הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות תעתיקי RNA בודדים בתאים חיים בזמן אמת. זה מושג על ידי הכלאה ראשונה של שני אוליגונוקלאוטידים שתוכננו ליצור בדיקה היוצרת סיכת ראש המכונה מטרד יחס על ידי משואה מולקולרית. השלב השני הוא טיהור מטרי יחס על ידי משואות מולקולריות לפי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל.

לאחר מכן, מדד היחס על ידי משואות מולקולריות מוכנס לתאים המבטאים את מטרת ה-RNA המהונדסת באמצעות מיקרו נקבוביות. השלב האחרון הוא לראות את התאים לתוך צלחת מיקרובאר המתאימה למיקרוסקופיה של תאים חיים. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשת לניטור התנועות של תעתיקי RNA בודדים המופיעים ככתמים פלואורסצנטיים בהירים בתוך תאים בודדים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בבדיקות סינתטיות שהן יציבות צילום בהירות, ומציגות אות גבוה לרקע, מה שפותח את האפשרות לדמות כל RNA אנדוגני התחל בהכנת מטריית היחס על ידי משואות מולקולריות או RBM BS על ידי ערבוב הריאגנטים הבאים בצינור. 20 מיקרוליטר של Rbm B אחד 30 מיקרוליטר של Rbm B שני שישה מיקרוליטר של 10 x מאגר פוספט, וארבעה מיקרוליטרים של DNA ו-RNA ללא מים. זה בדרך כלל מספיק לכ-50 מחקרים.

דוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בינתיים, הכינו עמודת כרומטוגרפיה נוזלית להסרת כל שני אוליגונוקלאוטידים היברידיים של האו"ם RBM B. השתמש ב-75 חפיסות על בדרגת הכנה בעמודת כרומטוגרפיה נוזלית של שמונה מיליליטר עם נפח מיטה של כארבעה מיליליטר באמצעות משאבת מזרק הפועלת בקצב זרימה של 0.6 מיליליטר לדקה.

שטפו ואזנו את ה-SUEx עם כ-50 מיליליטר של מאגר פוספט אחד לפני שכל הנוזל נכנס לנפח המיטה. עצור את משאבת המזרק, נתק אותה ותן לנוזל הנותר לעבור דרך העמוד על ידי כוח הכבידה. לאחר מכן, טען את תערובת ה-RBMB על עמודת הכרומטוגרפיה.

לאחר שדגימת ה-RBMB נכנסה לחלוטין למיטה, הוסף לאט לאט עוד 250 מיקרוליטר של מאגר פוספט אחד לחלק העליון של המיטה כדי להבטיח שהדגימה כולה נכנסה לחלוטין לעמודה. מלאו את העמודה עד השפה במאגר פוספט אחד. סגור את החלק העליון והפעל את משאבת המזרק.

המזרק מלא בכ-50 מיליליטר של XPBS אחד ופועל בקצב זרימה של 0.6 מיליליטר לדקה. בדרך כלל, ניתן לדמיין בקלות את דגימת ה-RBMB בשל צבע הצבע המשולב בבדיקה. ברגע שה-RBMB מתקרב לתחתית העמודה, אסוף את הזרימה בשתי טיפות לכל צינור מיקרו צנטריפוגה.

הפסק לאסוף את הדגימה. לאחר שצבע הדגימה בתוך צינורות המיקרו צנטריפוגה מתבהר, שלב את הצינורות המכילים את דגימת ה-RBMB הצבעונית, בדרך כלל חמישה עד שישה צינורות וטען למכשיר סינון צנטריפוגלי. צנטריפוגה את הדגימה ב 10, 000 RCF למשך 20 דקות או עד לנפח הרצוי.

מהירות וזמן אלה יניבו בדרך כלל נפח סופי של כ-30 מיקרוליטר. בפרוטוקול זה, קו תאי סרקומה פיברו אנושי הונדס לבטא Q-F-P-R-N-A עם 96 חזרות טנדם של רצף המטרה RBMB בשלושת ה-UTR הראשוניים, קו תאי הבקרה תוכנן לבטא סוג פרא Q-F-P-R-N-A יום אחד לפני תאי לוחית אספקת הבדיקה בבקבוק T 25 בתרבית שטף של 40 עד 50%. התאים עם מדיית DMEM השלימו 1% סטרפטוקוקוס עט ו-10% סרום בקר עוברי ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למחרת.

הפעל את המיקרו והגדר את פרמטרי המיקרו פורטציה המותאמים לתאי HT 10 80. מלאו את צינור המיקרו פוריון בארבעה מיליליטר של מאגר אלקטרוליטי והניחו אותו על תחנת הכנת המיקרו. הפשירו דגימת מלאי של RBMB מטוהר ודללו מספר מיקרוליטרים לריכוז סופי של 12 מיקרומולר עם מאגר פוספט אחד.

יש צורך במיקרוליטר אחד לכל מיקרו פוריון. עבור כל תגובת מיקרו פוריון פיפטה מיליליטר אחד של מדיום תרבית עם FBS, אך ללא אנטיביוטיקה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה. הנח אותו בצד ליד מכשיר המיקרו פוריון.

הוא ישמש מאוחר יותר להשעיית התאים מיד לאחר הכנת המיקרו. לא משתמשים באנטיביוטיקה מכיוון שהיא מפחיתה את כדאיות התאים לאחר הכנה מיקרו. תאי HT 10 80 המהונדסים שצופו ביום הקודם אמורים להיות כעת 60 עד 80% מתלכדים.

הסר את מצע תרבית התאים ושטוף את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של סידן ומגנזיום DPBS ללא דגירה עם מיליליטר אחד של טריפסין למשך דקה עד שתיים. עצרו את הטריפסין על ידי הוספת מיליליטר אחד של חומר DMEM בתוספת סרום בקר עוברי 10% ללא אנטיביוטיקה ופנול אדום והעבירו את התאים לשני צינורות מיקרו צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר. סובב את התאים בצינור המיקרו צנטריפוגה ב-200 פעמים G למשך חמש דקות.

הסר את ה-supernatant resuspend ושלב את כדורי התא בנפח סופי של מיליליטר DPBS אחד. הסר 10 מיקרוליטר מתרחיף התאים המעורבב היטב כדי לספור את התאים, פיפטה את התאים למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לוודא שהם מפוזרים היטב והעביר 300,000 תאים עם DPBS לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. סובב ב -200 פעמים G למשך חמש דקות.

הסר את הסופרנטנט תוך זהירות לא להפריע לכדור התא. השעו מחדש את הגלולה ב-11 מיקרוליטר של תרחיף, חיץ ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח שהתאים מפוזרים היטב. הקפד לא ליצור בועות אוויר.

מוסיפים מיקרוליטר אחד של ה-RBMB המדולל ומערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. שוב, היזהר לא ליצור בועות אוויר. זה קריטי להימנע מהכנסת בועת אוויר כלשהי למתלה המכירות של RBMB מכיוון שבועות אוויר יגרמו לניצוץ במהלך פעולת המיקרו ויגרמו לאספקת RBMB לקויה ולמקרי מוות בתאים.

בעזרת הכנת המיקרו פיפטה שואבת 10 מיקרוליטר מתערובת תאי ה-RBMB ומכניסים את הפיפטה לצינור הכנת המיקרו. לחץ על כפתור ההתחלה כדי להפעיל את התאגיד הקטן. לא אמורות להיות בועות אוויר גלויות בקצה כאשר מסך המיקרו פור מראה השלמה.

הוציאו את הפיפטה מהתחנה והוציאו את תערובת המיקרו-ליטר לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה שהוכן קודם לכן המכיל מיליליטר אחד של מדיום תרבית עם FBS, אך ללא אנטיביוטיקה מעורבבת בעדינות על ידי נדנוד הצינור מצד לצד מספר פעמים. סובב את התאים ב -200 פעמים G למשך חמש דקות. שטפו את התאים פעמיים במיליליטר אחד של מדיום תרבית ללא פנול אדום עם FBS, אך ללא אנטיביוטיקה כדי להסיר כל rbm BS שלא הועבר לתאים.

לאחר הכביסה השנייה. Resus משהה את התאים ב-400 מיקרוליטר של מדיום תרבית פנול אדום חופשי עם FBS, אך ללא אנטיביוטיקה. צלחו את התאים הפרו-פרואטיים לתוך זכוכית כיסוי מצופה פולי דה ליזין שהוכנה בעבר בציפוי שמונה תאים היטב ב-200 מיקרוליטר לבאר או בשטף הרצוי.

הנח את זכוכית הכיסוי בתא לתוך חממת תרבית תאים. ניתן לבצע הדמיה כבר 30 דקות לאחר הכנת המיקרו. כדי להתחיל בהליך זה, הפעל את מערכת הדגירה העליונה של שלב התא החי ואזן אותה עד שהיא מגיעה ל-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-75% לחות.

הפעל את המיקרוסקופ ואת מקור האור הפלואורסצנטי ופתח את תוכנת רכישת התמונות המטמורפיות. מרחו שמן טבילה על המטרה. העבירו את זכוכית הכיסוי בתא עם תאים מיקרו נקבוביים לשלב התא החי.

מערכת דגירה עליונה. דגרו את מערכת הבמה העליונה עד להתייצבות הטמפרטורה ורמות הפחמן הדו חמצני. פתח את כרטיסיית הרכישה בתוכנת המטמורף.

לחץ על כפתור הצג בשידור חי כדי למצוא את השדה. כוונן את המיקוד תחת אור לבן ולחץ על כפתור עצור חי. תחת הכרטיסייה רכישה.

לחץ ופתח את כפתור רכישת הזרם הקופץ והגדר את הפרמטרים הרצויים לרכישת סרטים. רכוש 150 פריימים באמצעות מסנן SCI five CF six 40 R. שמור את התמונות בכונן הקשיח.

מוצגות כאן תמונות מייצגות של תאי HT 10 80 המבטאים ביציבות RNA עם 96 חזרות טנדם, או ארבע חזרות טנדם של אתר קשירת ה-RBMB בשלושת ה-UTR הראשוניים. לאחר האספקה התוך-תאית של MBS. נוכחותם של 96 חזרות טנדם מאפשרת לתעתיקי RNA בודדים להופיע ככתמים פלואורסצנטיים בהירים.

לעומת זאת, RNA המכיל רק ארבע חזרות טנדם מופיעים ככתמים פלואורסצנטיים עמומים מאוד ולעתים קרובות ניתנים לזיהוי רק באזורים עם רקע נמוך במיוחד. רכישת תמונות זורמות מאפשרת לצלם תעתיקי RNA בודדים בזמן אמת. ניתן לראות בקלות תעתיקי RNA בודדים בתוך הציטופלזמה והגרעין של התאים העוברים תנועות בראוניאן או תת-דיפוזיות.

במקרים נדירים, RNA העובר הובלה מכוונת ייצפה כפי שמוצג כאן. תעתיקי RNA העוברים הובלה מכוונת נעים בדרך כלל במהירות לאורך נתיב ישר. במונטאז' זה, המסלול של תעתיק ה-RNA מוצג על גבי מסגרת אחת של סדרת הזמן.

תנועות ה-RNA המכוונות תואמות את הובלת ה-RNA לאורך מיקרו-צינורות ומיקרו-חוטים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ולטהר מטריה גזעית על ידי משואות מולקולריות. העברת מטריה גזעית על ידי משואות מולקולריות לתאים באמצעות מיקרו פריון ותעתיקי RNA בודדים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.