)-2&amp;rsquo;deoxyuridine-5&amp;rsquo;-triphosphate</td></tr><tr><td>dNTP</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2035-01</td><td>סט dNTP בריכוז 100 mM בדרגת PCR</td></tr><tr><td>Random Hexamer primers</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2166-01</td><td>3mg/mL</td></tr><tr><td>SuperScript III RT</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>80800444</td><td>200U/&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>CyDye&amp;#8482;</td><td></td><td>Amersham</td><td>RPN5661</td><td>ערכת צבעים ריאקטיביים לסימון לאחר התגובה (Post-Labelling Reactive Dye Pack)</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>ערכה לניקוי PCR</td></tr><tr><td>1 M K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KPO4</td><td>בופר</td><td></td><td></td><td>להכנת בופר פוספט 1M (KPO4, pH 8.5-8.7) יש לערבב: 9.5 mL של 1M K2HPO4 ו-0.5 ml של 1M KH2PO4</td></tr><tr><td>Phosphate wash buffer</td><td>בופר</td><td></td><td></td><td>עבור 100 mL של בופר שטיפה פוספטי (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) יש לערבב: 0.5 ml של 1 M KPO4 ב-pH 8.5 + 15.25 mL מים מזוקקים (MilliQ) + 84.25 mL אתנול 95%. בופר השטיפה יהיה עכור מעט. ** חשוב: יש להכין את בופר השטיפה הפוספטי מדי יום.</td></tr><tr><td>Phosphate elution buffer</td><td>בופר</td><td></td><td></td><td>דילול של 1 M KPO4, pH 8.5 לריכוז של 4 mM באמצעות מים סטריליים</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer</td><td></td><td></td><td></td><td>(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. המיס 4.2 g של NaHCO3 ב-80 mL של מים סטריליים וכוונן את ה-pH ל-9.0 באמצעות 10 N NaOH; השלם את הנפח ל-100 mL באמצעות מים סטריליים. להכנת תמיסה של 50 mM עבור תגובת צימוד הצבע, יש לדלל ביחס של 1:10 במים. הערה: הרכבו של בופר הקרבונט משתנה עם הזמן; יש להכינו מחדש מדי שבועיים עד חודש.</td></tr></tbody></table>

gene expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

שלום, שמי אנה ואנו מבצעים באופן שגרתי פרופיל ביטוי גנים במעבדה. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לנטר גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי בין meth לסוג הפרא (wild type). כיום יש בידיי דגימות RNA של סוג פרא ושל meth, ואנו נבצע תחילה C.אנו משתמשים בשיטות סימון עקיפות, והיתרון של טכניקה זו הוא מניעת הטיות של הצופה שעלולות להתרחש בסימון ישיר. לשם כך, אנו משתמשים בדגימות RNA, כאשר אנו שואפים להשיג 3 µg של RNA בנפח כולל של 13 µL. אנו מוסיפים 2.5 µg של random hexamers לתערובת.נדגירה של הדגימה בטמפרטורה של 75°C למשך שמונה דקות כדי להדnaturize את ה-RNA. כעת נוסיף את תערובת ה-reverse transcription הכוללת AM L-D-L-D-U-T-P continu mix, בופר reverse transcriptase וכן ET TT, נערבב באמצעות vortex ונדגיר את הדגימה ב-42°C למשך ארבע שעות. לאחר ארבע שעות נוציא את הדגימות.כעת יש לנו במבחנה תערובת של cDNA ו-RNA. כעת נבצע הידרוליזה של ה-RNA על ידי הוספת נתרן הידרוקסיד ו-EDTA, כאשר הריכוז הסופי של נתרן הידרוקסיד צריך להיות 100 mM והריכוז הסופי של EDTA צריך להיות 5 mM.כעת נדגרי את הדגימות במקלח מים בטמפרטורה של 65 °C למשך 10 דקות. כעת, לאחר שהדגירה הסתיימה, נשתמש בדגימות על ידי הוספת HEPES pH 7 במים עד לריכוז סופי של 500 mM. בשלב זה ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20 °C או להמשיך לשלב הניקוי.לניקוי ה-CDNA, אנו משתמשים בערכה לטיהור PCR של KaiGen. עם זאת, מכיוון ש-Bush buffer ו-ion buffer מכילים פנול, אנו מכינים בעצמנו phosphate bush buffer ו-phosphate ion buffer; יש להוסיף 300 µL של PPI ולהעביר זאת באיטיות באמצעות פיפטה. לאחר מכן, העבירו את התערובת לעמודות וסובבו במשך דקה במהירות המקסימלית. השתמשו בבופר השטיפה שהכנו, Phosphate wash buffer; הוסיפו 750 µL, ולאחר מכן הוסיפו כמות נוספת וסובבו שוב למשך דקה.לכן נסבב שוב כדי לוודא שכל התוכן שקע. ואנו נעביר את המבחנות הללו למבחנות Eppendorf ריקות. ואוסיף 30 µL של phosphate buffer E, שהוא 40 mM של אשלחן פוספט ב-pH 8.5.כעת עליכם לוודא שאתם מוסיפים את הכל למרכז העמודה, ותדגרו בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לכן, המכשיר יסבב שוב למשך דקה אחת, ואני אוסיף עוד 30 µL של באפר. אני מדגירה בטמפרטורת החדר. כעת אני מסירה את העמודה, ויש לנו נפח כולל של 60 µL של CDA.לאחר ניקוי ה-CDNA, ניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של 20- מעלות, או לייבש אותו ולאחר מכן לאחסנו, כך שניתן לייבש את ה-CDNA ב-feedback. כעת יש לנו במבחנה CDNA יבש, אשר עבר מודיפיקציה. כעת אסחף את הדגימה היבשה ב-.אשעה את הדגימה ב-10 µL של 15 mM ביקרבונט ב-pH 9. אעשה זאת על ידי פיפטאژ מעלה ומטה; בשלב זה, חשוב מאוד לערבב היטב את ה-cDNA כדי שתגובת ה-incorporation תעבוד. תגובה זו צריכה להתבצע בחדש חשוך, מכיוון שתוויתים פלואורסצנטיים רגישים לאור.עם זאת, הבחירה באלו ממדעי החיים פירושה שהם הגיעו באריזות בודדות. ל-S5 יש פקק סגול ול-S3 יש פקק כתום; כמו כן, S5 נראה בצבע ציאן כאשר הוא מתמוסס ו-Cary נראה בצבע מגנטה. לכן, מה שאעשה בחדר חשוך הוא להעביר את הדגימות הללו למבחנות צבע, לתלה את הצבע מחדש ולהעבירם בחזרה למבחנה שברשותי.לאחר מכן אדגיר בחושך למשך שעתיים. לאחר דגירה של שעתיים, אעצור את התגובה על ידי הוספת 35 µL של נתרן אצטט בריכוז 100 millimolar ב-pH 5.2. לאחר מכן ביצענו ניקוי באמצעות הליך ניקוי דומה. עם זאת, הפעם השתמשנו בתמיסות השטיפה והאלוציה שסופקו על ידי Qiagen.ניתן לתאר את המקומות שבהם מניחים את הדגימה ואת התהליך שנועד לנקות את המכשיר. לכן, ניתן להכניס את הדגימה או את התערובת כעת. זוהי הדגימה שלי המסומנת ב-scifi, וכאן אנו רואים OD 260, המעיד על תכולת ה-CDA, ו-OD 650, המעיד על שילוב ה-D עבור scifi. וכאן נמצאת הדגימה המסומנת ב-side 3.שוב, סבבו שש ריכוזים וחמש מדידות של 50 באתר שלוש שילוב. מכיוון שתאגיד D שלי עובד ביעילות, אשלב דגימות כעת, ערבבו אותן בקצרה. וכעת נכתוב דגימה שוב באמצעות משוב.בסדר, כדי להכין את השקופית, נבצע רהידרציה על ידי הנחת השקופית על פני מים, מה שיהפוך את הכתמים לגדולים יותר. לאחר מכן, כדי להגן על כך, נייבש במהירות בטמפרטורה של 100 °C, ולאחר מכן נבצע היברידיזציית UV או קישור צלב (cross link) באמצעות UV של הכתמים לשקופית, ואז נדגור בבופר הפרה-היברידיזציה שברשותנו. אני מניח את השקופית כשהפנים כלפי מטה, אך היא עדיין לא נוגעת במים.נמתין כך למשך חמש דקות. קופסה זו נראית גדולה יותר, הם צריכים להיות מבריקים יותר מאשר לפני שהנחתם, ותייבשו זאת במהירות על ידי הנחת השקופית בטמפרטורה של 100 °C ותבחנו אם קייב קונדנסציה. ולאחר מכן נבצע קישור צולב (cross link) באמצעות youi.לצורך הידרציה, אני פשוט אטבול את השקופית במים חמימים. פעולה זו צריכה להיות מהירה מאוד, מכיוון שהמטרה כאן היא להסיר את כל הכתמים או את כל האוליגונוקלאוטידים בכתם שאינם מקושרים. אם תבצעו את התהליך הזה באיטיות, תיווצר לכם "זנבות של שביטים" (com tails) על הכתמים שלכם.לכן, ודאו שאתם מבצעים זאת במהירות, והקפידו לא להוציא את הדגימה מהמים. בצעו זאת במשך 30 שניות, ולאחר מכן המתינו מיד בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות ב-700 rpm. כעת, נכניס את השקף לתמיסת הבאפר להרטבה מוקדמת שהכנו, נדחף את השקף לאט אל תוך הצנצנת, ונדגיר זאת ב-42 °C למשך 45 דקות לפחות. כאן יש לנו את הדגימה המיובשת להibrדיזציה. תחילה נבצע השהיה (resuspend) במים.בשלב זה נבצע רק ריסוף על ידי העלאה והורדה של הנוזל, ויש להימנע מחשיפת הדגימה לאור. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 µL של DNA של זרע אדם בריכוז של 10 mg/ml, והוסיפו 1.2 µM של tRNA.הריכוז הוא 12.5 milligram per, אנו מוסיפים tRNA ומספר דגימות של DNA של זרע כדי לחסום היברידיזציה לא ספציפית. אנו מוסיפים 5.35 marker zero three XSSC, דבר המביא לריכוז סופי של 3x. ולסיום, אנו מוסיפים 3.5 µL של 1%SDS.כעת נרתיח את התערובת למשך חמש דקות ונסחרר במהירות המקסימלית למשך חמש דקות, ואז הדגימה תהיה מוכנה. עברה שעה מאז דגירה של השקף, וכעת יש לי מים ואיזופרופנול. לכן, אטלטל את השקף תחילה במים כדי להסיר את ה-SDS, לאחר מכן אשטוף באיזופרופנול ואעבירו ישירות למסגרת הסטנדרטית.וכאן, רק היזהרו שלא לחשוף את הדגימה לאוויר יותר מדי כדי למנוע התייבשות. לכן אני עובר ישירות מתוך תמיפת ה-harm station buffer אל המים ושוטף את השקופית. למשך מספר דקות, רק ודאו שהתנועה היא רק למעלה ולמטה, ולא לצדדים.כמו כן, ודאו שהשקף אינו טבול במים והעבירו אותו מיד לאיזופרופנול. השאירו אותו שם למשך מספר דקות נוספות. לאחר מכן, נא להמתין בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.700 R.Cool. כך שגם השקופית שלנו מוכנה להיברידיזציה, ומומלץ לשמור אותה בתיבת שקופיות כדי להגן עליה מפני אבק. עבור תחנת הקצירה נשתמש ב-lift או ב-slip.ישנם פסים לבנים על לביבת הזכוכית (cover slip), שיספקו גובה מסוים ויאפשרו מרחב לדגימה שלנו להיכנס בין לביבת הזכוכית לבין השקופית. אני מנקה זאת בעזרת אתנול ואז מניח את הרשת, תוך כדי וידוא שאין חלקיקים זרים. ראשית, ניקח את שקופית התבנית שבה מסומן אזור ההדפסה, ומעליה נניח את השקופית שהכנו ונוודא שהן מיושרות באופן מושלם.וודאו שהם מיושרים באופן מושלם. עליכם לוודא שהפסים נמצאים בצד, שכן אנו נניח אותו הפוך. קשה מאוד לראות זאת, אך וודאו שאתם מצליחים להבחין בהם.הפסים צריכים להיות בצדדי השקופיות. אנחנו נטען את הדגימה שלנו מהצדדים. אני לוקחת כמויות קטנות של דגימה, כך שאני לוקחת 15 µL תחילה ומתחילה בטעינה מהפינה של זכוכית הכיסוי.אמשוך זאת באיטיות ואנוע לאורך השפה כדי לכסות את כל השטח. בשלב זה חשוב מאוד לא להכניס בועות, ואני לוקח 15 µl נוספים של מיגטור (migrator) ומחיל אותם לצדי השקופיות כדי למנוע התייבשות. כעת הדגימה שלנו מוכנה, ואת השקופיות נדגרי בתוך תאי תעדוף, הכוללים מיקרו-תעלות להגיית השקופית בזמן ההכלה (hybridization).נוסיף 10 מיקרומטר של 3X SSC לשש פינות של השקופית. היו שש נקודות בתא, סליחה, בכל פינה ובכל צד. ודאו שאתם מעבירים את השקופית בעדינות רבה כדי שהזכוכית המכסה לא תחליק. כאשר תניחו את השקופית בצורה ישרה, תראו שהיא תיצמד למים שהוספתם, והניחו את המכסה. ודאו שהברגים מהודקים.נדגרי את תא השיחה בשק מים בטמפרטורה של 65 °C, אך איננו רוצים להניח אותו ישירות על התחתית. לכן, נניח סוג של מחסום פלסטיק כדי למנוע מעבר חום מופרז. נמקם את תא האיזוציה בעדינות, וכדי למנוע כל תזוזה, ניתן להניח סוג של משקולת.דגירה זו תימשך לילה שלם, בדרך כלל בין 10 ל-12 שעות. לשטיפת הפרוסות, נשתמש ב-1X SSC עם 0.05% SDS. שלב זה נועד להסרת זכוכית הכיסוי.זה ישמש לשטיפה בשלב הראשון. נבצע שני שלבים נוספים עם 0.06%six XSC בלבד, דרך כל ה-SDS שיש לנו. לאחר מכן נסיים את התהליך, ניקח את השקופיות ונניח אותן כשהצד הפונה כלפי מטה בתוך המיכל.נסלק אותו מצד לצד ונראה שהכיסוי יסתיר את עצמו וינשור בעדינות. כעת, נעביר אותו למסיינא של תמיסת שטיפה אחרת המכילה XES. נמתין למשך דקה אחת.עברו לשלב שש ב-XSSC. ורק כדי לוודא שהסרנו את כל ה-FDS, נחזור על הפעולה פעם אחת נוספת. סובבו בצנטריפוגה לייבוש בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות ב-700 RP. שמרו את השקופית הזו בקופסת השקופיות כיוון שהיא רגישה לאור.זהו סורק שקופיות, והשקופית תוצב כאן, בחלל הקטן הזה, כאשר הפנים פונה כלפי מטה והתווית פונה כלפי חוץ. ובשקופית השנייה תגדירו את האזור שברצונכם לסרוק. נבחר את האזור הזה בשקופיות שלנו; אנו משתמשים ב-16 פינים להדפסת השקופיות שלנו.כך שכל בלוק תואם לפין אחד, והשקופיות שלנו מכילות למעלה מ-8,000 נקודות. אנו מייצגים את הגנום של vi color פעמיים כיוון שישנם כ-4,000 גנים. לכן, ישנן שתי נקודות עבור כל אוליגו שבו אנו משתמשים.ואם נבצע זום, תוכלו לראות שבניסוי ספציפי זה, אנו משווים מוטנטים של רגולטורי תעתוק לסוג בר (wild type), כאשר המוטנט סומן ב-scifi, שמעניק צבע אדום. הסוג בר סומן ב-site three, שמעניק צבע ירוק. לכן, כל דבר שנראה אדום, כמו הנקודות הללו, מעיד על כך ששכיחות התעתוקים במוטנט הייתה גבוהה יותר מאשר בסוג בר.לכן הם נראים באדום או בגווני אדום, וכל דבר שנראה בירוק מעיד על כך ששפע התמלול היה גבוה יותר בסוג הפרא בהשוואה למוטנט. וכל נקודה שנראית בצהוב מעידה על כך שהתמלול היה נוכח במידה שווה הן במוטנט והן בסוג הפרא. לכן, כאשר הם חופפים, הם ייראו צהובים כמו הנקודות הללו.

bacterial-gene-expression-analysis-using-microarrays

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים שיטה להפקת cDNA מ-mRNA הסביבה. באופן כללי, הכולל RNA נאסף הראשון הסביבה, rRNA מוסר סלקטיבי, mRNA מוגבר באופן סלקטיבי, ועל cDNA מסונתז ממאגר mRNA מועשר הוא רצף. רצפים ששוחזרו ניתן להוסיף הערות באמצעות תקן טכניקות ביואינפורמטיקה כדי לזהות את הגנים לידי ביטוי.

ניתוח ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאלית ימית באמצעות Transcriptomics הסביבה

Microarrays ג'ין הם כלים רבי עוצמה באפיון ביטוי גנים ברמת הגנום כולו. טכנולוגיה זו יישומים במגוון רחב של תחומים לרבות ביולוגי ביולוגיה התפתחותית הרעלים. בסרטון הזה, אנחנו פרט פרוטוקול ניתוח ביטוי גנטי גלובלי באמצעות פלטפורמה מקיפה microarray oligonucleotide על דג הזברה.

Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide

בפרוטוקול זה, הגן ביטוי שמרים...

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

ניתוח microarray נערך כדי לקבוע פרופילים של ביטוי...

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

כתב יד זה מתאר את השימוש בטכנולוגיה חדישה המסופקת על ידי מיקרו-מערכי DNA. מיקרו-מערכים מספקים סקירה כללית של השינויים הטרנסקריפטומיים בחיידקים שנגרמו בתנאי מסוים. יתר על כן, אנו מדגישים את הקלות שבה ניתן לנתח כמויות גדולות של נתונים באמצעות חבילות תוכנה נוחות שפותחו בבית.

צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני Serine תלויה ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

פיתחנו פרוטוקול מהיר, רגיש וניתן לשחזור לפרופיל ביטוי גנים פתוגני במהלך זיהום.

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

המתוארים כאן היא שיטה לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים ברמה התאית. שיטה זו מספקת משאב ללמוד את הגיוון פנוטיפי המתרחשים בתוך אוכלוסיה חיידקי בתגובה הסביבה רקמות במהלך זיהום.

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

הליך זה מתאר כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ואחריו transfection באמצעות Pulser ג'ין מערכת MXCell electroporation.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 1 מתוך 3.

Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1

למדו פרופיל ביטוי גנים בחיידקים באמצעות שיטת תיוג עקיף ומערכי DNA. השיטה מאפשרת זיהוי הבדלי ביטוי בין זנים פראיים למוטנטים עם דיוק גבוה ואמינות מחקרית.

Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

גלה סרטונים נוספים