C. elegans Ensayo de chemotaxis: un método para probar la quemosensación en gusanos

Overview

Este video introduce chemotaxis en el nematodo C. elegans y muestra un protocolo de muestra que prueba la aversión química al sulfato de cobre.

Protocol

El siguiente protocolo es un extracto de Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparación de organismos experimentales
   1. Elija 10 nematodos escenificados L4 por cepa 24 h antes de comenzar el ensayo para asegurarse de que los organismos son adultos jóvenes cuando se prueban. Para cada nematodo mutante o de control probado, elija 10 L4s (10 para el control y 10 para el ensayo).
      1. Mantener organismos L4 utilizando métodos estándar para 24 h en placas de agar estándar sembradas con OP50 Escherichia coli. Si los organismos se pierden durante los pasos de lavado posteriores, compense aumentando el tamaño inicial de la muestra(es decir, recoger 20 gusanos en lugar de 10).
         NOTA: El comportamiento es un fenotipo innatamente variable. Realice el método en triplicado para cada cepa en tres días separados. Incluya cepas de control adicionales y condiciones para cepas novedosas, como se destaca en la sección de discusión.
   2. Inmediatamente antes del ensayo, transfiera organismos experimentales a una placa de agar sin bacterias y permita que los nematodos se muevan libremente durante 1 minuto para eliminar el exceso de bacterias.
      1. Si los organismos experimentales experimentaron condiciones de contaminación durante las 24 h antes del ensayo, deséchelos.
   3. Pipeta 1 ml de M9 en la placa libre de bacterias para lavar gusanos en un tubo de microcentrífuga.
   4. Centrífuga a 3.000 x g durante 1 min. Los gusanos deben formar un pellet en la parte inferior del tubo. Aspirar solución M9 sin interrumpir el pellet de gusano. Añadir 1 mL de M9 al pellet de gusano, invertir tubo para mezclar gusanos con la solución.
   5. Repita los pasos 1.4 tres veces más.
      1. Si el exceso de bacterias se transfirió inicialmente con los gusanos, repita durante un total de 5 veces. No se debe transferir ninguna bacteria a las placas de carreras de alimentos de cobre. Si los alimentos se transfieren a la placa de ensayo, interferirá con la recopilación de datos precisa.
   6. Después del lavado final, aspirar sobrenadante hasta 100 μL de M9 y el pellet de gusano permanece.
      Precaución: Los comportamientos relacionados con la inanición se hacen evidentes después de 30 minutos. En consecuencia, los gusanos deben transferirse inmediatamente de la solución una vez completados los pasos de lavado.
2. Preparación de placas de ensayo
   1. Prepare las placas de agar NGM estándar dos días antes del ensayo.
      1. Si las placas se mantienen en un ambiente húmedo, haga placas de agar 3 días antes del ensayo. Alternativamente, retire la tapa de la placa durante 3 - 6 h para asegurar la sequedad adecuada (si está en un ambiente estéril).
   2. Con un marcador permanente grueso, haga una línea en la parte inferior de la placa a lo largo del borde exterior y otra para formar una barrera de línea media (Figura 1). La barrera de línea media debe ser equidistante de cada borde de la placa. Utilice una regla para garantizar mediciones precisas. Estas líneas servirán de guía a la hora de transferir bacterias y la solución de cobre. Siempre que E. coli se transfiera antes de la solución de cobre, estas líneas servirán como indicadores.
   3. Placa de semillas con 50 μL de OP50 E. coli en un solo lado de la barrera del cobre para crear un césped uniforme (Figura 2). La concentración bacteriana debe mantenerse constante en todos los ensayos; sin embargo, se ha observado poca variabilidad en respuesta a diferencias leves en la concentración.
      1. Utilice las líneas marcadas en la parte inferior de la placa para asegurarse de que las bacterias no entren en contacto con la solución de cobre. Siempre que la solución de cobre forre el borde de la placa y forme una barrera de línea media, transfiera las bacterias para que la solución de cobre no entre en contacto con la fuente de alimento.
   4. Marque un segundo conjunto de placas y transfiera ninguna OP50 E. coli a ellas (Figura 2). Estas placas servirán para evaluar el control negativo. Estas placas también deben tener una marca en la mitad de la placa para denotar el origen de transferencia inicial.
   5. Deje que las bacterias se sequen y luego incubar placas a 37 °C durante la noche. Asegúrese de que los parches bacterianos no se molesten al transferirlos a una incubadora o habitación de 37 °C. La perturbación excesiva podría alterar la ubicación o la forma del parche alimentario.
3. Ensayo de Chemotaxis
   1. Prepare recién una solución de sulfato de cobre (II) de 0,5 M antes de la hora de inicio del ensayo. Siempre que se utilicen 125 μL de la solución por placa, escale este volumen dependiendo del número de placas de ensayo utilizadas(por ejemplo, 5 placas de ensayo, 625 μL).
   2. Pipeta 100 μL de la solución de sulfato de cobre (II) en el borde del agar para crear una barrera exterior de cobre. La parte inferior marcada de la placa debe servir como guía.
   3. Pipeta 25 μL de la solución de sulfato de cobre (II) para crear una barrera de línea media.
      1. Asegúrese de que la solución de sulfato de cobre (II) no entre en contacto con el parche bacteriano. Utilice una técnica detectada, ya que el rayado puede afectar a la locomoción debido a las hendiduras/arañazos en el agar.
   4. Deje que la solución de cobre se seque sobre la placa. El período de tiempo puede variar dependiendo de las condiciones de la placa y del laboratorio. Compruebe visualmente la sequedad cada 5 minutos después de la transferencia.
      NOTA: La solución de cobre muestra un tinte azulado y es fácilmente identificable. Utilice un tejido de laboratorio para reducir ligeramente la solución cerca del borde de la placa para discernir la sequedad.
   5. Pipeta 20 μL del pellet de gusano desde la parte inferior del tubo hasta la mitad libre de bacterias de la placa de ensayo.
      1. Asegúrese de que 10 gusanos se transfieren a la placa de ensayo. Si se incluyeron gusanos adicionales accidentalmente, retírelos recogiendo aceite de halocarbono para asegurarse de que no se agregue ninguna bacteria a la placa. Cada ensayo debe tener un número constante de nematodos durante el ensayo.
         NOTA: Si se transfieren muy pocos gusanos durante los ensayos, aumentar el tamaño inicial de la muestra mitigará las pérdidas potenciales durante los lavados y transferencias.
   6. Retire el exceso de M9 de la placa con un tejido de laboratorio. M9 no debe entrar en contacto con la solución de sulfato de cobre (II).
      Precaución: Asegúrese de que los gusanos y la superficie del agar no se vean afectados mientras realizan este paso. Si se utiliza con demasiada dureza, el tejido de laboratorio puede crear sangrías en la superficie del agar de la placa y puede eliminar gusanos. Los gusanos retirados accidentalmente a través de KimWipe deben ser descartados.
   7. Una vez que se haya eliminado la solución M9 y todos los gusanos hayan comenzado los patrones de locomotoría no líquidos, inicie el cronómetro del ensayo.
      1. De forma óptima, retire la solución M9 en un minuto. El parámetro esencial es la identificación de la locomoción sinusoidal. Los gusanos locomotoran de manera diferente, por ejemplo, golpeando en lugar de sinusoidal, cuando están en líquido. Inicie el reloj de parada de ensayo una vez que cada uno de los organismos experimentales deje de golpear.
   8. Compruebe las placas de ensayo cada 30 minutos.
      1. Para las placas de ensayo con parches bacterianos, puntúe positivamente los organismos si alcanzan el parche alimentario durante un período de 4 h. Para las placas de control negativas, puntúe positivamente los organismos si han cruzado la barrera.

Representative Results

Figura 1: Una representación visual de las marcas para indicar la colocación de la solución de cobre en la parte inferior de una placa de Petri de 5 cm. Estas indicaciones se utilizan para asegurar que las secciones de la placa se han medido adecuadamente y sirven como una guía al transferir el parche bacteriano y luego la solución de cobre a la superficie del agar.

Figura 2: La placa de Petri de 5 cm se divide en dos secciones para platos de ensayo de alimentos encendidos y apagados y se forma un césped bacteriano en el centro de una de estas secciones para el plato de comida. El parche de alimentos no debe entrar en contacto con el compuesto de prueba que recubre los bordes del plato y forma una barrera de línea media.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M