אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתרבת מוחות שלמים של דרוזופילה, זחלים ואישונים בסביבה ex vivo. זה מושג על ידי זיהוי ראשון של דרוזופילה, זחלים וגורמי שלב מתאים. לאחר מכן, המוחות מנותחים במהירות.

לאחר מכן המוחות מתורבתים לפרק הזמן הנדרש ב-25 מעלות צלזיוס. לבסוף, המוחות המתורבתים מקובעים, מוכתמים, מותקנים ומצולמים. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי ניתן לחקות את ההתפתחות in vivo של גוף פטריית ה-oph באמצעות טכניקת תרבית ex vivo.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שכעת אנו יכולים לחקות פנוטיפים in vivo בגוף פטריית הדרוזופילה בסביבה של תרבית ex vivo, מה שמאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של הדינמיקה של תהליך ההתפתחות לתרבית מוחות זחלים. לאחר הכנת מדיום טרי, שלם עם אינסולין ופעל דייסון ב -500 מיקרוליטר לצלחת תרבית תאים של 12 מילימטר עם תוספת לטיפול תרופתי. הכן מדיום שלם עם 100 מיקרומולר כל אחד של רוסקו באטין ואולי מוין.

הוסף כמות קטנה של מדיום לדיסקציה. צפו בזכוכית בעזרת מרית קטנה, אספו זחלי כוכב שלישי נודדים והניחו אותם בזכוכית השעון. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים מחזיקים את הקצה האחורי של הזחל.

ואז עם מספר חמש, מלקחיים, פתח בזהירות את הקצה הקדמי ונתח במהירות את המוח תוך שמירה על חוט העצב הגחוני שלם. בעזרת קצות פיפטה רטובים מראש, העבירו בזהירות את המוח לצלחת תרבית התאים שהוכנה בעבר. לאחר מכן, הכינו תא רטוב והניחו את המנה בתוך החדר.

דגרו על המוח בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות כדי לתרבית מוחות של אישונים. התחל בסימון פוי לבן על בקבוקונים. רשום שלב זה כאפס שעות לאחר היווצרות ER או PF לאחר 1.5 שעות.

A PF הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום שלם לצלחת תרבית תאים של 12 מילימטר עם תוספת. הוסף כמות קטנה של מדיום מוכן לכוס שעון דיסקציה. לאחר מכן, בעזרת מרית רטובה קטנה, הרם PPE שסומן בעבר לדיסקציה והניח אותם בזכוכית השעון.

הגורם הלבן משמאל הוא נקודת הזמן האפס, ומימין מוצג ה-1.5 שעות A PF. לאחר מכן, תוך כדי החזקת הקצה האחורי של הגולם עם זוג מלקחיים, השתמש במלקחיים מספר חמש כדי לפתוח בזהירות את הקצה הקדמי של מארז הגולם. לאחר מכן הסר במהירות את המוח תוך שמירה על חוט העצב הגחוני שלם ומחובר. לאחר חיתוך החלק העליון של קצה פלסטיק של 20 מיקרוליטר, הרטיבו את קצה הפיפטה והשתמשו בו כדי להעביר בזהירות את מוח האישונים לצלחות המדיום.

דגרו אותם בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי. לאחר הדגירה של מוחות הזחלים או האישונים למשך הזמן הרצוי, הסר את המדיום והוסף 500 מיקרוליטר של פורמלדהיד 4% במאגר PBST. יש לדגור למשך 15 דקות, ואז להחליף בפורמלדהיד טרי של 4% ולדגור למשך 15 דקות נוספות.

השתמש ב-XPBS אחד עם 0.5% טריטון X 100 כדי לשטוף את המוח ארבע פעמים במשך 10 דקות כל אחת. לאחר הכביסה האחרונה, דגרו את הדגימות למשך שעה. בפתרון חסימה.

הוסיפו נוגדנים ראשוניים בתמיסת החסימה ודגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, שטפו את הדגימות עם PBST ארבע פעמים למשך 10 דקות כל אחת. לאחר מכן דגרו בנוגדנים משניים בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות.

חזור על שלבי הכביסה כדי להרכיב את המוח למיקרוסקופיה. התחל באיזון והרכבת מדיום למשך שעה והרכיב אותם על שקופיות זכוכית כדי למנוע ריסוק הדגימות. הניחו שבבי זכוכית משני הצדדים.

לאחר מכן יש למרוח את החלקות הכיסוי לאחר איטום החלקות הכיסוי בלק. אחסן את השקופיות בחושך. איור זה מציג פאנל של מוחות זחלי כוכב שלישי מזבובים וזבובים מסוג בר המבטאים נגזרת שלילית דומיננטית של CDK חמש או CDK חמש dn, שניהם מבטאים אקטין GFP בגוף הפטרייה או בנוירוני גמא MB כפי שתואר קודם לכן, יש אזור באקסונים הפרוקסימליים של נוירוני גמא מסוג פרא שאינו מצליח לצבור אקטין GFP, ובכך מופיע כאזור ברור ובאופן פאסיבי שני חלבונים מצטברים באקסונים רק עד לגבול הגחון של אזור זה.

הקווים המקווקוים מצביעים על מיקומו של הברונזה התיכונה ומדגישים את האזור הברור הפועל ואת גבול הגחון שלו. בזבובים המבטאים CDK חמישה dn. האזור הצלול של האקטין נעדר ומבחינה פאסיתית, שניים או מהר, שתי תגובתיות חיסונית מתפשטות בגב דרך אותו אזור בשיטה המוצגת כאן לתרבית ex vivo של מוחות זבובים מסוג בר טופלו בשילוב של המעכבים הפרמקולוגיים של CDK חמש פעילות, ROS, קוטין ו-ene.

מוצג כאן פאנל של מוחות זחלי כוכב שלישי של ביקורת וזבובי בר שטופלו בתרופות הדומים לזבובים, המבטאים CDK שלילי דומיננטי חמישה מוחות מבנה שטופלו בחמישה מעכבי CDK במשך 24 שעות מראים את האובדן האופייני של פעולה באזור ברור ושינוי מהיר. שני קווים לבנים גבוליים מראים את המיקום של הכתב הפראי במהירות. שני גבולות המוצגים כאן הם סדרה מייצגת של גופי פטריות דרוזופילה מאפס עד 10 שעות.

PF מסומן עם ממברנה ממוקדת. MCD שמונה סוגריים GFP מציינים את ההקרנות הדנדריטיות של ה-MB המכונה הגביע לפני המטמורפוזה. אקסוני MB עוברים גב גחון בצרורות עבים ואות פלואורסצנטי עולה מהסוכה הדנדריטית הצפופה.

עמודה זו מציגה מוחות שנותחו בזמן שצוין. שימו לב לגיזום הדנדריטים באזור המצוין על ידי הסוגריים כך שתוך שש עד שמונה שעות PF, האות הדנדריטי של האובך נעלם. המוחות בטור זה נותחו באפס שעות A PF לפני הפעולה הפנימית.

ספייק דייסון ו-x vivo מתורבת בזמנים הצביעו על כך שאלו לא מראים גיזום התפתחותי של דנדריטים. במקום זאת, האות הדנדריטי נמשך ב-10 שעות PF כדי לעקוף את ה-PPR הזה המסומן באפס שעות EPF, אך מנותח ב-1.5 שעות PF ומתורבת. עמודה זו מציגה סדרה מייצגת של גופי פטריות DLA אלה מאפס עד 10 שעות.

PF כמו בדגימות הלא מתורבתות, האות הדנדריטי אינו ניתן לגילוי על ידי שמונה שעות PF. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבית מוחות רוסלר ex vivo. אתה אמור להיות מסוגל לבודד מוחות מזחל בשלב מאוחר או PrepU לבן לפני או אחרי עליית ההורמונים שמתחייבת למטמורפוזה. לאחר מכן אתה אמור להיות מסוגל לנתח חומר קבוע על ידי מיקרוסקופיה או להשתמש במוח כחומר התחלתי להדמיה חיה.