Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe u immunohistochemie uit te voeren op ontleed Drosophila larve.
Abstract
De
Protocol
Voordat u begint
- Bereid de volgende oplossingen: PBT (0,1% Triton X100 in 1X PBS), PBTB (0,2% BSA in PBT), en PBTN (2% NGS in PBTB).
- Ontleden Drosophila larven. Zie Drosophila larven NMJ Dissection.
Immunohistochemie
- Verplaats de larven naar een 1,5 ml buisje met PBT. Twee keer was de larven gedurende 15 minuten in de PBT. Opmerking: om te wassen, de 1.5 ml buis op een nutator mixer. Verwijder de vloeistof met een pippetor en vervangen door verse vloeistof.
- Verwijder de PBT. Twee keer wassen in PBTB gedurende 30 minuten.
- Verwijder de PBTB. Twee keer wassen in PBTN gedurende 15 minuten.
- Incubeer in primair antilichaam verdund in PBTN bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 º C gedurende de nacht.
- Spoel tweemaal met PBTB. Opmerking: om toe te voegen oplossing spoelen en te verwijderen snel.
- Was twee keer 15 minuten in PBTB.
- Was in PBTN gedurende 30 minuten.
- Incubeer in secundair antilichaam (en geconjugeerde primaire antilichaam als je een gebruikt) verdund in PBTN.
- Dekking in aluminiumfolie en incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur.
- Spoel tweemaal met PBTB.
- Was twee keer 15 minuten met PBTB.
- Ga verder naar de montage.
Montage
Let op: Mount in glycerol indien uit de monsters zal onmiddellijk worden afgebeeld. Mount in Verleng Gold indien uit de monsters zullen worden opgeslagen voordat beeldvorming (voor meer dan een week) of als monsters moeten worden afgebeeld meerdere keren. Om gebruik te maken, plaats een fles te verlengen in 65 º C waterbad gedurende 2-3 minuten. Neem een hoeveelheid van Verleng Gold en te houden op een warmte-blok bij 45-50 º C.
- Giet gebeitst PREPS in PBT in om een horlogeglas.
- Doe wat glycerol op een schoon glasplaatje voor verwerking.
- Verplaats de dieren de verwerking schuiven door het plukken van hen uit het horlogeglas met een hoek met pincet. Zorg ervoor dat ze naar beneden cuticula kant.
- Verwijder de kop en staart met een frisse scheermes over de verwerking glaasje. Een Exacto-mes met lemmet # 16 werkt goed voor.
- Op een andere dia (montage dia), zet een kleine daling van het glycerol / verlengen en te verspreiden met schone tang.
- Verplaats de ontleedde dieren naar de montage schuiven door hun rand, zorg dat u ze niet omkeren. Probeer ze te monteren in rijen in dezelfde richting. Mount 6-8 dieren per slide.
- Drop een dekglas op door het plaatsen van een rand in het glycerol / verlengen en langzaam los te laten.
- Seal de dia met nagellak. Opmerking [Niet image totdat de lak droog is. Dit duurt meestal tien minuten. Voor monsters gemonteerd in verlengen goud, de dia's laten drogen gedurende ten minste drie uur voor sluiting of beeldvorming.]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunohistochemie (IHC) is van vitaal belang voor de studie van de NMJ biologie, omdat het in staat stelt visualisatie van de NMJ. Dit wordt bereikt door met behulp van antilichamen die de neuronale membraan (bijv. HRP), de presynapse (bijv., CSP, SYT), en / of de postsynapse (bijvoorbeeld DLG) te erkennen. Signaalmoleculen, structurele eiwitten, of nieuwe eiwitten van belang kunnen ook worden gekleurd. Dan kunnen genen worden gemuteerd of missexpressed, en IHC kan verstoring van synaptische structuur en / of neuronale signalering op te sporen.
Het NMJ van Drosophila heeft grote populariteit opgedaan sinds het begin van de studies die zijn fundamentele structuur en functie verlicht. 1-4 Veel van de moleculen die zijn geïdentificeerd in studies van de Drosophila NMJ worden bewaard in gewervelde dieren. Daarom 4, de inzichten geleerd door studies van de Drosophila NMJ van toepassing kunnen zijn op synaptische biologie in veel systemen. Enkele mogelijke toepassingen zijn de studie van de moleculen die betrokken zijn bij synaptische ontwikkeling, plasticiteit, en neurologische ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
