Summary
Een protocol voor de canulatie van de muis submandibulaire speekselklier via kanaal van de Wharton is beschreven. Voor dit experiment wordt het trypaan blauw-oplossing gebruikt als een verver om aan te tonen hoe deze techniek effectief infusies levert in de gerichte klier, en om de betrouwbaarheid van deze nieuwe aanpak voorstellen als een potentieel klinisch drug / celtherapie voor het herstel van de speekselklieren.
Abstract
Ernstige speekselklier hypofunction wordt vaak gevonden bij patiënten met het syndroom van Sjögren en degenen die die therapeutische bestraling in hun hoofd en nek regio's voor de behandeling van kanker. Beide groepen patiënten ervaren symptomen, zoals xerostomie (droge mond), dysfagie (verminderde kauwen en slikken), ernstige cariës, veranderde smaak, oro-faryngeale infecties (candidiasis), mucositis, pijn en ongemak.
Een innovatieve benadering van de regeneratieve geneeskunde voor de behandeling van de speekselklieren hypo-functie wordt gespeculeerd in de RS Redman, E Mezey et al. 2009:. Stamcellen kunnen direct worden afgezet door cannulatie in de klier als een krachtige methode in de heropleving van de functies van de verminderde orgel. Vermoedelijk zal de gemigreerde vreemde stamcellen differentiëren in kliercellen om te functioneren als onderdeel van de gastheer speekselklier. Ook deze canulatie techniek is een hulpmiddel en effectieve levering methode voor klinische genoverdracht toepassing.
Hier hebben we illustreren de stappen die betrokken zijn bij het uitvoeren van de cannulatie procedure op de muis submandibulaire speekselklier via de Wharton's kanaal (afb. 1). C3H muizen (Charles River, Montreal, QC, Canada) worden gebruikt voor dit experiment, die zijn onder schone conventionele omstandigheden bewaard op de McGill University dier resource center. Alle experimenten zijn goedgekeurd door de Universiteit Animal Care Comite en waren in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad van Animal Care.
Voor dit experiment, is een trypan blauwe oplossing toegediend in de klier door de opening van het kanaal Wharton's met behulp van een insuline spuit met een 29-gauge naald verpakt in een polyethyleen buis. Vervolgens wordt de muis ontleed aan te tonen dat de infusies gemigreerd succesvol in de klier.
Protocol
1. Procedurele Beschrijving
- Subcutaan injecteren 1 pi / g lichaamsgewicht van 0,5 mg / ml atropinesulfaat monohydraat (Cat # 11330, Fluka, USA) in elke muis om de speekselvorming voorkomen dat het verstoren van de beweging van de infusies.
- Verdoven elke muis met een ul / g lichaamsgewicht van een 100 mg / ml ketamine en 20 mg / ml xylazine (Phoenix Scientific, AR, USA)-oplossing geïnjecteerd intraperitoneale (IP)
- Plaats de muis op een custom-made plastic platform in het ventrale positie: het bovenfront opgesloten op een metalen draad, en het onderfront zijn verslaafd aan een elastische koord om de mond open te houden.
- Gebruik een insulinespuit met een 29-gauge naald (Cat # 600145, Tyco Healthcare, MA, USA) geplaatst in een 0,58 mm diameter polyethyleen buis (Cat # 427410, Becton Dickinson, MD, USA; afb. 2). De polyethyleen buis is ingebracht 5mm over de top van een 29-gauge naald. De naald wordt gebruikt als een stijve gids voor de polyethyleen buis te verplaatsen naar kanaal van de Wharton's. De polyethyleen buis is ingebracht 3-5 mm in het kanaal. Merk op dat alleen de polyethyleen buis de speekselklier buis komt, terwijl de naald blijft buiten het kanaal. Injecteer 50ul van gefilterde 0,4% trypan blauwe vlek-oplossing (Cat # 15250, Gibco, USA) in de glandula submandibularis via kanaal van de Wharton, die is gelegen onder de tong. Het infuus is steeds geleverd met positieve druk op de spuit zuiger, de vinger blijft op de zuiger, zelfs na al van het infuus is afgeleverd bij de klier, om een terugstroming van de infusie te voorkomen dat intra-oraal. De trypan blauwe oplossing wordt gebruikt in de video als een kleurstof om de techniek te demonstreren.
- N a de injectie van de trypan blauwe oplossing werd de muis voor inslapen naar dissectie. De speekselklier is chirurgisch blootgesteld om te bepalen hoeveel van de infusies daadwerkelijk bleef in de klier.
2. Representatieve resultaten:
Na de infusies werden geïnjecteerd, was de muis ontleed om operatief bloot de post-gecanuleerde speekselklier. Zoals weergegeven op Image-2, de donkere kleur van de buis van de Wharton's levert bewijs dat de trypan blauwe oplossing met succes werd toegediend.
Figuur 1. Canulatie van de muis submandibulaire klier.
Figuur 2. Polyethyleen buis is omhuld rond het uiteinde van een 29-gauge naald. De naald wordt gebruikt als een stijve gids voor de polyethyleen buis te verplaatsen naar kanaal van de Wharton's. De polyethyleen buis is ingebracht (gecanuleerde) 3-5 mm in het kanaal. Merk op dat alleen de polyethyleen buis de speekselklier buis komt, terwijl de naald blijft buiten het kanaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een moeilijkheid het gebruik van deze canulatie methode is om te voorkomen dat het terugstromen van de geïnjecteerde oplossing. Zelfs als de trypan blauwe oplossing is tijdelijk gemigreerd naar de speekselklier met succes, kan het speeksel secretie interfereren met de infusen en de oorzaak terugstroming van de trypan blauwe oplossing uit de klier. Uit voorzorg, naast het gebruik van atropine tot afgifte van speeksel remmen, moet de polyethyleen canule blijft in het kanaal van de Wharton en de zuiger van de spuit aangehouden voor 60 seconden na de infusies zijn gedeponeerd. Dit zal het grootste deel van de toegediende oplossing te blijven binnen de klier.
Conventioneel, heeft de systemische toepassing, namelijk de intraveneuze injectie (IV) van drugs en / of cellen, gebruikt als een klinische benadering voor de speekselklier regeneratie. Intraveneus geïnjecteerd infusies reist door de gehele bloedsomloop, waardoor slechts enkele van de drugs / cellen migreren naar de beoogde klieren. Vergeleken met deze traditionele methode, kan de lokale toediening, dat is de injectie van drugs / cellen via de cannulatie procedure, worden gezien als een meer directe en effectieve manier in de heropleving van de functies van de parotide, submandibulaire, en sublinguale speekselklieren. Daarom kan deze canulatie techniek gebruikt worden als een betrouwbaar model voor de regeneratieve geneeskunde van de muis speekselklier, en als een toekomstperspectief, deze procedure kan een passender voor de klinische toepassing worden.
Het zou een groot genoegen om dit visueel-artikel om te worden gebruikt als een effectief instrument voor studenten en onderzoekers die geïnteresseerd zijn in verdere studies in de regeneratieve geneeskunde van de speekselklier te zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle experimenten zijn goedgekeurd door de Universiteit Animal Care Comite en waren in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad van Animal Care.
Acknowledgments
De auteurs zijn dank verschuldigd aan dr. Ana Cotrim voor technisch advies en aan Dr Monzur Murshed voor apparatuur. Dit werk werd deels gefinancierd door de Canadese Institutes for Health Research.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine | Drug | Fluka | 11330 | To inhibit saliva secretion |
| Ketamine | Drug | Phoenix Scientific | Sedation | |
| Xylazine | Drug | Phoenix Scientific | ||
| Polyethylene tubing (0.58 mm diameter) | Tube | Intramedic | 427410 | To insert over tip of needle to avoid tissue injury during insertion into Wharton’s duct. |
| Ultra Comfort Insulin syringe (with a 29G needle) | Syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 600145 | |
| 4% trypan blue | Stain | GIBCO, by Life Technologies | 15250 |
References
- Fox, P. C. Acquired salivary dysfunction. Drugs and radiation. Ann N Y Acad Sci. 842, 132-137 (1998).
- Bhide, S. A., Miah, A. B., Harrington, K. J., Newbold, K. L., Nutting, C. M. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, prevention and treatment. Clin Oncol (R Coll Radiol). 21, 737-744 (2009).
- Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotech Histochem. 84, 253-260 (2009).
