C. elegans Chemotaxis Assay: En metode for å teste chemosensation i ormer

Overview

Denne videoen introduserer chemotaxis i nematoden C. elegans og viser en prøveprotokoll som tester kjemosaktisk aversjon mot kobbersulfat.

Protocol

Følgende protokoll er et utdrag fra Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Fremstilling av eksperimentelle organismer
   1. Velg 10 L4 iscenesatte nematoder per stamme 24 timer før du starter analysen for å sikre at organismer er unge voksne når de testes. For hver mutant eller kontroll nematode testet, velg 10 L4s (10 for kontrollen og 10 for analysen).
      1. Vedlikehold L4-organismer ved hjelp av standardmetoder i 24 timer på standard agarplater frøet med OP50 Escherichia coli. Hvis organismer går tapt under de påfølgende vasketrinnene, kompenserer du ved å øke startprøvestørrelsen (dvs. plukke 20 ormer i stedet for 10).
         MERK: Atferd er en medfødt variabel fenotype. Utfør metoden i triplikat for hver belastning på tre separate dager. Inkluder ytterligere kontrollstammer og betingelser for nye stammer, som fremhevet i diskusjonsdelen.
   2. Umiddelbart før analysen overfører du eksperimentelle organismer til en agarplate uten bakterier og lar nematoder bevege seg fritt i 1 min for å fjerne overflødige bakterier.
      1. Hvis eksperimentelle organismer opplevde forurensningsforhold i løpet av 24 timer før analysen, kast dem.
   3. Pipette 1 ml M9 på den bakteriefrie platen for å vaske ormer i et mikrosenterrør.
   4. Sentrifuge ved 3000 x g i 1 min. Ormer skal danne en pellets på bunnen av røret. Aspirat M9-løsning uten å forstyrre ormepellet. Tilsett 1 ml M9 til ormepellet, inverter røret for å blande ormer med løsningen.
   5. Gjenta trinn 1,4 tre ganger til.
      1. Hvis overflødige bakterier først ble overført med ormene, gjenta i totalt 5 ganger. Ingen bakterier skal overføres til kobbermatløpsplatene. Hvis mat overføres til analyseplaten, vil det forstyrre nøyaktig datainnsamling.
   6. Etter den endelige vasken, aspirerer supernatant til 100 μL M9 og ormepellet forblir.
      Advarsel: Sultrelatert atferd blir tydelig etter 30 min. Følgelig bør ormer umiddelbart overføres fra løsningen når vasketrinnene er fullført.
2. Utarbeidelse av analyseplater
   1. Klargjør standard NGM-agarplater to dager før analysen.
      1. Hvis platene holdes i fuktige omgivelser, lag agarplater 3 dager før analysen. Alternativt kan du fjerne lokket på platen i 3 - 6 timer for å sikre riktig tørrhet (hvis det er i et sterilt miljø).
   2. Med en tykk permanent markør lager du en linje på undersiden av platen langs ytterkanten og en annen for å danne en midtlinjebarriere (figur 1). Midtlinjebarrieren skal være likestilt fra hver kant av platen. Bruk en linjal for å sikre nøyaktige målinger. Disse linjene vil fungere som en veiledning når du overfører bakterier og kobberoppløsningen. Forutsatt at E. coli overføres før kobberløsningen, vil disse linjene tjene som indikatorer.
   3. Frøplate med 50 μL OP50 E. coli på bare den ene siden av kobberbarrieren for å lage en jevn plen (figur 2). Bakteriell konsentrasjon bør forbli konsistent på tvers av analyser; Det er imidlertid observert lite variasjon som følge av milde konsentrasjonsforskjeller.
      1. Bruk de merkede linjene på undersiden av platen for å sikre at bakteriene ikke kommer i kontakt med kobberoppløsningen. Forutsatt at kobberløsningen linjer kanten av platen og danner en midtlinjebarriere, overfør bakteriene slik at kobberløsningen ikke kommer i kontakt med matkilden.
   4. Merk et nytt sett med plater, og overfør ingen OP50 E. coli til dem (figur 2). Disse platene vil tjene til å evaluere den negative kontrollen. Disse platene bør også ha en markering på den ene halvdelen av platen for å betegne den første overføringsopprinnelsen.
   5. La bakterier tørke og inkubere plater ved 37 °C over natten. Påse at bakterieplaster ikke forstyrres ved overføring til en inkubator eller et rom på 37 °C. Overdreven forstyrrelse kan endre plasseringen eller formen på matplasteret.
3. Chemotaxis Analyse
   1. Lag en 0,5 M kobber (II) sulfatløsning på nytt før analysens starttid. Forutsatt at 125 μL av oppløsningen brukes per plate, skalerer du opp dette volumet avhengig av antall analyseplater som brukes (f.eks. 5 analyseplater, 625 μL).
   2. Pipette 100 μL av kobber (II) sulfatoppløsningen på kanten av agaren for å skape en ytre kobberbarriere. Den markerte undersiden av platen skal fungere som en guide.
   3. Pipette 25 μL av kobber (II) sulfatoppløsningen for å skape en midtlinjebarriere.
      1. Påse at kobber (II) sulfatoppløsningen ikke kommer i kontakt med bakterieplasteret. Bruk en flekkete teknikk da striper kan påvirke bevegelse på grunn av innrykk / riper på agaren.
   4. La kobberoppløsningen tørke på tallerkenen. Tidsperioden kan variere avhengig av plate- og laboratorieforhold. Kontroller visuelt tørrhet hvert 5.
      MERK: Kobberløsningen viser en blåaktig fargetone og er lett identifiserbar. Bruk et laboratorievev for å lett dab løsningen nær kanten av platen for å skjelne tørrhet.
   5. Pipette 20 μL av ormepellets fra bunnen av røret til den bakteriefrie halvdelen av analyseplaten.
      1. Påse at 10 ormer overføres til analyseplaten. Hvis ekstra ormer ble inkludert ved et uhell, fjern dem ved å plukke med halokarbonolje for å sikre at ingen bakterier legges til platen. Hver analyse bør ha et konsekvent antall nematoder under analysen.
         MERK: Hvis for få ormer overføres under analyser, vil økning av den opprinnelige prøvestørrelsen redusere potensielle tap under vask og overføringer.
   6. Fjern overflødig M9 fra platen med et laboratorievev. M9 skal ikke komme i kontakt med kobber (II) sulfatoppløsningen.
      Forsiktig: Forsikre deg om at ormer og agaroverflaten forblir upåvirket mens du utfører dette trinnet. Hvis det brukes for hardt, kan laboratorievevet skape innrykk til agaroverflaten på platen og kan fjerne ormer. Ormer som ved et uhell fjernes via KimWipe, bør kastes.
   7. Når M9-løsningen er fjernet og alle ormer har påbegynt ikke-flytende lokomotoriske mønstre, start analysestoppklokken.
      1. Optimalt, fjern M9-løsningen i løpet av et minutt. Den essensielle parameteren er identifisering av sinusformet bevegelse. Ormer locomote annerledes, for eksempel thrashing i stedet for sinusformet, når i væske. Start analysen stopp watch når hver av de eksperimentelle organismer slutter å banke.
   8. Kontroller analyseplatene hvert 30.
      1. For analyseplatene med bakterielle flekker, score organismer positivt hvis de når matplasteret over en 4 h periode. For de negative kontrollplatene scorer positivt organismer hvis de har krysset barrieren.

Representative Results

Figur 1: En visuell representasjon av markeringer for å indikere plassering av kobberløsninger på undersiden av en 5 cm Petri-tallerken. Disse indikasjonene brukes for å sikre at delene av platen er riktig målt og fungerer som en retningslinje ved overføring av bakterieplasteret og deretter kobberoppløsningen på agaroverflaten.

Figur 2: 5 cm Petri Dish er delt inn i to seksjoner for på og utenfor Food Assay Plates og en bakteriell plen dannes i midten av en av disse seksjonene for on-food plate. Matplasteret bør ikke komme i kontakt med testforbindelsen som linjer kantene på platen og danner en midtlinjebarriere.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M