חרוזים טעינת חלבונים וחומצות גרעין לתוך תאים אנושיים חסידים

טעינת חרוזים היא ניסיון זול לטעינת קרום, חלקיקים אטומים לתאים חסידיים חיים. פרוטוקול זה הוכיח שימושי מאוד עבור טעינת בדיקות עבור תא יחיד או מולקולה אחת או ניסויים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. העמסת חרוזים מאפשרת לחוקרים לטעון במהירות כל מיני מולקולות, כולל חלבונים, DNA, RNA, חלקיקים סינתטיים, או שילוב של אלה בו זמנית לתאים בודדים.

בעת ביצוע הראשון של טעינת חרוזים, חשוב לבדוק את כוח ההקשה. קווי תאים מגיבים באופן שונה לטעינת חרוזים. וכך ניתן לשנות את מספר הברזים ואת עוצמתם לטעינת תאים אופטימלית תוך מזעור אפונה של התאים.

כדי להדגים את ההליך מתיו סקסטון ואני יצטרפו לעמיתינו, ד"ר אמנדה קוק וגבריאל גלינדו. התחל על ידי מדידת כחמישה מיליליטר של חרוזי זכוכית בצינור חרוטי 50 מיליליטר. מוסיפים 25 מיליליטר של שני נתרן הידרוקסידי טוחן לצינור ומערבבים בעדינות במשך שעתיים באמצעות שייקר או רוטור.

ספין במורד הצינור של חרוזים לזמן קצר בצנטריפוגה אם החרוזים נמצאים בהשעיה, ואז decant נתרן הידרוקסיד תוך שמירה על חרוזים רבים ככל האפשר. לשטוף את החרוזים ביסודיות עם מים כיתה תרבית התא עד pH הוא נייטרלי decant המים בכל פעם. השתמש ברצועת בדיקת ה- pH על השפכים כדי לאשר pH נייטרלי, ולאחר מכן לשטוף את החרוזים ביסודיות עם 100%אתנול, פעמיים עד שלוש פעמים.

פירוק האתנול בכל פעם. מייבשים את החרוזים ומפזרים אותם ליצירת שכבה דקה בתוך מיכל סטרילי. ואז להשאיר את המיכל פתוח בתוך ארון בטיחות ביולוגית לייבש את החרוזים באוויר לילה.

הקש בעדינות או לנער את המיכל ולבדוק כי החרוזים יש מרקם חולי ללא גושים או מתקלף כדי להבטיח כי החרוזים יבשים לחלוטין. מוסיפים את החרוזים למנגנון ומכסים את כל הפתיחה של תא ההחזקה של החרוזים באמצעות רשת פוליפרופילן או חומר שווה ערך עם 105 פתחי מיקרומטר כדי לאפשר לחרוזים לעבור. מהדקים את הרשת בין הקצוות הזכריים והנקביים של תא הדמיה לשימוש חוזר במתכת, ואז אוטמים אותה בחוזקה עם סרט השעווה וה- UV מחטאים את המנגנון במשך 15 דקות.

כעת ניתן להשתמש במנגנון מטעין החרוזים לביצוע מאות בוצעו התקפות טעינה. יש לאחסן את המנגנון במיכל יבש המיובש בג'ל סיליקה או מדיום ייבוש אחר ולאטום אותו. אם החרוזים הופכים למזבלה יבשה לחלוטין ומעקרים את מטעין החרוזים ומחליפים אותו בחרדים טריים, כפי שהוכח קודם לכן.

מוציאים את המדיום מהתאים ושואפים בעדינות את כל המדיום מסביב לשולי התא. לאחר מכן הטה את התא בזווית של כ-45 מעלות והסר את טיפת המדיה הנותרת במיקרו-באר המרכזית. Pipette פתרון טעינת חרוזים בעדינות על מיקרו זכוכית נוכח היטב במרכז התא.

השתמש במנגנון טעינת החרוזים כדי לפזר בעדינות מונו-שכבתית של חרוזי זכוכית על גבי התאים. ודא כי החרוזים לכסות את התאים לחלוטין. צובטים את התא בשתי אצבעות, מרימים אותו סביב שני סנטימטרים ומפילים אותו בחוזקה באמצעות כוח שווה בערך כדי להפיל את המנה מגובה זה בעדינות להוסיף את המדיום בחזרה לתא על ידי צנרת לאט על צד הפלסטיק של התא.

לשאוף כל חרוזים צפים מבלי להפריע לתאים, הליך טעינת חרוזים כולו צריך להתבצע במהירות יחסית. אז התאים לא להתייבש כאשר הם ללא בינוני. ואז לדגור על התאים 4.5 עד שעתיים באינקובטור.

לפני ההדמיה לשטוף את התאים שלוש פעמים עם המדיום כדי להסיר חרוזים ורכיבי טעינה עודפים בתמיסת הטעינה. צלם את התאים באופן מיידי או בעת הצורך על ידי הניסוי באמצעות הוראות בכתב היד של הטקסט. תאים שהיו עמוסים בחרדים בהצלחה, כמעט תמיד היו Cy3-Pa57 ו- A488-H3K11ac שכותרתם החלבונים יחד.

מיקרוגרם אחד של DNA פלסמיד ו- GFP קידוד ו -0.5 מיקרוגרם של חלבון שכותרתו Cy3 הוכנס גם לתאים באמצעות טעינת חרוזים לידי ביטוי ודמיינו. 40% מהתאים היו חרוזים עמוסים בחלבון נהדר ו -21% מהתאים העמוסים חרוזים מבטאים את הליבה טעונה Plasmid. התאים העמוסים חרוזים הביעו רמות שונות של plasmid.

התוצאה של בדיקת יחס פישר הראתה שלמרות שלחלבונים 1 ו-2 היו התפלגות עוצמה דומה, לכל חלבון הייתה התפלגות קטנה משמעותית מהפלסטיד. רמות החלבונים העמוסים בחרוזים כללו שונות מועטה בין תאים, ורמות שני חלבונים טעונים בו זמנית היו מתואמות מאוד זו עם זו. טעינת חרוזים נכונה כמעט ולא השפיעה באופן ניכר על מספר תאי U2OS האנושיים או על המורפולוגיה שלהם כאשר הם התמונה ישירות לפני, מיד לאחר מכן ו -24 שעות לאחר טעינת חרוזים.

טעינת חרוזים גרועה עם חרוזים מוגזמים וכוח הקשה גרמה לאובדן תאים, מורפולוגיה לקויה של תאים ואשכולות של חרוזים שנותרו על הכיסוי. למרות שהתאים נחשבים לנזק מכני במהלך תאי טעינת חרוזים גדלו והתרבו בתא הטעון כראוי חרוזים. כמו כן נצפתה כי תאים חרוזיים טעונים, עוברים חלוקת תאים.

RPE1 וקווי תא HeLa היו חרוזים טעון עם fab כדי להדגים את הרבגוניות של טכניקת טעינת החרוזים. תאי U2OS היו גם חרוזים עמוסים Cy5-RNA 9-mer, ו Cy3-DNA 28-mer יחד. בעת ניסיון פרוטוקול זה להבטיח להוסיף רק monolayer של חרוזים לתאים מאז חרוזים רבים מדי לגרום לתאים להתנתק.

אז לאחר פוסט התאוששות קצר של 30 דקות כדי חרוז טעינת תאים מוכנים הדמיה באופן מיידי או שעות עד ימים מאוחר יותר, אם ההליך דורש צעדים נוספים כגון כתמים, זה יכול להיעשות גם לאחר תקופת ההתאוששות.