Name: אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: חקור פיתוח מוח גוף הפטריה ב-Drosophila באמצעות שיטת תרבית ex vivo. טכניקה זו מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של תהליכי התפתחות עצביים ומחקה תנאי in vivo במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לכל אנשי המעבדה שלנו, עצות שלהם דיונים והערות מועילות על כתב היד. אנו גם רוצים להודות במיוחד מרתה קוך באסם חסן על ההצעה מצוין כי אנחנו מחכים עד 1.5 שעות APF לפני לנתח מוחות עבור culturing בניסויים שיפוץ. כמו כן, אנו מודים מתקן הדמיה NHGRI לשימוש של מיקרוסקופ confocal שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית Neuroscience בסיסי של תוכנית המחקר NINDS המיפוי, NIH (Z01 NS003106).

א &#39;הכנת מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת שלמים על ידי בתוספת פילטר חיטוי תסיסנית שניידר מדיה עם סרום 10% שור עוברית 1% פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתקשורת יש להכין טרי בכל פעם. לחלופין, aliquot טרי מראש קפואים התקשורת ניתן להפשיר לפני כל שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני culturing, להוסיף 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אינסולין ו 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ecdysone לתקשורת. סמים היו מוכנים כמו מניות מרוכזים ו קפוא aliquots קטנים. Aliquots מופשר לא היו refrozen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות לכל העובדים יש לשמור על 25 ° C. </li></ol> Culturing של המוח הזחל 1. בחירה Dissection המוח הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של התקשורת כדי להוסיף 12 מ&quot;מ Millicell תרבית תאים. המוח גזור ימוקמו מוסיף אלה כדי להקל על immunostaining קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כמות קטנה של כלי התקשורת מוכנים זכוכית שעון לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uלשיר מרית קטנה, לאסוף את הנדודים 3 זחלים instar ומניחים אותם בזכוכית שעון. (אנו מניחים כי שיטת לשעבר התרבות vivo יחול באותה מידה על הזחלים instar 1 או 2, אבל לא צריך לבדוק את זה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את הקצה האחורי של הזחל עם זוג מלקחיים, לפתוח בזהירות את הקצה הקדמי עם צמד של 2 # 5 מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר לנתח את המוח, שמירה על חוט העצב הגחון ללא פגע. </li></ol> 2. אקס culturing vivo של מוח הזחל גזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מראש רטובים טיפים פיפטה, להעביר את המוח בזהירות לתוך התרבות מוסיף סלולריים, מראש מלאים התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח ההעברה, בכלי התקשורת, וכלה בחממה של 25 מעלות צלזיוס עד השעה הרצויה נקודות הוא הגיע. שיטה זו פועלת ביעילות של עד 48 שעות בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את המדיה בכל 8 שעות. מעבר לכך, להחליף מחצית התקשורת כל 5-6 שעות. </li></ol> 3. מניפולציה תרופתי שלהזחל המוח שיטה זו של culturing vivo לשעבר יכול לשמש כדי לאשש פרמקולוגית אינטראקציות גנטיות הוכיחו בעבר במעבדה שלנו 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף roscovitine 100 מיקרומטר ו 100 מיקרומטר olomoucine למדיה מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת המוחות מנתחים את זה בתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות המוח במהירות של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את המדיה בכל 8 שעות. מעבר לכך, להחליף מחצית התקשורת (עם סמים) כל 5-6 שעות. </li></ol> Culturing של המוח גלמי 1. מבחר גלמים לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן גלמים לבן על בקבוקים / צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לבחור גלמים כי הן לבנות לחלוטין. גלמים עם כל סוג של צבע לא צריך להיות כלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב זה הוא 0 שעות לאחר כינונה Puparium (APF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלמים אלה יהיו מוכנים לנתיחה 1.5 שעות לאחר סימון. שלב זה הוא חיוני כדי להבטיח כי גיזום התפתחותית מתרחשת לשעבר vivo </eמ &#39;&gt; תרבות. </li></ol> 2. דיסקציה של גלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של התקשורת כדי להוסיף 12 מ&quot;מ Millicell תרבית תאים. (את המוח גזור ימוקמו מוסיף אלה כדי להקל על immunostaining קל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזמן הרצוי נקודות הושג, להוסיף כמות קטנה של כלי התקשורת מוכנים זכוכית שעון לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית קטנה, רטוב, לאסוף גלמים סימנה בעבר לנתיחה ומניחים אותם בזכוכית שעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את הקצה האחורי של גלמים עם זוג מלקחיים, בזהירות לפתוח את סוף הקדמי של המארז גולם עם זוג נוסף של מלקחיים # 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר לנתח את המוח, שמירה על חוט העצב הגחון שלם המצורף. </li></ol> 3. אקס culturing vivo של מוח גלמי גזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המוח בזהירות לתוך התרבות מוסיף סלולריים, מראש מלאים התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת המוח, בכלי התקשורת, וכלה בחממה של 25 ° C עד השעה הרצויה-Point הוא הגיע. השתמשנו בשיטה זו עד 10 שעות בתרבות לצורך הניסוי הראו, אך ניתן להרחיב את תקופות ארוכות יותר של התבוננות וטיפול, במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפעם נקודות יותר APF 8 שעות, במקום כל 5-6 שעות מדיה. </li></ol> משלב זה ואילך, פרוטוקול נותר ללא שינוי על זחלים וגלמים הן. ב תיקון המוח גזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזמן הרצוי נקודות הוא הגיע, להסיר התקשורת ולהוסיף 500 μl של פורמלדהיד 4% 1x PBS עם 0.5% טריטון X-100 (PBST) במשך 30 דקות, להחליף עם פורמלדהיד חדש לאחר 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שלא לאפשר מוחות להתייבש תוך החלפת התקשורת עם מקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פורמלדהיד עם ארבעה שוטף 10 דקות של 1x PBS עם 0.5% TritonX-100 (PBST). </li></ol> ג מכתים המוח קבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פורמלדהיד כבר לשטוף, לחסום את המוח במשך שעה 1 בפתרון חסימת 1x PBS עם 1% רגילעיזים סרום ו - 1% אלבומין בסרום שור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים ראשוניים שנעשו בתוך חסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח דגירה לינה 4 מעלות ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לשטוף נוגדנים ראשוניים עם ארבעה 10 שטיפות זעירות של PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים משני מורכב לבלום פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו בטמפ &#39;החדר למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף נוגדנים משני עם ארבעה 10 שטיפות זעירות של PBST. </li></ol> ד הרכבה המוח קבוע ומוכתמת מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן המוח בתקשורת Vectashield גובר שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המוח על שקופיות הזכוכית באמצעות התקשורת Vectashield הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שבבי זכוכית בכל צד של המוח לפני הרכבה תלוש כיסוי. זה מונע את מוחם מלהיות מעוכה, תוך שמירה על מדגם דק מספיק כדי לסרוק את כל המטוסים מוקד במיקרוסקופ confocal. המוח היו בכיוון בערך על הרכבה כדי להקל על הצגת תכונות של עניין. במידת הצורךתמונות המוח היו מסתובבים עם תוכנת Imaris לספק תצוגה אופטימלית תיעוד ומדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוגרים מכסה מחליק עם הלק ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות מחליק מן האור. </li></ol> קולי נציג תוצאות איור 1 מציג פאנל של 3-instar המוח הזחל של (A) wild-type זבובים (ב &#39;) זבובים המבטאים נגזרת דומיננטי שלילי של Cdk5 (Cdk5DN) (Connell, קראולי et al., 2000). שניהם מביעים אקטין-GFP (ירוק) בנוירונים מגה גמא. כפי שתואר קודם לכן (Trunova et al., 2011), יש אזור של אקסונים הפרוקסימלי של wild-type נוירונים גמא זה לא יצליח לצבור אקטין-GFP, ובכך להופיע בתור &quot;אזור ברורה&quot; (, סוגר), ו fasciclin 2 חלבונים (אדום) מצטבר אקסונים רק עד גבול הגחון של אזור זה (קו אופקי לבן). קו מקווקו בלוח השלישי של איור 1 (א) מציין את המיקום של MB, המדגיש את המעשהב &quot;אזור ברורה&quot; והגבול הגחון שלה. אצל זבובי המבטאים Cdk5DN, אזור אקטין ברור התאור (ב &#39;) Fasciclin 2 (FasII) immunoreactivity מתפשט dorsally דרך אזור זה. (שימו לב למספרים משתנים של הפרויקט אקסונים FasII חיובי אופקית לאורך MB, אלה אינן רלוונטיות פנוטיפ). סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר. באמצעות השיטה שלנו culturing vivo לשעבר, התייחסנו wild-type זבובים עם שילוב של roscovitine ו olomoucine, מעכבי תרופתי של פעילות Cdk5. תרשים 2 מציג פאנל של 3-instar המוח הזחל של שליטה (A) תחת טיפול תרופתי (ב &#39; wild-type) זבובים. בדומה זבובים המבטאים מבנה דומיננטי שלילי Cdk5, המוח שטופלו Cdk5 מעכבי למשך 24 שעות, מראים ירידה אופיינית לאזור אקטין ברורה שינוי הגבול FasII (סוגריים מרובעים). קווים לבנים להראות המיקום של הגבול FasII wild-type. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר. FiguRe 3 מציג סדרות נציג של הגופים תסיסנית פטריות של 0-10 שעות APF, שכותרתו עם קרום ממוקד mCD8-GFP (ירוק). בסוגריים מציינים את גביע, כלומר, את תחזיות הדנדריטים של MB. לקראת מטמורפוזה, אפשר לראות אקסונים מגה שזורמים dorso-ventrally בצרורות עבים, כמו גם &quot;אובך&quot; של אות ניאון הנובעים הדנדריטי ארבור צפופה (סוגריים). כך עולה לוח מוחות גזור ברגע המתאים. הערה גיזום של דנדריטים באזור שעליו הצביע הסוגריים, כך לפי 6-8 שעות APF, אובך של הדנדריטים האות נעלם (אם כי את האות axonal אינו מושפע). המוח בלוח ב נותחו ב 0 שעות APF, לפני הפנימית ecdysone ספייק (טרומן Riddiford, 2002), vivo לשעבר תרבותי כמצוין. אלה לא הראו גיזום ההתפתחותי של דנדריטים, אלא אות הדנדריטים נמשכת לאחר 10 שעות APF. כדי לעקוף זאת, גלמים מסומנים ב APF שעות 0, אך גזור על 1.5 שעות APF ותרבותיים. חלוניתאני מציג סדרה C מייצג של גופים אלה פטריות תסיסנית מ APF שעות 0-10. כמו הלא מתורבתים דגימות, האות הדנדריטים הוא בלתי ניתן לגילוי על ידי 8 שעות APF. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר.

<ol><li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li>
<li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li>
<li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5%3A+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li>
<li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+Drosophila%3A+behavior%2C+genetics%2C+and+neural+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li>
<li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis%3A+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li>
<li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+requirement+of+the+USP%2FEcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li>
<li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li>
<li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li>
<li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li>
<li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

<html> מניפולציות גנטיות כרוניות של מבנה ותפקוד רקמות, כולל מוטציות וביטוי transgenes, בדרך כלל ליצור שילוב של השפעות מיידיות ותוצאות עקיפות מאוחר זה יכול להיות מאוד קשה להיפרד. משלימים שיטות גנטיות עם פרמקולוגיה יכול להקל על החקירה כמובן זמן מאחורי פנוטיפ. כך, למשל, זה כבר גישה רב עוצמה לנתח את התרומה של מרכיבים שונים במהלך cytoskeletal spermatogenesis ב תסיסנית 10. בדוגמה הנוכחית, היא אפשרה לנו להראות שיש דרישה עיקשת על Cdk5 לשמור על המבנה של AIS ב תסיסנית...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td> שניידר תסיסנית מדיה </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית (חום מומת) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> Ecdysone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td> Olomoucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td> עיזים רגיל סרום </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> 1% </td></tr><tr><td> שור אלבומין בסרום </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> M9501 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> פורמלדהיד </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP151 </td><td> 0.5% </td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> וקטור מעבדות </td><td> H1000 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> תרבות Millicell סלולריים הוספת </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish, 4 גם </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> דומון # 5 מלקחיים </td><td> מדע כלים עדינים </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

אנו מתארים שיטה culturing vivo לשעבר של שלמות המוח תסיסנית. זה יכול לשמש משקל נגד כדי מניפולציות גנטיות כרוניות על חקירת ביולוגיה של התא ופיתוח של מבנים מוחיים מרכזיים בכך שהוא מאפשר התערבויות תרופתיות חריפות הדמיה חיה של תהליכים תאיים. כדוגמה טכניקה, לפני לעבוד במעבדה שלנו 1 הראה כי תא subcellular מוכרים קודם לכן נמצא בין התאים axonal ו somatodendritic של אקסונים במוח תסיסנית המרכזית. הפיתוח של תא זה, המכונה במגזר האקסון הראשון (AIS) 2, הוצגה גנטית תלוי קינאז נוירון ספציפי cyclin תלוי, Cdk5. אנחנו מראים כאן כי טיפול vivo לשעבר של wild-type המוח תסיסנית הזחל עם Cdk5 ספציפי מעכבי תרופתי roscovitine ו olomoucine 3 גורמת לשינויים חריפים בארגון אקטין, ובלוקליזציה של חלבונים על פני קרום התא Fasciclin 2, המחקים את השינויים הנראים מוטנטים חסרי Cdk5 פעילות גנטית. דוגמה 2 של הטכניקה vivo לשעבר התרבות מסופק שיפוץ של קשרים של הגוף פטריות עובריים (MB) נוירונים גמא במהלך המטמורפוזה של הזחל לבוגר. גוף הפטרייה הוא מרכז למידה חוש הריח וזיכרון זבוב 4, אלה הנוירונים גמא לגזום ענפים axonal ו הדנדריטים שלהם במהלך פיתוח גלמי ואז שוב להאריך סניפים בכל timepoint מאוחר יותר לקבוע את דפוס העצבוב מבוגרים 5. גיזום של נוירונים אלה של MB הוכח להתרחש באמצעות ניוון המקומי של הענפים neurite 6, על ידי מנגנון זה מופעלת על ידי ecdysone, הורמונים סטרואידים, הפועל על הקולטן ecdysone B1 7, וכי היא תלויה בפעילות של ubiquitin-הפרוטאזום המערכת 6. השיטה שלנו של culturing vivo לשעבר יכול בדואר רגיל לחקור עוד יותר את המנגנון של שיפוץ התפתחותית. מצאנו כי הגדרת vivo לשעבר התרבות, הנוירונים גמא של MB סיכמו את תהליך גיזום התפתחותית כמובן עם הזמן בדומה in vivo. זה היה חיוני, עם זאת, לחכות עד 1.5 שעות לאחר היווצרות puparium לפני explanting את הרקמה על מנת התאים להתחייב באופן בלתי הפיך על מטמורפוזה, דיסקציה של בעלי חיים עם תחילת pupariation הוביל מטמורפוזה קטנה או לא בתרבות. לכן, עם שינויים מתאימים, גישה לשעבר התרבות vivo ניתן ליישם ללמוד דינמי כמו גם היבטים למצב יציב של הביולוגיה מוח מרכזי.

מאמר זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניתן לחקות<em&gt; In vivo</em&gt; פיתוח<em&gt; תסיסנית</em&gt; פטריות הגוף<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; מערכת התרבות.

אנו מתארים שיטה לגידול ex vivo של מוחות שלמים של Drosophila. ניתן להשתמש בשיטה זו כחלופה למניפולציות גנטיות כרוניות עבור...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לגדל מוחות שלים של זבוב הדרוזופילה בשלבי התפתחות שונים, זחלים ובובות, בסביבה ex vivo. זאת על ידי זיהוי ראשוני של דרוזופילה, זחלים ובובות בשלב המתאים, ולאחר מכן הוצאה מהירה של המוחות באמצעות דיסקציה.לאחר מכן, המוחות מודגלים למשך פרק הזמן הנדרש בטמפרטורה של 25 °C. לבסוף, המוחות המודגלים מקובעים, נצבעים, מורכבים ונדגמים תמונה. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי ניתן לחקות את ההתפתחות in vivo של גוף הפטרייה (mushroom body) של ה-oph באמצעות טכניקת תרבית ex vivo.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן כעת לחקות פנוטיפים in vivo בגוף הפטريה (mushroom body) של ה-drosophila במסגרת תרבית ex vivo, מה שמאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של הדינמיקה של תהליך ההתפתחות לצורך גידול מוחות של זחלים. לאחר הכנת מדיום מלא וטרי עם אינסולין ו-act Dyson, הוסף 500 µL לצלח תרבית תאים בנפח 12 מילימטר עם תבת לטיפול תרופתי. הכן מדיום מלא עם 100 µM של Rosco battin ושל oli moin.הוסיפו כמות קטנה של מצע לזכוכית שעון לנתיחה. בעזרת שפכטל קטן, אספו זחלים נודדים בשלב השלישי (third instar) והניחו אותם בזכוכית השעון. לאחר מכן, החזיקו את הקצה האחורי של הזחל בעזרת פינצטה.לאחר מכן, בעזרת פינצטה מספר 5, פתחו בזהירות את הקצה האנטריורי, בצעו דיסקציה מהירה של המוח תוך שמירה על שלמות חבל העצבים הוונטרלי. באמצעות טיפים של פיפטה שהורטבו מראש, העבירו בזהירות את המוח אל צלחית תרבית התאים שהוכנה מוקדם יותר. לאחר מכן, הכינו תא לחות והניחו את הצלחית בתוך התא.דגרו את המוח בטמפרטורה של 25 °C למשך עד 48 שעות לצורך גידול מוחות של בני-פופה. התחילו בסימון white puy על המבחנות. רשמו שלב זה כשעה 0 לאחר היווצרות ER או כ-PF ב-1.5 שעות.הוסיפו 500 µL של מצע מלא לבחור תרבית תאים של 12 מ"מ עם רכיב להכנסה (insert). הוסיפו כמות קטנה של מצע מוכן לזכוכית שעון לניתוח. לאחר מכן, באמצעות שפכטל רטוב קטן, קחו את ה-PPE שסומן מראש לניתוח והניחו אותו בזכוכית השעון.הבובניה הלבנה משמאל מייצגת את נקודת הזמן אפס, ומימין מוצגת נקודת זמן של 1.5 שעות לאחר ה-PF. לאחר מכן, תוך כדי החזקת הקצה האחורי של הבובניה באמצעות פינצטה, השתמשו בפינצטה מספר 5 כדי לפתוח בזהירות את הקצה הקדמי של מעטפת הבובניה. לאחר מכן, הוציאו במהירות את המוח תוך שמירה על חבל העצבים הוונטרלי שלם ומחובר. לאחר חיתוך הקצה של טיפ פלסטיק בנפח 20 µL, הרטיבו את קצה הפיפטה והשתמשו בו כדי להעביר בזהירות את מוחות הבובניות לכליות עם המצע.דגרו אותם בטמפרטורה של 25 °C למשך פרק הזמן הרצוי. לאחר שמוח larvae או pupae דגר למשך פרק הזמן הרצוי, הסירו את המצע והוסיפו 500 µL של 4% formaldehyde בבופר PBST. דגרו למשך 15 דקות, ולאחר מכן החליפו ב-4% formaldehyde רענן בבופר ודגרו למשך 15 דקות נוספות.השתמש ב-XPBS עם 0.5% Triton X 100 כדי לשטוף את המוחות ארבע פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר השטיפה האחרונה, דגרי את הדגימות למשך שעה אחת בתמיסת חסימה.הוסיפו נוגדנים ראשוניים בתמיסת חסימה והדגירו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, שטפו את הדגימות עם PBST ארבע פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, הדגירו נוגדנים משניים בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות.חזור על שלבי השטיפה כדי להכין את המוחות למיקרוסקופיה. התחל בהשراط של המוחות ובמרקאב הקיבוע למשך שעה אחת, ולאחר מכן מקם אותם על שקופיות זכוכית כדי למנוע מעיכה של הדגימות. הנח שבבי זכוכית משני הצדדים.לאחר מכן הנח את לבישי הזכוכית לאחר איטומם בלכה לציפורניים. אחסן את השקופיות בחושך. איור זה מציג פאנל של מוחות זחלים בשלב ג' (third instar) מזבובים מסוג wild type ומזבובים המבטאים נגזרת דומיננטית-שלילית של CDK five או CDK five dn, שניהם מבטאים actin GFP בנוירוני גוף הפטרייה או נוירוני MB gamma כפי שתואר בעבר; קיימת אזור באקסונים הפרוקסימליים של נוירוני gamma ב-wild type שבו אין הצטברות של actin GFP, ולכן הוא מופיע כאזור שקוף, ובאופן פסיאלי חלבון two מצטבר באקסונים רק עד לגבול הוונטרלי של אזור זה.הקווים המקווקווים מצביעים על מיקום ה-MB המדגיש את אזור הפינוי של actin ואת הגבול הוונטרלי שלו. בזבובים המבטאים CDK five dn, אזור הפינוי של actin אינו קיים, והתגובה החיסונית של fascially two או fast two מתפשטת באופן דורסלי דרך אזור זה. תוך שימוש בשיטה המוצגת כאן לתרבית ex vivo, מוחות של זבובים מסוג wild type טופלו בשילוב של המעכבים הפארמקולוגיים של פעילות CDK five, ROS cottin ו-ene.מוצג כאן לוח של מוחות זחליים בשלב השלישי של זבובים מסוג פרא (wild type) מקבוצת הביקורת ומקבוצה שטופלה בתרופה; במוחות של זבובים דומים המבטאים מבנה דומיננטי-שלילי של CDK five שטופלו במעכבי CDK five למשך 24 שעות, נראה אובדן אופייני של ה-acting clear zone והסטה ב-fast. Two boundary. קווים לבנים מראים את מיקומו של ה-fast. Two boundary מסוג פרא. מוצגת כאן סדרה מייצגת של גופי פטריות (mushroom bodies) של drosophila משעה 0 ועד שעה 10.PF המסומן באמצעות MCD eight GFP המכוון לממברנה מצביע על הבליטות הדנדריטיות של ה-MB, המכונה calyx לפני הגלגול. אקסונים של ה-MB עוברים בכיוון דורסו-ונטרלי באגודות עבות, ואות פלורסצנטי עולה מהעץ הדנדריטי הצפוף.עמודה זו מציגה מוחות שנותחו בזמן המצוין. שימו לב לגיזום הדנדריטים באזור המסומן בסוגריים, כך שעד שש עד שמונה שעות A PF, אות הדנדריטים המעורפל נעלם. המוחות בעמודה זו נותחו בשעה אפס A PF לפני הפעולה הפנימית.דייסון ספייק (Dyson spike) ותרבית ex vivo במועדים המצוינים; אלו אינם מראים גיזום התפתחותי של דנדריטים. במקום זאת, האות הדנדריטי נשמר ב-10 שעות a PF. כדי לעקוף זאת, סומן PPR ב-0 שעות EPF, אך בוצע ניתוח ב-1.5 שעות a PF ואחר כך תרבית. עמודה זו מראה סדרה מייצגת של גופי פטריה DLA אלו מאפס עד 10 שעות.ב-PF כפי שמופיע בדגימות שלא תורגלו, לא ניתן לזהות את האות הדנדריטי לאחר שמונה שעות ב-PF. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד לתרגל מוחות של rosler ex vivo. תוכלו לבודד מוחות מזחלים בשלב מאוחר או מ-white PrepU, בין אם לפני ובין אם אחרי הזינוק ההורמונלי המביא למטמורפוזה. לאחר מכן, תוכלו לנתח חומר מקובע באמצעות מיקרוסקופיה או להשתמש במוחות כחומר התחלתי לדימות חי.

ex-vivo-culturing-of-whole-developing-drosophila-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מדגים את הכנת תרביות נוירונים העיקרי של המוח של המנוח בשלב תסיסנית גלמים. צפיות של תרבויות לחיות להראות תוצאה neurite הדמיה של רמות הסידן באמצעות Fura-2.

תרבויות עצבית ראשונית של המוח של Late Stage תסיסנית גלמים

וידאו זה מדגים את נוהל בידוד המוח כולו מן הבוגרים תסיסנית כהכנה ההקלטה מתא עצב בודד באמצעות תא רגיל הטכנולוגיה כולו. זה כולל תמונות של תאים GFP ונוירונים שכותרתו שנצפו במהלך ההקלטה.

תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

אנו מתארים את הליך להכין...

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

סרטון זה מדגים פרוטוקול לזיהוי גורמים אקסוגניים היוזמים הפעלה מחדש של תאי גזע עצביים במוח דרוזופילה ממצבם השקט. זחלים שזה עתה בקעו מנותחים כדי לבודד את מוחם, אשר לאחר מכן מתורבתים במדיה עם או בלי הורמון בדיקה כדי להעריך את הפוטנציאל של ההורמון לגרום להפעלה מחדש של תאי גזע עצביים והתפשטות.

ניתוח הפעלה מחדש של תאי גזע עצביים בצמחי מוח דרוזופילה בתרבית

מקור: Ishimoto, H. et. al., הדמיית סידן ex vivo להמחשת תגובות המוח לאיתות אנדוקריני בדרוזופילה. J. Vis. exp. (2018)}{{}}} {{}}} סרטון זה מדגים הדמיית סידן למחקרDrosophila תגובות מוח לנוירופפטידים. נוירונים המבטאים אינדיקטור סידן פלואורסצנטי חושפים דינמיקת סידן תוך תאית ותגובות תפקודיות למולקולות איתות.

הדמיית סידן ex vivo לחקר תגובות המוח של דרוזופילה לנוירופפטידים

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

המוח תסיסנית הבוגרת הוא מערכת יקרה ללימוד מעגלים עצביים, תפקוד מוח גבוה, והפרעות מורכבות. שיטה יעילה כדי לנתח רקמות מוח כולו מראש הזבוב הקטן תקל מחקרים מבוססי מוח. כאן אנו מתארים פשוט, פרוטוקול לנתיחת צעד אחד של מוחות בוגרים עם מורפולוגיה השתמרה היטב.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

שיטה להפעיל מחדש תאי גזע עצביים שקטים בגרשי מוח דרוזופילה מתורבתים הוקמה. בשיטה זו, ניתן לנתק את תפקיד האותות המערכתיים מאותות מהותיים רקמה בוויסות של השבתת תאי גזע עצביים, כניסה ויציאה.

הפעלה מחדש של תאי גזע עצביים במוח דרוזופילה מתורבת

חקור פיתוח מוח גוף הפטריה ב-Drosophila באמצעות שיטת תרבית ex vivo. טכניקה זו מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של תהליכי התפתחות עצביים ומחקה תנאי in vivo במעבדה.

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

גלה סרטונים נוספים