ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

ביטוי של מדווחים פלואורסצנטיים בבעלי חיים טרנסגניים מאפשר לעקוב אחר תגובות תאיות למניפולציות ניסיוניות במודלים של מחלות חיות. כאן, אובדן תאים סלקטיבי מושרה פרמקולוגית בדגי זברה, קונפוקל רב צבעוני ברזולוציה גבוהה. תמונות של התאים הממוקדים והשכנים המיידיים נרכשות לפני מיד לאחר מכן, והמרווחים המרווחים לאחר ניתוח תמונות הטיפול התרופתי מדגימים את ההפעלה של אוכלוסיות תאי גזע אנדוגניים והחלפה לאחר מכן של תאים ממוקדים בשלב ההחלמה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המתחדשת, כגון מהם המנגנונים התאיים והמולקולריים המשמשים לחידוש סוגי תאים דיסקרטיים התחל בהעברת ביציות טרנסגניות שנאספו מהזדווגות לצלחת פטרי המכילה תמיסת דניו 0.3 x 16 שעות לאחר ההפריה. ADD PTU כדי לעכב את פעילות טירוזין ACE לפני כל עדות לפיגמנטציה ברקמה המבוקשת. אם העובר אינו לבקן, דגרו על העוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס.

ברגע שהכתבים ניכרים, הניחו את צלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ זום סטריאו פלואורסצנטי ומיינו את הביטוי הטרנסגני הרצוי. לפני ההדמיה. הכן תמיסת הרכבה אווירית נמוכה של 0.5% במדיום עוברי ואחסן אותה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.

הוסף טריקה ו-PTU במידת הצורך. מערבבים בעדינות ומחזירים ל-40 מעלות. הרדמו את הדגים על ידי הנחתם במדיום עוברי המכיל טריקה.

במשך כשלוש דקות, הדג לא יגיב. כדי לגעת באמצעות מיקרו פיפטה, משוך דגים בודדים לקצה פיפטה גזוז בנפח של כ -30 מיקרוליטר תמיסת הרדמה. לאחר מכן, הפוך את הפיפטה ואפשר לדג להתיישב לתחתית.

גע בקצה לתמיסת ההרכבה ואפשר להם לעבור בכוח הכבידה. הקפד לא לדלל את האגרו כך שניתן יהיה לעשות בו שימוש חוזר. השלך את תמיסת ההרדמה שנותרה מהמיקרו פיפטה.

לאחר מכן בעזרת אותו טיפ, העבירו את הדג לצלחת פטרי. בכ-30 מיקרוליטר של תמיסת הרכבה, כוונו בעדינות את הדג כך שאזור העניין יתרכז בטיפת האוויר. ודא שהדג נשאר בכיוון הרצוי עד שהאירוס מתמצק.

ניתן להרכיב מספר דגים בצלחת פטרי אחת אם רוצים. לאחר שהאירוס התמצק, העבירו את הדג לשלב המיקרוסקופ הקונפוקלי והוסיפו בעדינות מדיום עוברי המכיל טריקה פלוס מינוס PTU לצלחת עד שהדג שקוע לחלוטין. פתח את תוכנת ההדמיה והתמקד באזור העניין להדמיה אופטימלית של פרטים סלולריים או מולקולריים.

השתמש ביעדים למרחקי עבודה ארוכים עם צמצמים מספריים גבוהים בתוכנה. בחר את ארבע הצמחייה המתאימות מרשימת החוגה. לחץ על ההגדרה הספקטרלית ובצע התאמות לטווחי הפליטה.

כדי להשיג הפרדה נקייה של אותות המדווח ולמקסם את יחסי האות לרעש. בחר את המטרה המתאימה בתפריט הנפתח כדי להבטיח שכל הקביעות המוגדרות מראש המוגדרות בתוכנה מותאמות כהלכה. כדי למקד את הלייזרים ולהגדיר רמות הספק, בחר פלט מטבלת החיפוש החושף את רוויית הפיקסלים עבור כל ערוץ.

לאחר מכן, הגדר את רגישות הגלאי כדי להשיג את איכות התמונה הרצויה, העלה בהדרגה את פלט הלייזר עד שעוצמת התמונה מקובלת. הימנע מרוויית פיקסלים באזור העניין ושמור על רמות לייזר נמוכות ככל האפשר. כדי להפחית בעיות פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות.

ודא שכל קו לייזר מייצר אות הניתן לזיהוי רק בערוץ המתאים על ידי הפעלה וכיבוי ידנית של לייזרים תוך ניטור כל ערוצי ההדמיה. אם לא ניכר דיבור צולב, ניתן לרכוש את כל הערוצים בו זמנית. לאחר מכן, מסגרו את אזור העניין באמצעות פונקציות הזום והסיבוב

לאחר מכן הגדר את מהירות הסריקה ואת גודל התמונה באמצעות מהירויות סריקה גבוהות יותר, ממזער את זמן השהייה בלייזר ומגדיל את הרזולוציה הזמנית. הגדר את גודל שלב ממד Z בהתאם לצרכי הניסוי. כאן נעשה שימוש בגודל צעד של 10 מיקרון כדי לדמות שבעה חלקים אופטיים של רקמת הרשתית.

לאחר קביעת ההגדרות המתאימות, רכוש תמונות Zack ושמור. לאחר מכן עוברים לדג הבא. ניתן לבצע הדמיה סדרתית של תפיסה ושחרור כדי לעקוב אחר שינויים תאיים לאורך ימים רצופים בהתאם להוראות במסמך הכתוב הנלווה.

בעת ביצוע ניסוי הדמיה מרובה מדווחים, עדיף להשתמש ברצפות רצפה מופרדות היטב, ספקטרליות, עם זאת, זה לא תמיד מעשי. כאן אנו מראים שיטת חיסור תמונה פשוטה באמצעות תוכנת הקוד הפתוח תמונה J כדי להפריד בין רצפות רצפה עם פרופילי עירור ופליטה חופפים. במקרה שלנו, GFP ו- YFP.

טכניקות הדמיית צירי הזמן המתוארות בסרטון זה שימשו לניטור תאי גזע רשתית המסומנים ב-GFP במהלך האבלציה וההתחדשות של נוירונים דו-קוטביים ברשתית כדי לבצע הפרדה ספקטרלית, אסוף תמונות באמצעות מצבי הדמיה עוקבים והגדרות מסנן מחסום משתנות, המאפשרות לרכוש ארבע קומות חופפות באופן עצמאי והפרדה חלקית בהתאמה. לאחר רכישת התמונות, השתמש בייבוא ImageJ loci bio formas כדי לפתוח את קבצי התמונה כדי להפעיל את כלי הייבוא. גרור את הקובץ המעניין לחלון התמונה J.

פצל את הערוצים לערימות נפרדות באמצעות תיבת הסימון פיצול ערוצים בחלון הייבוא כדי להפעיל את התוסף יישור שלושה TP. לחץ על תוספים ולאחר מכן יישר ערימות. לאחר מכן יישר שלושה tp.

יש ליישר את הערימות כדי להבטיח חיסור נכון. בחר את מחסנית ההפניות בתיבה הנפתחת הראשונה ואת הערימה שאינה מיושרת בתיבה השנייה. סמן את השתמש במקור יחסי XY והשתמש בתיבות מקור יחסי Z ולחץ על אישור.

כדי להתחיל בתהליך היישור, לחץ על לחצן רישום אמצעי האחסון. יופיע חלון חדש המכיל את פרמטרי היישור. לחץ על אישור.

סעיף זה עבר אופטימיזציה על ידי מפיץ התוסף, כך שאין צורך בשינויים. בסיום, יופיע חלון ערימות מיושרות. בחר פלט מהחלון המיושר כדי לפתוח את חלון הפלט.

גם חלון זה מותאם ואינו זקוק לשינוי. לחץ על אישור. מחסנית חדשה תופיע בסביבת העבודה עם יישור מצורף לסוף כותרת הקובץ.

כדי להסיר הצלבה באמצעות מחשבון תמונות, לחץ על תהליך ולאחר מכן על מחשבון תמונה. בחר את האוסף שיש להחסיר בתמונה, בתיבה נפתחת אחת ואת האוסף שישמש לחיסור. בתיבה הנפתחת תמונה שתיים, בחר החסר בתיבה הנפתחת של הפעולה ולחץ על אישור.

תמונה J תבקש לעבד את המחסנית. בחר כן. אמורה להופיע מחסנית חדשה, שהסירה את הערב-דיבור בין ערוצים חופפים.

מזגו את האוספים כדי ליצור מחדש את אותו מבנה תמונה לפני היישור והחיסור. על ידי בחירת ערוצים ממוזגים בחלון כלי הערוץ, הכלי מאפשר מיזוג של עד ארבע ערימות לערימת היפר. לבסוף, צבעו את הערוצים, התאימו לבהירות וניגודיות ושמרו את הקבצים כ-tiffs כדי לבחון אובדן ממוקד והתחדשות של ניטרו רדוקטאז.

M דובדבן המבטא תאים דו קוטביים ברשתית. סדרת זמן של תמונות קונפוקליות צולמו בדגי זברה בודדים לפני הטיפול. יש ביטוי פסיפס של מדווח YFP מתויג ממברנה בתאים דו קוטביים מבוקרים המוצגים בחלבון היתוך דובדבן צהוב וניטרו רדוקטאז בדו-קוטביים ממוקדים המוצגים באדום.

הטרנסגן CFP המתויג בממברנה המוצג בציאן מספק מידע הקשרי על רוב תאי הרשתית האחרים לבהירות נוספת. אותה תמונה ללא אות CFP מוצגת לאחר טיפול במטרונידזול. הניטרו רדוקטאז האדום המבטא תאים דו קוטביים הולך לאיבוד ואילו התאים הדו-קוטביים המבוקרים הצהובים נחסכים.

זה מדגים את האופי הספציפי ביותר של מתודולוגיית אבלציה זו. שוב, אותה תמונה ללא CFP מוצגת לשם הבהרה. כאשר מטרו NIAZ מוסר, תאים המבטאים NTR חוזרים לכאן.

דוגמה לשיטת החיסור G-F-P-Y-F-P מוצגת באיור זה GFP שכותרתו מולר. תאי GL מוצגים בירוק ותאים דו-קוטביים עם תווית YFP מוצגים בסגול. חפיפה בין השניים מייצרת לבן לביצוע החיסור.

תחילה יש ליישר את תמונות GFP ו- YFP. תהליך החיסור מאפשר לאחר מכן להסיר תאים דו-קוטביים המסומנים ב-YFP מתמונת ה-GFP, מה שמאפשר לייצג בצורה נקייה את ה-GFP המסומן ב-Mueller ggl ולזהות תאי מולר עמומים יותר. כעת ניתן לאמת את החפיפה בין תאים דו-קוטביים עמומים המסומנים בדובדבן מולר, ggl ו-M המוצגים באדום.

הנתונים המוצגים כאן מצביעים על כך שאבלציה של תאים דו-קוטביים מפעילה את ה-Mullar ggl כדי להחליף את התאים האבודים. פרשנות זו עולה בקנה אחד עם מחקרים אחרונים על התחדשות רשתית, המרמזים על מולר Ggl כאבות הנגרמת על ידי פציעה הן ביונקים והן בדגים. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור מנגנונים המווסתים את ההתחדשות של סוגי תאים ספציפיים באמצעות הדמיה של תאי גזע בדג הזברה.