ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

ביטוי של רפורטרים פלואורסצנטיים בבעלי חיים טרנסגניים מאפשר מעקב אחר תגובות תאיות למניפולציות ניסוייות במודלים חיים של מחלות. כאן, אובדן תאים סלקטיבי מושג באופן פרמקולוגי בדגי זהב, תוך שימוש בדימות קונפוקאלי רב-צבעי ברזולוציה גבוהה. תמונות של התאים המטרים ושכניהם המיידיים נרכשות לפני, מיד אחרי, ובמרווחי זמן קבועים לאחר הטיפול התרופתי. ניתוח התמונות מדגים את הפעלתם של אוכלוסיות תאי גזע אנדוגניות ואת החלפתם העוקבת של התאים המטרים במהלך שלב ההחלמה.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הרגנרציה, כגון מהם המנגנוים התאיים והמולקולריים המשמשים לרגנרציה של סוגי תאים מובחנים. התחל בהעברת ביצים טרנסגניות שנאספו מהזיווגים לצלחית פטרי המכילה 0.3 x danio solution ב-16 שעות לאחר ההפריה. הוסף PTU כדי לעכב את פעילות ה-tyrosine ACE לפני הופעת כל עדות לפיגמנטציה ברקמה הרלוונטית. אם העובר אינו אלבינו, דגרי את העוברים ב-28.5 degrees Celsius.

ברגע שהחלבונים המדווחים (reporters) ניכרים, הניחו את צלחת הפטרי תחת מיקרוסקופ סטריאו-זום פלואורסצנטי ומיינו את העוברים לפי ביטוי הגן החוצה (transgene) הרצוי. לפני הצילום, הכינו תמיסת קיבוע aeros בריכוז 0.5% low melt בתוך מדיום לעוברים ואחסנו אותה בטמפרטורה של 40 °C.

הוסיפו trica ו-PTU במידת הצורך. ערבבו בעדינות והחזירו ל-40 degrees Celsius. הרדימו את הדגים על ידי הנחתם בתוך תווך עוברים המכיל trica.

במשך כשלוש דקות, הדגים יהיו חסרי תגובה. כדי להעבירם באמצעות מיקרופיפטה, שאבו דגים בודדים לתוך קצה פיפטה קצוץ בנפח של כ-30 microliters של תמיסת אלחוש.

געו עם הקצה בתמיסת הקיבוע ואפשרו להם לעבור באמצעות כוח הכבידה. היזהרו לא לדלל את ה-agro כדי שניתן יהיה להשתמש בו שוב. השליכו את שארית תמיסת האלחוש מהמיקרופיפט.

לאחר מכן, באמצעות אותה טיפ, העבירו את הדג לצלחת פטרי. בכ-30 microliters של תמיסת קיבוע, כווןו בעדינות את הדג כך שהאזור הנבדק יהיה ממורכז בטיפת ה-aeros. ודאו שהדג נשאר בכיוון הרצוי עד שה-aeros מתמצק.

ניתן לקבע מספר דגים בצלחון פטרי בודד במידת הצורך. לאחר שה-aeros התמצק, העבירו את הדגים לבמה של המיקרוסקופ הקונפוקאלי והוסיפו בעדינות לצלחון תמיסת גידול לעוברי דגים המכילה trica עם או בלי PTU, עד שהדגים טבולים לחלוטין. פתחו את תוכנת ההדמיה ובצעו פוקוס על אזור העניין כדי להשיג הדמיה אופטימלית של פרטים תאיים ו/או מולקולריים.

השתמשו בעדשות עם מרחק עבודה ארוך וממספרים נומריים גבוהים בתוכנה. בחרו את הגדרות הפלואורסצנציה המתאימות מרשימת הבחירה. לחצו על הגדרות ספקטרליות ובצעו התאמות בטווחי הפליטה.

כדי להשיג הפרדה נקייה של אותות הדיווח ולמקסם את יחס אות לרעש, בחרו את העדשה המתאימה בתפריט הנפתח כדי להבטיח שכל הגדרות המערכת (presets) המוגדרות בתוכנה יותאמו כראוי. כדי למקד את הלייזרים ולקבוע את רמות ההספק, בחרו פלט מטבלת הערכים (lookup table) שחושף רוויית פיקסלים עבור כל ערוץ.

בשלב הבא, הגדירו את רגישות הגלאי כדי להשיג את איכות התמונה הרצויה, והעלו בהדרגה את הספק הלייזר עד שאינטנסיביות התמונה תהיה מקובלת. הימנעו מרוויה של פיקסלים באזור העניין ושמרו על רמות לייזר נמוכות ככל האפשר, כדי לצמצם בעיות של פוטו-בליச்சிנג (photobleaching) ופוטוטוКСיות.

יש לוודא שכל קו לייזר מייצר אות גילוי רק בערוץ המתאים, על ידי הדלקה וכיבוי ידנית של הלייזרים תוך ניטור של כל ערוצי הדימות. אם לא נצפה crosstalk, ניתן לרכוש את כל הערוצים בו-זמנית. לאחר מכן, יש למסגר את תחום העניין באמצעות פונקציות הזום והסיבוב.

לאחר מכן, קבעו את מהירות הסריקה וגודל התמונה; מהירויות סריקה גבוהות יותר ממזערות את זמן השהייה של הלייזר ומגבירות את הרזולוציה הטמפורלית. הגדירו את גודל הצעד של ממד ה-Z בהתאם לצרכים הניסיוניים. במקרה זה, נעשה שימוש בגודל צעד של 10 microns כדי לדמות שבעה חתכים אופטיים של רקמת רשתית.

לאחר שנקבעו ההגדרות המתאימות, רכשו תמונות Zack ושמרו אותן. לאחר מכן עברו לדג הבא. ניתן לבצע דימות סדרתי של לכידה ושחרור כדי לעקוב אחר שינויים תאיים לאורך ימים רצופים, בהתאם להוראות במסמך הכתוב המצורף.

בעת ביצוע ניסוי של דימוי עם מספר רב של רפורטרים, מומלץ להשתמש בפלואורופורים המופרדים היטב ספקטרלית, אך הדבר אינו תמיד מעשי. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה של חיסור תמונות באמצעות התוכנה בקוד פתוח ImageJ, כדי להפריד בין פלואורופורים בעלי פרופילים חופפים של עירור ופליטה. במקרה שלנו, GFP ו-YFP.

טכניקות הדימיון לאורך זמן המתוארות בסרטון זה שימשו למעקב אחר תאי גזע רטינליים המסומנים ב-GFP במהלך אבלציה ורגנרציה של נוירוני ביפולר רטינליים. כדי לבצע הפרדה ספקטרלית, אספו תמונות באמצעות מצבי דימיון סדרתיים והגדרות מסנני מחסום משתנים, המאפשרים רכישה עצמאית של פלואורופורים חופפים והפרדה חלקית שלהם, בהתאמה. לאחר רכישת התמונות, השתמשו בתוסף ה-loci bio formas של ImageJ כדי לפתוח את קובצי התמונה ולהפעיל את כלי הייבוא. גררו את הקובץ הרלוונטי אל חלון ה-ImageJ.

פצלו את הערוצים למערכות תמונות (stacks) נפרדות באמצעות סימון תיבת הבחירה split channels בחלון הייבוא כדי להתחיל בתוסף align three TP. לחצו על plugins, לאחר מכן על align stacks, ואז על align three tp.

יש ליישר את הערימות כדי להבטיח חיסור תקין. בחרו את ערימת הייחוס בתיבת הבחירה הראשונה ואת הערימה שאינה מיושרת בשנייה. סמנו את תיבות use XY relative origin ו-use Z relative origin ולחצו על okay.

כדי להתחיל בתהליך היישור, לחצו על כפתור רישום הנפחים (volume registration). יופיע חלון חדש המכיל את פרמטרי היישור. לחצו על אישור.

סעיף זה עבר אופטימיזציה על ידי מפיץ התוסף, כך שאין צורך בביצוע שינויים. עם הסיום, יופיע חלון של ערימות מיושרות. בחר את הפלט מהחלון המיושר כדי לפתוח את חלון הפלט.

חלון זה מותאם באופן מיטבי ואינו דורש שינויים. לחצו על אישור (okay). ערימה חדשה תופיע בסביבת העבודה עם המילה aligned המתווספת לסוף כותרת הקובץ.

כדי להסיר crosstalk באמצעות מחשבון תמונות (image calculator), לחצו על process ולאחר מכן על image calculator. בחרו בתפריט הנפתח של image one את ה-stack שיש להפחית ממנו, ואת ה-stack שישמש להפחתה בתפריט הנפתח של image two. בתיבת הבחירה של operation, בחרו ב-subtract ולחצו על okay.

Image J יבקש לעבד את ה-stack. בחרו ב-yes. stack חדש אמור להופיע, שבו הוסרה השפעת ה-crosstalk בין הערוצים החופפים.

מזגו את הערימות כדי לשחזר את מבנה התמונה המקורי לפני היישור וההפחתה. באמצעות בחירת ערוצים ממוזגים בחלון כלי הערוצים, מאפשר הכלי מיזוג של עד ארבע ערימות להיפר-ערימה (hyper stack). לבסוף, צבעו את הערוצים, התאימו את הבהירות והניגודיות ושמרו את הקבצים כ-tiffs כדי לבחון את האובדן הממוקד וההתחדשות של nitro reductase.

תאי ביפולר רטינליים המבטאים M cherry. סדרת תמונות קונפוקאליות צולמו בדגי zebrafish בודדים לפני הטיפול. קיימת ביטוי פסיפס של רפורטר YFP המסומן לממברנה בתאי ביפולר בקרה המוצגים בצהוב, וחלבון חיבור של ניטרו-רדוקטאז ו-cherry בתאי ביפולר המטרה המוצגים באדום.

הטרנסגן CFP המסומן בממברנה ומוצג בצבע ציאן מספק מידע הקשרי על רוב תאי הרשתית האחרים לצורך בהירות נוספת. אותה תמונה ללא אות ה-CFP מוצגת לאחר טיפול במטרונידזול. תאי הביפולר המבטאים ניטרו-רדוקטאז בצבע אדום אובדים, בעוד שתאי הביפולר שבקבוצת הביקורת בצבע צהוב נשמרים.

דבר זה מדגים את האופי הספציפי מאוד של מתודולוגיית האבלציה הזו. שוב, אותה תמונה ללא CFP מוצגת לצורך בהירות. כאשר metro NIAZ מוסר, תאים המבטאים NTR חוזרים לכאן.

דוגמה לשיטת החסרת G-F-P-Y-F-P מוצגת באיור זה GFP labeled Mueller. תאי GL מוצגים בירוק ותאי bipolar המסומנים ב-YFP מוצגים בסגול. חפיפה בין השניים יוצרת צבע לבן לצורך ביצוע החסרה.

ראשית יש לבצע יישור של תמונות ה-GFP וה-YFP. תהליך ההפחתה מאפשר לאחר מכן להסיר את התאים הבי-פולריים המסומנים ב-YFP מתמונת ה-GFP, ובכך להציג בצורה נקייה את תאי המילר המסומנים ב-GFP ולאתר תאי מילר עמומים יותר. כעת ניתן לאמת את החפיפה בין תאי מילר עמומים לבין תאים בי-פולריים המסומנים ב-M cherry המוצגים בצבע אדום.

הנתונים המוצגים כאן מצביעים על כך שכיבוי של תאי בופולריים מעורר את תאי המולר להחליף את התאים שאבדו. פרשנות זו עולה בקנה אחד עם מחקרים עדכניים על התחדשות הרשתית, המצביעים על תאי מולר כפרוגניטורים המושרים על ידי פגיעה, הן ביונקים והן בדגים. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון מנגנונים המווסתים את התחדשותם של סוגי תאים ספציפיים באמצעות ויזואליזציה של תאי גזע בדגי זברה.