Name: חרוזים טעינת חלבונים וחומצות גרעין לתוך תאים אנושיים חסידים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: למד את שיטת טעינת החרוזים להכנסת חלבונים, DNA ו-RNA לתאי יונקים חסידים. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה בזמן אמת ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה עם שימור תאיות וצמיחה תקינה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדת סטסביץ' על אינספור שיחות שעזרו לשפר ולפתח פרוטוקול זה. באופן ספציפי, ד"ר לינדה פוררו וד"ר פיל פוקס לעצה על חרוזים טעינת סוגי תאים שונים. ברצוננו להודות מקרב לב לד"ר יוקו היאשי-טקאנאקה, ד"ר יוקו סאטו וד"ר הירושי קימורה על ששיתפו את פרוטוקול טעינת חרוזי הזכוכית שלהם. אנו מודים מאוד לד"ר אשוק פראסאד וד"ר דייגו קראף על ששיתפו בנדיבות את פרוטוקולי טעינת החרוזים שלהם להכנסת חלקיקים אנאורגניים לתאים. אנו מודים לד"ר טראוויס סנדרס, קרייג מרשל וד"ר תומאס סנטאנג'לו על ששיתפו בנדיבות את ריאגנט הרנ"א שלהם. ALK, MNS, CAC, GG ו- TJS נתמכו על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R35GM119728 ומענק הקריירה של הקרן הלאומית למדע (NSF) MCB-1845761, שניהם ל- TJS. CAC נתמך גם על ידי פרס NSF NRT DGE-1450032.

1. חרוזי זכוכית נקיים, מעוקרים ויבשים כדי למנוע גושים ולהבטיח אפילו התפשטות על גבי התאים.
<ol><li>לחטא כ 5 מ"ל של חרוזי זכוכית נתרן הידרוקסיד (NaOH). למדוד את החרוזים בצינור חרוטי 50 מ"ל. יש להוסיף 25 מ"ל של 2 M NaOH ולערבב בעדינות באמצעות שייקר או סיבוב למשך 2 שעות.</li>
	<li>דקאנט NaOH, שמירה על חרוזים רבים ככל האפשר. אם החרוזים נמצאים בהשעיה, לסובב את הצינור של חרוזים לזמן קצר בצנטריפוגה (1 דקות ב ~ 1000 ×,טמפרטורת החדר).</li>
	<li>לשטוף את החרוזים ביסודיות עם מים ברמת תרבית התא עד pH הוא נייטרלי (להשתמש ברצועת בדיקת pH על האלנט כדי לאשר pH נייטרלי). תקבעו את המים בכל פעם, כמו קודם.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים ביסודיות עם 100% אתנול 2-3x. דקאנט האתנול בכל פעם, כמו קודם.</li>
	<li>ייבש את החרוזים. מפזרים את החרוזים ליצירת שכבה דקה בתוך מיכל סטרילי (כגון צלחת פטרי 10 ס"מ). משאירים את המיכל פתוח, תן את האוויר חרוזים יבש בארון בטיחות ביולוגית לילה. ודא כי החרוזים יבשים לחלוטין על ידי הקשה או לנער בעדינות את המיכל ולבדוק כי החרוזים יש מרקם חולי ללא גושים או מתקלף.</li>
	<li>UV-לעקר את החרוזים היבשים במשך 15 דקות.</li>
</ol>2. להרכיב את מנגנון מטעין החרוזים.
<ol><li>הדק חלקת רשת (פוליפרופילן או חומר שווה ערך, פתחי 105 מיקרומטר כדי לאפשר לחרוזים לעבור דרכם) כדי לכסות את כל הפתח של תא ההחזקה של החרוזים בנייר דבק או מהדק את הרשת בין הקצות הזכריים והנקביים של תא הדמיה רב-תכליתי (איור 1A).</li>
	<li>UV-לעקר את המנגנון במשך 15 דקות. מוסיפים את החרוזים למנגנון ולאטום אותו בחוזקה עם סרט שעווה. הערה: חיוני כי החרוזים נקיים ויבשים לחלוטין בשלב זה. הם צריכים להיות משוחררים ולהיראות חוליים ללא גושים. אם הם לא מופיעים כך, לשטוף מחדש ולייבש לחלוטין את החרוזים.</li>
	<li>יש לאחסן את המנגנון במיכל אטום ויבש המיובש בג'ל סיליקה או במדיום ייבוש אחר. אם החרוזים הופכים לחים, אשר יהיה גלוי על ידי גושי חרוזים, יבש ביסודיות לעקר את מטעין החרוזים ולהחליף עם חרוזים טריים. הערה: כל אמצעי הזהירות הללו ימנעו מכל עובש או חיידק לגדול על או סביב החרוזים בתוך מטעין החרוזים. מנגנון מטעין החרוזים יכול להתבצע בדרכים שונות. ראה את הפרטים בדיון.</li>
</ol>3. הכינו תאים בתחתית זכוכית של תאים דבקים.
<ol><li>תאי יונקים דבקים זרעים על תא זכוכית 35 מ"מ בתחתית. ודא כי התאים הם כ 80% מפגש בזמן טעינת חרוזים. (ראה טבלה 1 לקבלת מידע נוסף אודות סוגי תאים שונים והערות על האפקטיביות של טעינת חרוזים בסוגי תאים שונים.) הערה: תאים יכולים להיות זרע רק microwell במרכז התא כדי לחסוך כמה תאים משמשים.</li>
	<li>לדגור על התאים בתנאים נורמליים עד שהם דבקים לחלוטין בכוס. הערה: חיוני כי צפיפות התא גבוהה מספיק וכי התאים דבקים בבטחה על הזכוכית. אם דרישות אלה אינן מתקיימות, סביר להניח שתאים יתקלף במהלך טעינת חרוזים. ניתן להאריך את ציר הזמן בין זריעת תאים לטעינת חרוזים כדי להבטיח הידבקות ומפגש נאותים של התא.</li>
</ol>4. תאי טעינת חרוזים
הערה: במידת הצורך, לשטוף את התאים בקצרה עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של המדיום האופטימלי. דגירה במשך 30 דקות לפחות.
<ol><li>הפוך פתרון של 3-8 μL המכיל את plasmids הרצוי, חלבון, ו/או חלקיקים. השתמש ~ 1 מיקרוגרם (0.1-1 pmol) של כל סוג של plasmid ו ~ 0.5 מיקרוגרם (0.01 נמול) של חלבון, בהתאם לדרישות ניסיוניות. השתמש צינור שמירה נמוכה עבור חלבונים, כך שהם לא נשארים מאחור על קירות הצינור. הביאו את הפתרון למינימום של 3 מיקרו-אל עם PBS, והתאמו את נפח הפתרון כך שיצפה את כל שטח התאים שיש לטעון (כלומר, המיקרווול של התא, איור 1B).</li>
	<li>מערבבים את הפתרון ביסודיות על ידי צנרת למעלה ולמטה ו / או הבהוב הצינור. סובבו בקצרה את הפתרון לתחתית הצינור במיקרו-פוגה על השולחן.</li>
	<li>מעבירים את תמיסת העמסת החרוזים ואת תא התאים למכסה המנוע של תרבית הרקמות. בצע את השלבים הנותרים במכסה המנוע תרבית הרקמות באמצעות טכניקה סטרילית.</li>
	<li>הסר את המדיום מהתאים ולאחסן אותו באופן זמני בצינור סטרילי. שאפו בעדינות את כל המדיום מסביב לשולי התא, הטה את התא בזווית של כ-45° והסר את טיפת המדיה הנותרת במיקרווול המרכזי. במהלך הסרה בינונית, הקפד להימנע מלתת קצה פיפטה לגעת בכוס, אשר עלול לגרום קילוף תא ואובדן. עבור במהירות לשלב הבא כך שהתאים לא יתייבשו לאורך זמן.</li>
	<li>מעבירים בעדינות את תמיסת העמסת החרוזים על מיקרווול הזכוכית במרכז התא. אופציונלי: דגירה עם נדנדה עדינה במשך ~ 30 s מבלי לאפשר לתא להתייבש לחלוטין.</li>
	<li>פזרו בעדינות שכבת מונו-שכבתית של חרוזי זכוכית על גבי התאים, רצוי באמצעות מנגנון העמסת חרוזים(איור 1A). ודא כי החרוזים לכסות את התאים ב microwell התחתון זכוכית לחלוטין.</li>
	<li>צובטים את התא בשתי אצבעות, מקישים עליו על משטח מכסה המנוע על ידי הרמתו ~ 2 אינץ 'והורדתו בחוזקה. השתמש בכוח שווה בערך כדי להפיל את המנה מגובה זה. חזור על הפעולה עבור סך של ~ 10 הקשות. הערה: ודאו שהברזים לא יקלפו את התאים באופן משמעותי. ניתן למטב הקשה עבור סוג התא. אם התאים נטענים בצורה גרועה, הקש חזק יותר; עם זאת, אם תאים רבים מתקלפים, הקש בקלילות רבה יותר.</li>
	<li>מוסיפים בעדינות בחזרה בינוני לתא על ידי צנרת איטית על צד הפלסטיק של התא. נסה לשאוף כל חרוזים צפים מבלי להפריע לתאים. הוסף מדיה מחוממת מראש בשלב זה אם הוסרה יותר מדי. לדגור על התאים במשך 0.5-2 שעות באינקובטור.</li>
	<li>לחטא את מטעין החרוזים למשך 15 דקות לפני החזרתו לאחסון בתנאי יובש.</li>
	<li>הוסף צבע (למשל, כתם ליגנד DAPI או HaloTag, במידת הצורך בניסוי) לתאים לפי הפרוטוקול המומלץ של היצרן.</li>
	<li>לשטוף את התאים 3x עם בינוני לפני הדמיה כדי להסיר את החרוזים ואת רכיבי טעינה עודף בפתרון. הימנע צנרת ישירות על תאים כדי למנוע מהם קילוף.</li>
</ol>5. הדמיה של התאים הטעונים על חרוזים
<ol><li>תמונה התאים מיד או כאשר נדרש על ידי הניסוי. השתמש במיקרוסקופ המסוגל ללכוד פלואורסצנטיות (לייזרים או מקור אור מונוכרומטי). ודא שאורכי הגל של העירור מתאימים לפלורופור או לצבע שנבחרו (לדוגמה, אור אורך גל של 488 ננומטר לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)). הערה: חלבונים טעונים חרוזים עשויים להיות בתמונה לאחר התאים התאוששו (ברגע 30 דקות טעינה לאחר טעינה עבור קווי התא המתוארים כאן). ביטוי Plasmid לוקח ≥2 h בהתאם לרכיבים וקטוריים של ביטוי (איור 1C, והסבר נוסף בדיון). הדמיה של תאים עמוסי חרוזים יכולה להתבצע על כל מיקרוסקופ המצויד במקורות הפלואורסצנטיים המתאימים הקשורים לבדיקות טעונות, מצלמה המסוגלת ללכוד תמונות פלואורסצנטיות, כגון התקן מטען מכפיל אלקטרונים (EMCCD) או מצלמת מוליך למחצה משלימה מדעית של תחמוצת מתכת (sCMOS), וחממה לשליטה בטמפרטורה, בלחות ובפחמן דו-חמצני. לקבלת מדריך למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, עיין ב- 27.</li>
</ol>

<ol><li>Stewart, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+strategies+for+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo strategies for intracellular delivery.</a> Nature. 538 (7624), 183-192 (2016).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).</li>
<li>Schenborn, E. T., Goiffon, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEAE-dextran+tansfection+of+mammalian+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DEAE-dextran tansfection of mammalian cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 130, 147-153 (2000).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+somatic+cells+with+micropipettes%3A+comparison+with+other+transfer+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microinjection of somatic cells with micropipettes: comparison with other transfer techniques.</a> Biochemical Journal. 223 (2), 281-291 (1984).</li>
<li>Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+monoclonal+antibodies+into+mammalian+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15494-15500 (1989).</li>
<li>Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+electroinjection+method+for+introducing+proteins+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells.</a> American Journal of Physiology. 260 (2), 355-363 (1991).</li>
<li>Potter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 62 (1), 1-6 (2003).</li>
<li>Fawell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat-mediated+delivery+of+heterologous+proteins+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (2), 664-668 (1994).</li>
<li>Prior, T. I., FitzGerald, D. J., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+mediated+by+domain+II+of+Pseudomonas+exotoxin+A%3A+transport+of+barnase+into+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Translocation mediated by domain II of Pseudomonas exotoxin A: transport of barnase into the cytosol.</a> Biochemistry. 31 (14), 3555-3559 (1992).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3185-3190 (2001).</li>
<li>Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+single+molecule+microscopy+reveals+two+kinetically+distinct+pathways+for+microRNA+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly.</a> EMBO Reports. 13 (8), 709-715 (2012).</li>
<li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> The Journal of Cell Biology. 98 (4), 1556-1564 (1984).</li>
<li>Ortiz, D., Baldwin, M. M., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+correction+of+genetic+defects+in+cultured+animal+cells+by+introduction+of+functional+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transient correction of genetic defects in cultured animal cells by introduction of functional proteins.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 3012-3017 (1987).</li>
<li>McNeil, P. L., Warder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glass+beads+load+macromolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Glass beads load macromolecules into living cells.</a> Journal of Cell Science. 88 (5), 669-678 (1987).</li>
<li>Hayashi-Takanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epigenetic+histone+modifications+in+single+cells+using+Fab-based+live+endogenous+modification+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling.</a> Nucleic Acids Research. 39 (15), 6475-6488 (2011).</li>
<li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352 (6292), 1425-1429 (2016).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li>
<li>Zhao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+probe+for+imaging+nascent+and+mature+HA-tagged+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded probe for imaging nascent and mature HA-tagged proteins in vivo.</a> Nature Communications. 10 (1), 2947(2019).</li>
<li>Jedlitzke, B., Mootz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocaged+nanobodies+delivered+into+cells+for+light+activation+of+biological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhotoChem%22%5BJournal%5D)">Photocaged nanobodies delivered into cells for light activation of biological processes.</a> ChemPhotoChem. 5 (1), 22-25 (2021).</li>
<li>Coulon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+competition+during+the+transcription+cycle+results+in+stochastic+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Kinetic competition during the transcription cycle results in stochastic RNA processing.</a> eLife. 3, 03939(2014).</li>
<li>Pichon, X., Robert, M. -C., Bertrand, E., Singer, R. H., Tutucci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+generations+of+MS2+variants+and+MCP+fusions+to+detect+single+mRNAs+in+living+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New generations of MS2 variants and MCP fusions to detect single mRNAs in living eukaryotic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 121-144 (2020).</li>
<li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+dynamics+of+IRES+and+cap+translation+with+single-molecule+resolution+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying the dynamics of IRES and cap translation with single-molecule resolution in live cells.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 27, 1095-1104 (2020).</li>
<li>Moon, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+single-molecule+tracking+of+mRNA+interactions+with+RNP+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Multicolor single-molecule tracking of mRNA interactions with RNP granules.</a> Nature cell biology. 21 (2), 162-168 (2019).</li>
<li>Moon, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+translation+quality+control+and+mRNA+targeting+to+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of translation quality control and mRNA targeting to stress granules.</a> Journal of Cell Biology. 219 (8), 202004120(2020).</li>
<li>Cialek, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+translational+control+by+Argonaute+with+single-molecule+resolution+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Imaging translational control by Argonaute with single-molecule resolution in live cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Forero-Quintero, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+spatiotemporal+organization+of+endogenous+RNA+polymerase+II+phosphorylation+at+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the spatiotemporal organization of endogenous RNA polymerase II phosphorylation at a single gene.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Lyon, K., Aguilera, L. U., Morisaki, T., Munsky, B., Stasevich, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+single+RNA+imaging+reveals+bursts+of+translational+frameshifting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell single RNA imaging reveals bursts of translational frameshifting.</a> Molecular Cell. 75 (1), 172-183 (2019).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Fluorescence+Microscopy.+General+Laboratory+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Introduction to Fluorescence Microscopy. General Laboratory Techniques.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Hayashi-Takanaka, Y., Yamagata, K., Nozaki, N., Kimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+histone+modifications+in+living+cells%3A+spatiotemporal+dynamics+of+H3+phosphorylation+during+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing histone modifications in living cells: spatiotemporal dynamics of H3 phosphorylation during interphase.</a> Journal of Cell Biology. 187 (6), 781-790 (2009).</li>
<li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+viability+by+the+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell viability by the MTT assay.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Stasevich, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RNA+polymerase+II+activation+by+histone+acetylation+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of RNA polymerase II activation by histone acetylation in single living cells.</a> Nature. 516 (7530), 272-275 (2014).</li>
<li>Besteiro, S., Michelin, A., Poncet, J., Dubremetz, J. -F., Lebrun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+a+Toxoplasma+gondii+rhoptry+neck+protein+complex+at+the+host+cell+membrane+to+form+the+moving+junction+during+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Export of a Toxoplasma gondii rhoptry neck protein complex at the host cell membrane to form the moving junction during invasion.</a> PLOS Pathogens. 5 (2), 1000309(2009).</li>
<li>Gilmore, A. P., Romer, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+focal+adhesion+kinase+%28FAK%29+signaling+in+focal+adhesions+decreases+cell+motility+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of focal adhesion kinase (FAK) signaling in focal adhesions decreases cell motility and proliferation.</a> Molecular Biology of the Cell. 7 (8), 1209-1224 (1996).</li>
<li>Emerson, N. T., Hsia, C. -H., Rafalska-Metcalf, I. U., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanodelivery+of+nanoparticles+to+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Mechanodelivery of nanoparticles to the cytoplasm of living cells.</a> Nanoscale. 6 (9), 4538-4543 (2014).</li>
<li>Manders, E. M. M., Kimura, H., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+imaging+of+DNA+in+living+cells+reveals+the+dynamics+of+chromosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct imaging of DNA in living cells reveals the dynamics of chromosome formation.</a> Journal of Cell Biology. 144 (5), 813-822 (1999).</li>
<li>Memedula, S., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+recruitment+of+HAT+and+SWI%2FSNF+components+to+condensed+chromatin+by+VP16%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequential recruitment of HAT and SWI/SNF components to condensed chromatin by VP16.</a> Current Biology. 13 (3), 241-246 (2003).</li>
<li>Becker, T., Volchuk, A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+use+of+endoplasmic+reticulum+membrane+for+phagocytosis+in+J774+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential use of endoplasmic reticulum membrane for phagocytosis in J774 macrophages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4022-4026 (2005).</li>
<li>Molenaar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+telomere+dynamics+in+living+mammalian+cells+using+PNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualizing telomere dynamics in living mammalian cells using PNA probes.</a> The EMBO Journal. 22 (24), 6631-6641 (2003).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nature Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li>
<li>Sabri, A., Xu, X., Krapf, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+origin+of+heterogeneous+anomalous+diffusion+in+the+cytoplasm+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Elucidating the origin of heterogeneous anomalous diffusion in the cytoplasm of mammalian cells.</a> Physical Review Letters. 125 (5), 053901(2020).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+system+to+track+histone+modification+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded system to track histone modification in vivo.</a> Scientific Reports. 3, 2436(2013).</li>
<li>Sato, Y., Stasevich, T. J., Kimura, H. Visualizing the dynamics of inactive X chromosomes in living cells using antibody-based fluorescent probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSato%2C+Y+%22X-Chromosome+Inactivation.+Methods+in+Molecular+Biology%22">X-Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology</a>. 1861, Humana. New York, NY, USA. 91-102 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

טכניקת טעינת החרוזים המתוארת כאן היא שיטה חסכונית וחסכונית בזמן להכנסת מקרומולקולים וחלקיקים אחרים לתאים דבקים. תהליך רב-תכליתי זה יכול לטעון חלבון (איור 2A)15,16,26,27, שילוב של חלבון ו plasmids ( איור2B,C)22,25, RNA ( איור4C), 100 ו 250 ננומטר חרוזים פוליסטירן (התכתבות אישית), צבעים סינתטיים39 או נקודות קוונטיות34,40 . טעינת חרוזים עשויה להיות היכולת לטעון סוגים אחרים של חלקיקים בלתי חדירים ממברנה גם כן. היישום הנפוץ ביותר שלה הוא לטעינת נוגדנים או Fabs כדי למקד אפיטופים אנדוגניים, כגון שינויים לאחר תרגום (PTMs), לתאים חיים. מטרות, כגון PTMs, לעתים קרובות קשה לתייג בתאים חיים ללא מבוסס PTM ספציפי, גנטית מקודד בדיקות41,42. לעומת זאת, טעינת חרוזים יכולה להכניס סוגים מרובים של בדיקות, כתבים או כלים מולקולריים אחרים יחד לאותו תא לניטור קריאות מרובות בו זמנית. אנו צופים כי טעינת חרוזים תהיה טכניקה שימושית לטעינת מגוון של macromolecules או חלקיקים.
יתרון מרכזי של טעינת חרוזים הוא העלות הנמוכה: כל ניסוי עולה פחות מ 0.01 USD. ניתן נעשה בקלות באמצעות חומרים זולים שעולים בסך הכל ~ $ 150, וזה פחות יקר באופן משמעותי מכל שיטת טעינת תאים אחרת. ניתן להפחית עוד יותר את עלותו של מנגנון מטעין חרוזים אל מתחת ל-10 דולר על ידי החלפת תא המתכת לשימוש חוזר בתא פלסטיק. בשביל זה, או לקדוח חור בתא 35 מ"מ או להסיר את הזכוכית מתא זכוכית 35 מ"מ תחתון, ולאחר מכן להדק את הרשת במקום עם סרט. במקום מנגנון, טעינת חרוזים יכולה אפילו להתבצע באמצעות קצה פיפטה רחב נשא 1000 μL כדי לסקופ ומפזרים חרוזים על תאים, אם כי וריאציה זו מקשה על מפזרים monolayer של חרוזים על תאים (שלב 4.6).
יתרון נוסף של טעינת חרוזים הוא שהתאים יכולים לשמור על מורפולוגיה כללית נורמלית, להתאושש במהירות ולהמשיך לגדול ולחלק, לפחות עבור תאי U2OS, RPE1 ו- HeLa שנחקרו כאן ולקווי התאים האחרים שנחקרו במקומות אחרים (איור 3; איור 4א,ב'; וידאו משלים 1; ושולחן 1)31. במהלך טעינת חרוזים, תאים עוברים לחץ פיזי ולפעמים מחלצים ומתקלפים (כ -5% מהתאים מתקלפים בתנאים אופטימליים, אך אובדן תאים גדול יותר יכול לקרות אם טעינת חרוזים מבוצעת בעוצמה רבה מדי או יותר מדי חרוזי זכוכית נטענים על גבי התאים, כפי שמתואר באיור 3B). עם זאת, תאים עמוסי חרוזים שנותרו מחוברים לכיסוי נראים בדרך כלל בריאים וניתן לדמיין אותם כבר 30 דקות לאחר טעינת חרוזים (איור 3A). בדרך כלל אנו מאפשרים לתאים תקופת התאוששות של 30 דקות, אך צופים כי הדמיה מוקדמת יותר לאחר טעינת חרוזים היא אפשרית.
החיסרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתאים צריכים להיות מסוגלים לעמוד בלחץ פיזי קל במהלך הטעינה ולהישאר דבקים בבטחה בכיסוי. קווי תאים או תאים לא דבקים/לא דבקים הגדלים על לוחות מצופים (למשל, HEK ותאי גזע) מתנתקים לעתים קרובות בעת הקשה עדינה במהלך טעינת חרוזים. יתר על כן, הניסיון הראה כי נוירונים ראשוניים רגישים מדי עבור טעינת חרוזים.
טעינת חרוזים מתאימה ביותר לניסויים חד-תאיים או חד-תאיים. מניסיוננו, טעינת חרוזים יש בערך 20-40% יעילות טעינת חלבון, ~ 20% של תאים חרוזים גם ביטא plasmid טעון במשותף (איור 2A,B). לכן, פלסמידים טעינת חרוזים עשוי להיות פחות יעיל עבור ביטוי חלבון מאשר חרוז טעינת חלבונים מטוהרים כי plasmids חייב לא רק להיכנס לתאים אלא גם לבוא לידי ביטוי (אשר כרוך, בין היתר, ייבוא גרעיני, שעתוק, ותרגום, כל אחד מהם יכול להפחית את יעילות הביטוי). ניתן לעקוף את היעילות הנמוכה של ביטוי פלסמיד טעון חרוזים באמצעות פרוטוקולי טרנספקטיון חלופיים, כגון ליפופקטיון, לפני טעינת חלבונים או בדיקות16,27. בנוסף, דגירה של תאים במדיה אופטימלית למשך 30 דקות לפני טעינת חרוזים עשויה לסייע בביטוי פלסמיד. בשל ביטוי פלסמיד נמוך, טעינת חרוזים לא שימשה לעתים קרובות כחלופה transfection מבוסס ליפופקטיון במעבדה זו. היוצא מן הכלל היחיד הוא כאשר חלבון מטוהר, כגון Fab, הוא להיות טעון במשותף, ובמקרה זה זה די נוח לחרוז-לטעון את החלבון plasmid באותו זמן. יתר על כן, עבור תאים שאינם מגיבים או סובלניים ליפופקטיון, טעינת חרוזים עשויה לספק שיטה חלופית, אם כי יעילות נמוכה, לביטוי פלסמיד חולף.

טעינת מקרומולקולים לתאי יונקים מחייבת מתודולוגיה המאפשרת להם לחצות את קרום הפלזמה של התא1. מספר שיטות יכולות להכניס פלסמידים לתאי יונקים באמצעות טרנספקטציה, כולל טרנספקטציה ליפוזומית2 והעברת דיתילאמינואתיל-דקסטרן3. עם זאת, שיטות לטעינת חלבונים או חלקיקים אטומים לממברנה לתאים מוגבלות יותר.
מספר טכניקות עקפו את המשוכה הקשה הזו באמצעות אסטרטגיות שונות. ראשית, מיקרו-נסיגה מעבירה חלקיקים דרך מיקרופיט לתאים חיים תחת מיקרוסקופ4. אמנם ניתן לטעון את השיטה הנשלטת ביותר ופחות פולשנית, טכניקה זו היא תפוקה נמוכה יחסית כי תאים חייבים להיות טעונים אחד אחד. יתר על כן, microinjection דורש ציוד מיוחד והוא תובעני מבחינה טכנית.
שנית, אלקטרופורציה היא דרך להזריק חלבונים אלקטרו לתאים באמצעות הפרעה ממברנה הנגרמת מתח5,6,7. עם זאת, שיטה זו שוב דורשת ציוד מיוחד ויקר, וההלם יכול לגרום ללחץ תאים ותמותה. יתר על כן, תאים חייבים להיות טריפסינציה לפני electroporation ולאחר מכן נשתל, הגבלת מסגרת הזמן שבה תאים ניתן לחקור לאחר אלקטרופורציה.
שלישית, קרום התא עשוי להשתנות כימית עבור זמני, הפיך permeabilization8,9. טעינת סטרפטוליסין-O מכניסה אנדוטוקסין לקרומי התא, היוצר נקבוביות זמניות, ומאפשרת לחלקיקים אקסוגניים אטומים לקרום, כולל חלבונים ופלסטיות DNA, להיכנס לתאים10. לאחר התאוששות של 2 שעות, כמחצית מהתאים מתקנים את הנקבוביות האלה ומפסיקים את הפנמת החלקיקים מהפתרון. עם זאת, טכניקה זו דורשת זמן התאוששות ארוך והוא אינו עולה בקנה אחד עם סוגי תאים שאינם יכולים לסבול אנדוטוקסינים.
רביעית, הפרעה מכנית מעמיסה חלקיקים לתאים באמצעות הפרעה פיזית של קרום התא11. זה יכול להיעשות בדרכים מרובות, כולל גירוד, גירוד, וחרוזים מתגלגלים על גבי תאים12,13. כבר בשנת 1987, חרוזים שימשו לטעינת חלבונים לתאיםמכנית 14. לאחרונה, טכניקת טעינת החרוזים עברה אופטימיזציה והותאמה מעבר לחלבונים כדי לכלול טעינה של פלסמידים ורנ"א, כמתואר כאן.
העמסת חרוזים היא שיטה קלה, זולה ומהירה לטעינת חלבונים ופלסטידים לתאים אנושיים חסידים. חרוזי זכוכית מגולגלים לזמן קצר על גבי תאים, ומשבשים באופן זמני את הממברנה התאית שלהם. זה מאפשר לחלקיקים בתמיסה להיכנס. כמו טעינת חרוזים יש יעילות נמוכה, זה מתאים ביותר עבור מולקולה אחת או ניסויים מיקרוסקופיה של תא יחיד. העמסת חרוזים יכולה להכניס מגוון רחב של חלבונים, כולל נוגדנים מקוטעים (Fab),15,16 חלבונים מטוהרים כמו scFvs,17 inbodies,18,19, או חלבוני מעיל mRNA, למשל, חלבון שכבת MS2 (MCP)20,21. ניתן להוסיף וקטורים לביטוי פלסמיד גם לתמיסת החלבון ולהעמיס חרוזים בו זמנית22,23,24,25.
מעבר לחלבונים ולפלסמידים, מולקולות גדולות כמו 250 ננומטר חרוזי פוליסטירן הוכנסו לתאים באמצעות טעינת חרוזים (תקשורת אישית). טעינת חרוזים זולה להפליא, עולה פחות מ-0.01 דולר לניסוי בחומרים ולא דורשת ציוד יקר נוסף. העלות מופחתת עוד יותר על ידי מזעור כמות הבדיקות המשמשות לניסוי מכיוון שרק התאים במיקרווול המרכזי בקוטר 14 מ"מ של תא הדמיה נטענים. יש לציין כי אזור הטעינה המוגבל פירושו כי טעינת חרוזים אינה אידיאלית עבור טעינת תא בצובר.
כתב יד זה מציג את תהליך טעינת החרוזים, כולל כיצד לבנות את מנגנון טעינת החרוזים ולבצע ניסוי. הוא מראה כי חלבונים, RNA ו- DNA יכולים להיות נטענים לסוגי תאים שונים וכי שני חלבונים שונים, בו זמנית טעונים חרוזים יש ריכוזי תאים מתואמים מאוד ושונות נמוכה יחסית. כמו כן נדונים וריאציות בפרוטוקול המבוססות על סוג התא וטעינת חלבון, פלסמיד או RNA. למרות חרוזים נחשבים לנקב ולשבש את קרום התא, בעת ביצוע כראוי, תהליך טעינת חרוזים פורק רק מספר קטן של תאים מתחתית תא ההדמיה. לאחר תקופת התאוששות קצרה, התאים ממשיכים לגדול ולהתחלק. מתודולוגיה זו אידיאלית לניסויים במיקרוסקופיה של תאים חיים, כולל מעקב אחר חלבון חד-מולקולה ורנ"א, זיהוי שינויים לאחר תרגום, התבוננות במנגנונים תאיים דינמיים, או ניטור לוקליזציה תת-תאית15,16,22,26,27.

<table><tbody><tr><td>צלחות תרבית תאים 10 ס"מ</td><td>VWR</td><td>82050-916</td><td>השתמש לתרבית תאים</td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחות תרבית תאים</td><td>פלקון</td><td>353001</td><td>השתמש לבניית מעמיס חרוזים</td></tr><tr><td>Attofluor תא תא</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>A7816</td><td>השתמש לבניית מעמיס החרוזים המותאם אישית</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין</td><td>תרמו פישר</td><td>11960069</td><td>מדעי שימוש בתא כללי תרבית</td></tr><tr><td>Drierite המציין סופגים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07-578-3B</td><td>אחסן את מעמיס החרוזים בחומר ייבוש עם כדורי הספיגה הללו</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Atlas Biologics</td><td>F-0050-A</td><td>השתמש בתרבית תאים כללית וכתוסף לפני העמסת חרוזים</td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית, שטופים בחומצה ועוד; 106 ומיקרו; m*</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4649</td><td>מפזרים על תאים כדי להעמיס חרוזים DNA פלסמיד וחלבונים</td></tr><tr><td>כלים תחתונים מזכוכית, 35 מ"מ, #1.5, 14 מ"מ זכוכית</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>תאי זרעים על תאים אלה להדמיית</td></tr><tr><td>L-Glutamine-200 mM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>השתמש לייצור DMEM + מדיה</td></tr><tr><td>Opti-MEM, סרום מופחת Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>מדיה אופטימלית לדגירת תאים לפני טעינת חרוזים (שלב אופציונלי)</td></tr> <tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-032</td><td>סרט שעווה המשמש לבניית מעמיס חרוזים</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>השתמש לייצור DMEM + מדיה</td></tr><tr><td>ללא פנול DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31053036</td><td>השתמש בתאים לפני הדמיית</td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>מלאי עבודה של סטרילי 1X PBS</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>השתמש בתמיסה של 2 M לשטיפת חרוזי זכוכית</td></tr><tr><td>מסננים ארוגים ברשת ספקטרה, פוליפרופילן, 105 ומיקרו; m פתיחת</td><td>מעבדות ספקטרום</td><td>148496</td><td>שימוש לבניית מעמיס חרוזים</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300062</td><td>שימוש בתרבית תאים כללית</td></tr></tbody></table>

חרוזים טעינת חלבונים וחומצות גרעין לתוך תאים אנושיים חסידים

Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells

ניסויים רבים בהדמיה של תאים חיים משתמשים בחלקיקים אקסוגניים (למשל, פפטידים, נוגדנים, חרוזים) כדי לתייג או לתפקד בתוך התאים. עם זאת, החדרת חלבונים לתוך תא על פני הממברנה שלה קשה. הבחירה המוגבלת של השיטות הנוכחיות נאבקת ביעילות נמוכה, דורשת ציוד יקר ותובעני מבחינה טכנית, או פונקציות בתוך פרמטרים צרים. כאן, אנו מתארים טכניקה פשוטה וחסכונית יחסית לטעינת דנ"א, רנ"א וחלבונים לתאים אנושיים חיים. העמסת חרוזים מאפשרת הפרעה מכנית זמנית לקרום התא, ומאפשרת למקרומולקולים להיכנס לתאי יונקים חיים ודבקים. בפחות מ-0.01 דולר לניסוי, טעינת חרוזים היא שיטת טעינת התאים הזולה ביותר הזמינה. יתר על כן, טעינת חרוזים אינה מלחיצה תאים באופן משמעותי או משפיעה על הכדאיות או ההתפשטות שלהם. כתב יד זה מתאר את השלבים של הליך טעינת החרוזים, ההתאמות, הווריאציות והמגבלות הטכניות. מתודולוגיה זו מתאימה במיוחד להדמיית תאים חיים אך מספקת פתרון מעשי ליישומים אחרים הדורשים הכנסת חלבונים, חרוזים, RNA או פלסמידים לתאי יונקים חיים ודבקים.

העמסת חרוזים מכניסה חלבונים, פלסמידים וחלקיקים לתאי יונקים חסידים. טכניקת טעינת תאים זו זולה, מהירה ואינה משפיעה באופן מהותי על תקינות התא. הוא מתאים ביותר להדמיה של תאים חיים.

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing ...

טעינת חרוזים היא ניסיון זול לטעינת קרום, חלקיקים אטומים לתאים חסידיים חיים. פרוטוקול זה הוכיח שימושי מאוד עבור טעינת בדיקות עבור תא יחיד או מולקולה אחת או ניסויים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. העמסת חרוזים מאפשרת לחוקרים לטעון במהירות כל מיני מולקולות, כולל חלבונים, DNA, RNA, חלקיקים סינתטיים, או שילוב של אלה בו זמנית לתאים בודדים.בעת ביצוע הראשון של טעינת חרוזים, חשוב לבדוק את כוח ההקשה. קווי תאים מגיבים באופן שונה לטעינת חרוזים. וכך ניתן לשנות את מספר הברזים ואת עוצמתם לטעינת תאים אופטימלית תוך מזעור אפונה של התאים.כדי להדגים את ההליך מתיו סקסטון ואני יצטרפו לעמיתינו, ד"ר אמנדה קוק וגבריאל גלינדו. התחל על ידי מדידת כחמישה מיליליטר של חרוזי זכוכית בצינור חרוטי 50 מיליליטר. מוסיפים 25 מיליליטר של שני נתרן הידרוקסידי טוחן לצינור ומערבבים בעדינות במשך שעתיים באמצעות שייקר או רוטור.ספין במורד הצינור של חרוזים לזמן קצר בצנטריפוגה אם החרוזים נמצאים בהשעיה, ואז decant נתרן הידרוקסיד תוך שמירה על חרוזים רבים ככל האפשר. לשטוף את החרוזים ביסודיות עם מים כיתה תרבית התא עד pH הוא נייטרלי decant המים בכל פעם. השתמש ברצועת בדיקת ה- pH על השפכים כדי לאשר pH נייטרלי, ולאחר מכן לשטוף את החרוזים ביסודיות עם 100%אתנול, פעמיים עד שלוש פעמים.פירוק האתנול בכל פעם. מייבשים את החרוזים ומפזרים אותם ליצירת שכבה דקה בתוך מיכל סטרילי. ואז להשאיר את המיכל פתוח בתוך ארון בטיחות ביולוגית לייבש את החרוזים באוויר לילה.הקש בעדינות או לנער את המיכל ולבדוק כי החרוזים יש מרקם חולי ללא גושים או מתקלף כדי להבטיח כי החרוזים יבשים לחלוטין. מוסיפים את החרוזים למנגנון ומכסים את כל הפתיחה של תא ההחזקה של החרוזים באמצעות רשת פוליפרופילן או חומר שווה ערך עם 105 פתחי מיקרומטר כדי לאפשר לחרוזים לעבור. מהדקים את הרשת בין הקצוות הזכריים והנקביים של תא הדמיה לשימוש חוזר במתכת, ואז אוטמים אותה בחוזקה עם סרט השעווה וה- UV מחטאים את המנגנון במשך 15 דקות.כעת ניתן להשתמש במנגנון מטעין החרוזים לביצוע מאות בוצעו התקפות טעינה. יש לאחסן את המנגנון במיכל יבש המיובש בג'ל סיליקה או מדיום ייבוש אחר ולאטום אותו. אם החרוזים הופכים למזבלה יבשה לחלוטין ומעקרים את מטעין החרוזים ומחליפים אותו בחרדים טריים, כפי שהוכח קודם לכן.מוציאים את המדיום מהתאים ושואפים בעדינות את כל המדיום מסביב לשולי התא. לאחר מכן הטה את התא בזווית של כ-45 מעלות והסר את טיפת המדיה הנותרת במיקרו-באר המרכזית. Pipette פתרון טעינת חרוזים בעדינות על מיקרו זכוכית נוכח היטב במרכז התא.השתמש במנגנון טעינת החרוזים כדי לפזר בעדינות מונו-שכבתית של חרוזי זכוכית על גבי התאים. ודא כי החרוזים לכסות את התאים לחלוטין. צובטים את התא בשתי אצבעות, מרימים אותו סביב שני סנטימטרים ומפילים אותו בחוזקה באמצעות כוח שווה בערך כדי להפיל את המנה מגובה זה בעדינות להוסיף את המדיום בחזרה לתא על ידי צנרת לאט על צד הפלסטיק של התא.לשאוף כל חרוזים צפים מבלי להפריע לתאים, הליך טעינת חרוזים כולו צריך להתבצע במהירות יחסית. אז התאים לא להתייבש כאשר הם ללא בינוני. ואז לדגור על התאים 4.5 עד שעתיים באינקובטור.לפני ההדמיה לשטוף את התאים שלוש פעמים עם המדיום כדי להסיר חרוזים ורכיבי טעינה עודפים בתמיסת הטעינה. צלם את התאים באופן מיידי או בעת הצורך על ידי הניסוי באמצעות הוראות בכתב היד של הטקסט. תאים שהיו עמוסים בחרדים בהצלחה, כמעט תמיד היו Cy3-Pa57 ו- A488-H3K11ac שכותרתם החלבונים יחד.מיקרוגרם אחד של DNA פלסמיד ו- GFP קידוד ו -0.5 מיקרוגרם של חלבון שכותרתו Cy3 הוכנס גם לתאים באמצעות טעינת חרוזים לידי ביטוי ודמיינו. 40% מהתאים היו חרוזים עמוסים בחלבון נהדר ו -21% מהתאים העמוסים חרוזים מבטאים את הליבה טעונה Plasmid. התאים העמוסים חרוזים הביעו רמות שונות של plasmid.התוצאה של בדיקת יחס פישר הראתה שלמרות שלחלבונים 1 ו-2 היו התפלגות עוצמה דומה, לכל חלבון הייתה התפלגות קטנה משמעותית מהפלסטיד. רמות החלבונים העמוסים בחרוזים כללו שונות מועטה בין תאים, ורמות שני חלבונים טעונים בו זמנית היו מתואמות מאוד זו עם זו. טעינת חרוזים נכונה כמעט ולא השפיעה באופן ניכר על מספר תאי U2OS האנושיים או על המורפולוגיה שלהם כאשר הם התמונה ישירות לפני, מיד לאחר מכן ו -24 שעות לאחר טעינת חרוזים.טעינת חרוזים גרועה עם חרוזים מוגזמים וכוח הקשה גרמה לאובדן תאים, מורפולוגיה לקויה של תאים ואשכולות של חרוזים שנותרו על הכיסוי. למרות שהתאים נחשבים לנזק מכני במהלך תאי טעינת חרוזים גדלו והתרבו בתא הטעון כראוי חרוזים. כמו כן נצפתה כי תאים חרוזיים טעונים, עוברים חלוקת תאים.RPE1 וקווי תא HeLa היו חרוזים טעון עם fab כדי להדגים את הרבגוניות של טכניקת טעינת החרוזים. תאי U2OS היו גם חרוזים עמוסים Cy5-RNA 9-mer, ו Cy3-DNA 28-mer יחד. בעת ניסיון פרוטוקול זה להבטיח להוסיף רק monolayer של חרוזים לתאים מאז חרוזים רבים מדי לגרום לתאים להתנתק.אז לאחר פוסט התאוששות קצר של 30 דקות כדי חרוז טעינת תאים מוכנים הדמיה באופן מיידי או שעות עד ימים מאוחר יותר, אם ההליך דורש צעדים נוספים כגון כתמים, זה יכול להיעשות גם לאחר תקופת ההתאוששות.

bead-loading-proteins-and-nucleic-acids-into-adherent-human-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה הוא פשוט assay הידבקות חיידקים המורכב לספור את המספרים של המושבה חיידקי הקמת יחידות כי הם דבקו על תאים בתרבית. Assay היא חזקה, עצמאית של adhesin למד, וכן וריאציות רבות משמשים ברוב המעבדות עובדים על הפתוגנזה חיידקי.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

בסרטון זה אנו מתארים את ההליך להחדרת חומצות גרעין לתאי יונקים דבקים באמצעות העמסת חרוזים.

טעינת חרוזים להחדרת חומצות גרעין לתאים מתורבתים דבקים: טכניקה לטעינת פלסמידים מקודדי חלבון פלואורסצנטי לתאי יונקים דבקים

בסרטון זה אנו מתארים שיטה לחקר הדינמיקה של אברוני הלימפוציטים מסוג B בעקבות הפעלתם עם מיקרו-כדוריות מצופות אנטיגן.

דינמיקה של אברונים בלימפוציטים מסוג B לאחר הפעלה עם חרוזים מצופים אנטיגן

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה לאפיון תכונות ההדבקה הפנימיות של מולקולות הידבקות תאים משוערות.  האקטודומיין המופרש המתויג באפיטופ של מולקולת הידבקות תאים נלכד ממדיום התרבות על חרוזים קטנים ואחידים מתפקדים.  לאחר מכן ניתן להשתמש בחרוזים אלה באופן מיידי במבחני צבירת חרוזים פשוטים.

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

התקשרות חיידקית לתאי מארח היא שלב מפתח במהלך קולוניזציה וזיהום של המארח. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של הידבקויות רקומביננטיות מצומדות פולימר כחומרים ביומימטיים המאפשרים ניתוח של תרומתם של הידבקויות בודדות לתהליכים אלה, ללא תלות בגורמים חיידקיים אחרים.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

הדמיה של קרום פלזמה מבודדים הן, אמצעי האחסון תאיים שמסביב, המיקרוסקופ המשוכלל כי היתר ברזולוציה גבוהה ומהירה יוצגו. השילוב של ספינינג דיסק וסיכום השתקפות פנימית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בהגדרת אחד מאפשר ניסויים הדמיה חיה במחירים רכישה גבוהה עד 3.5 לשנייה בכל אוסף תמונות.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

כאן אנו מציגים את הפרוטוקול לשחזור צעדים של תאים סינתטיים המציגים אנטיגן באמצעות Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים ואת השימוש בהם כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T מופעלים.

הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T

למד את שיטת טעינת החרוזים להכנסת חלבונים, DNA ו-RNA לתאי יונקים חסידים. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה בזמן אמת ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה עם שימור תאיות וצמיחה תקינה.

חרוזים טעינת חלבונים וחומצות גרעין לתוך תאים אנושיים חסידים

גלה סרטונים נוספים