הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא הדמיה של תמלילי RNA בודדים בתאים חיים בזמן אמת. דבר זה מושג תחילה על ידי היברידיזציה של שני אוליגונוקלאוטידים שתוכננו ליצירת גשש במבנה סיכה, המכונה ratio metric molecular beacon. השלב השני הוא טיהור של ה-ratio metric molecular beacons באמצעות כרומטוגרפיית הֶחְלָפָה של גודל (size exclusion chromatography).

בשלב הבא, מוכנסים לתאים המבטאים את יעד ה-RNA המהונדס מדדי יחס באמצעות molecular beacons, באמצעות microporation. השלב הסופי הוא העברת התאים לפלטת microwell המתאימה למיקרוסקופיה של תאים חיים. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לנטר את תנועתם של תמלילי RNA בודדים, המודגמים כנקודות פלואורסצנטיות בהירות בתוך תאים בודדים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא עושה שימוש בגששים סינתטיים שהם בהירים, יציבים בפני פוטו-דיגראדציה ומציגים יחס גבוה של אות לרקע, דבר הפותח את האפשרות להדמיה של כל RNA אנדוגני. התחל את הכנת הרציומטרי באמצעות molecular beacons או RBM BS על ידי ערבוב הרכיבים הבאים במבחנה: 20 µL של Rbm B one, 30 µL של Rbm B two, 6 µL של 10x phosphate buffer, ו-4 µL של DNAs and RNAs free water. כמות זו מספיקה בדרך כלל לכ-50 בדיקות.

דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בינתיים, הכינו עמודת כרומטוגרפיה נוזלית להסרת אוליגו-נוקלאוטידים של RBM B two שלא עברו היברידיזציה. השתמשו ב-75 prep grade super decks בעמודת כרומטוגרפיה נוזלית של 8 milliliters עם נפח מיטה של כ-4 milliliters, באמצעות משאבת מזרק הפועלת בקצב זרימה של 0.6 milliliters לדקה.

יש לשטוף ולהאזן את ה-SUEx עם כ-50 מיליליטר של בופר פוספט בריכוז one x לפני שכל הנוזל חודר לנפח המצע. יש להפסיק את פעולת משאבת המזרק, לנתק אותה, ולהניח לשארית הנוזל לעבור דרך העמודה באמצעות כוח הכבידה. לאחר מכן, יש להעמיס את תערובת ה-RBMB על עמודת הכרומטוגרפיה.

לאחר שדגימת ה-RBMB נכנסה לחלוטין לעמוד, יש להוסיף לאט 250 µL נוספים של phosphate buffer בריכוז 1x לחלקו העליון של העמוד כדי להבטיח שכל הדגימה נכנסה לחלוטין לעמוד. יש למלא את העמוד עד לשפתו ב-phosphate buffer בריכוז 1x. סגור את החלק העליון והפעל את משאבת המזרק.

ממלאים את המזרק בכ-50 milliliters של XPBS אחד ומפעילים אותו בקצב זרימה של 0.6 milliliters לדקה. בדרך כלל, ניתן להבחין בקלות בדגימת ה-RBMB בשל צבע הצבע המוטמע בגשושית. ברגע שדגימת ה-RBMB מתקרבת לתחתית העמוד, אוספים את התסנין בקצב של שתי טיפות לכל מבחנת מיקרו-צנטריפוגה.

הפסיקו את איסוף הדגימה. ברגע שצבע הדגימה בתוך מבחנות המיקרו-צנטריפוגה הופך לשקוף, שילו למבחנה אחת את המבחנות המכילות את דגימת ה-RBMB הצבעונית, בדרך כלל חמש עד שש מבחנות, והעבירו למכשיר סינון צנטריפוגלי. צנטריפוגו את הדגימה ב-10,000 RCF למשך 20 דקות או עד להשגת הנפח הרצוי.

מהירות וזמן אלו יניבו בדרך כלל נפח סופי של כ-30 microliters. בפרוטוקול זה, שורת תאי פיברוסרקנומה אנושית הונדסה להביע Q-F-P-R-N-A עם 96 חזרות טנדם של רצף המטרה RBMB ב-three prime UTR; שורת תאי הבקרה הונדסה להביע Q-F-P-R-N-A מסוג wild type יום אחד לפני העברת הגששים. זרעו את התאים בבקבוק T 25 בצפיפות תרבית של 40% עד 50%. השתמשו במצע DMEM בתוספת 1% pen strep ו-10% fetal bovine serum והדגרימו בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide עד ליום למחרת.

הפעילו את המיקרופורטור והגדירו את פרמטרי המיקרופורציה שעברו אופטימיזציה עבור תאי HT 10 80. מלאו את צינור המיקרופורציה בארבעה מיליליטר של בופר אלקטרוליטי והניחו אותו על תחנת ההכנה למיקרופורציה. הפשירהו דגימת מלאי של RBMB מופק ודהלו מספר מיקרוליטרים לריכוז סופי של 12 micromolar באמצעות בופר פוספט 1x.

דרוש מיקרולטר אחד עבור כל מיקרו-פוריון. עבור כל תגובת מיקרו-פוריון, העבר בפיפטה מיליליטר אחד של מצע תרבית עם FBS, אך ללא אנטיביוטיקה, אל מבחנת מיקרו-צנטריפוגה. הנח אותה בצד, בקרבת מכשיר המיקרו-פוריון.

הוא ישמש מאוחר יותר לתליה של התאים מיד לאחר ההכנה המיקרוסקופית. לא נעשה שימוש באנטיביוטיקה מכיוון שהיא הייתה מפחיתה את חיוניות התאים לאחר ההכנה המיקרוסקופית. תאי HT 10 80 ההנדסיים שנזרעו ביום הקודם אמורים להיות כעת ב-60 עד 80% התמססות (confluence).

הסר את מצע תרבית התאים ושטוף את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של DPBS נטול סידן ומגנזיום. דגרי עם מיליליטר אחד של trypsin למשך דקה אחת עד שתי דקות. עצור את פעולת ה-trypsin על ידי הוספת מיליליטר אחד של מצע DMEM המועשר ב-10% fetal bovine serum ללא אנטיביוטיקה ו-phenol red, והעבר את התאים לשתי מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. סבב את התאים במבחנת המיקרו-צנטריפוגה ב-200 ×g למשך חמש דקות.

הסיר את העל-נוזל (supernatant), השעה ושלב את משקעי התאים בנפח סופי של 1 מיליליטר DPBS. העבר 10 מיקרוליטר מהסספנסיית התאים המעורבבת היטב לצורך ספירה, העלה והורד את התאים באמצעות פיפטה מספר פעמים כדי לוודא שהם מפוזרים היטב, והעבר 300,000 תאים עם DPBS למבחנה חדשה של 1.5 מיליליטר למיקרו-צנטריפוגה. סבב ב-200 ×g למשך חמש דקות.

הסר את הנוזל העליון (supernatant) בזהירות כדי לא להפריע למשקע התאים. השהה מחדש את המשקע ב-11 µL של בופר Resus suspension, ובצע שאיבה והזרקה (pipetting) מספר פעמים כדי להבטיח שהתאים מפוזרים היטב. הקפד לא ליצור בועות אוויר.

הוסיפו מיקרוליטר אחד של RBMB המדולל וערבבו היטב באמצעות שאיבה ופליטה חוזרת (pipetting) של הנוזל מספר פעמים. שוב, יש להיזהר לא ליצור בועות אוויר. קריטי למנוע חדירת בועות אוויר לתוך תרחיף המכירה של ה-RBMB, מכיוון שבועות אוויר יגרמו לניצוץ במהלך הפעולה המיקרוסקופית ויובילו לאספקה לקויה של ה-RBMB ולמוות של תאים.

באמצעות פיפטת ההכנה המיקרוסקופית, שאבו 10 µl מתערובת תאי ה-RBMB והכניסו את הפיפטה לשפופרת ההכנה המיקרוסקופית. לחצו על כפתור ההפעלה כדי להתחיל את התהליך המיקרוסקופי. לא אמורות להופיע בועות אוויר נראות בקצה הפיפטה כאשר המסך של המכשיר מראה את סיום הפעולה.

הוציאו את הפפטה מהתחנה ורוקנו את תערובת ה-10 µL אל תוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה שהוכנה מראש ומכילה מיליליטר אחד של מצע תרבית עם FBS, אך ללא אנטיביוטיקה, וערבבו בעדינות על ידי נטילת המבחנה מצד לצד מספר פעמים. סובבו את התאים במהירות של 200 ×g למשך חמש דקות. שטפו את התאים פעמיים במיליליטר אחד של מצע תרבית ללא phenol red עם FBS, אך ללא אנטיביוטיקה, כדי להסיר rbm BS שאינם הוכנסו לתאים.

לאחר השטיפה השנייה, השעה מחדש את התאים ב-400 µL של מצע גידול ללא phenol red עם FBS, אך ללא אנטיביוטיקה. זרע את התאים במיקרו-פיפט לכיסוי זכוכית בעל שמונה תאים מצופה poly-D-lysine שהוכן מראש, בנפח של 200 µL לכל תא או בצפיפות (confluency) הרצויה.

הניחו את זכוכית הכיסוי עם התא בתוך אינקובטור לתרביות תאים. ניתן לבצע דימוי כבר 30 דקות לאחר ההכנה המיקרוסקופית. כדי להתחיל בהליך זה, הפעילו את מערכת האינקובציה העליונה של במת התאים החיים והמתינו עד להגעה לשיווי משקל של 37 °C, 5% carbon dioxide ו-75% humidity.

הדלק את המיקרוסקופ ואת מקור האור הפלואורסצנטי ופתח את תוכנת רכישת התמונות metamorph. מרח שמן אימרסיה על העדשה. העבר את זכוכית הכיסוי בעלת התא עם התאים בעלי הנקבים לבמה לתאים חיים.

מערכת דגירה עליונה. דגרו את המערכת העליונה של הבמה עד להתייצבות הטמפרטורה ורמות הפחמן הדו-חמצני. פתחו את לשונית הרכישה (acquire) בתוכנת ה-metamorph.

לחצו על כפתור show live כדי למצוא את השדה. כוונו את הפוקוס תחת תאורה לבנה ולחצו על כפתור stop live. תחת לשונית acquire.

לחצו ופתחו את כפתור החלון הקופץ לרכישת הזרם והגדירו את הפרמטרים הרצויים לרכישת הסרט. רכשו 150 פריימים באמצעות המסנן SCI five CF six 40 R. שמרו את התמונות בכונן הקשיח.

מוצגות כאן תמונות מייצגות של תאי HT 10 80 המבטאים באופן יציב RNA עם 96 חזרות טנדם, או ארבע חזרות טנדם של אתר קישור RBMB ב-UTR של הקצה ה-three prime. לאחר הובלה תוך-תאית של mbs. נוכחותן של 96 חזרות טנדם מאפשרת לתמלילי RNA בודדים להופיע כנקודות פלואורסצנטיות בהירות.

לעומת זאת, RNA המכיל רק ארבעה חזרות טנדם מופיע כנקודות פלואורסצנטיות עמומות מאוד, ולעתים ניתן לזהותן רק באזורים עם רקע נמוך באופן חריג. רכישת תמונות זרימה (streaming images) מאפשרת הדמיה של תמלילי RNA בודדים בזמן אמת. ניתן לראות בקלות תמלילי RNA בודדים בתוך הציטופלזמה והגרעין של תאים המבצעים תנועות בראוניות או תנועות סוב-דיפוזיות.

במקרים נדירים, ניתן יהיה להבחין ב-RNA העובר תעתוע מכוון, כפי שמוצג כאן. תמלילי RNA העוברים תעתוע מכוון נעים בדרך כלל במהירות לאורך נתיב ישר. במונטאז' זה, מסלולו של תמליל ה-RNA מוצג כשכבה מעל פריים בודד של סדרת הזמן.

תנועות ה-RNA המכוונות עקביות עם הובלת RNA לאורך מיקרוטובוליים ומיקרופילמנטים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ההכנה והטיהור של racial metric באמצעות molecular beacons. הוביל racial metric באמצעות molecular beacons אל תוך תאים באמצעות micro parion ובצע דמגון של תמלילי RNA בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.