Summary
Un protocolo para la canalización de la glándula salival submaxilar del ratón a través de conductos de Wharton se describe. Para este experimento, la solución de azul tripán se usa como un tintorero para demostrar cómo esta técnica efectiva entrega infusiones en la glándula blanco, y sugerir la fiabilidad de este nuevo enfoque como un potencial clínico de drogas / terapia celular para la regeneración de las glándulas salivales.
Abstract
Hipofunción de las glándulas salivales grave se encuentra con frecuencia en pacientes con síndrome de Sjögren y los que reciben la irradiación terapéutica en la cabeza y región del cuello para el tratamiento del cáncer. Ambos grupos de pacientes experimentan síntomas tales como la xerostomía (boca seca), disfagia (deterioro de la masticación y deglución), caries dentales graves, alteración del gusto, orofaríngea infecciones (candidiasis), mucositis, dolor y malestar.
Un enfoque innovador de la medicina regenerativa para el tratamiento de la glándula salival hipofunción se especula en RS Redman, Mezey E et al 2009:. Células madre pueden ser depositados directamente por la canalización en la glándula como un método potente para la reactivación de las funciones de las personas con discapacidad órgano. Es de suponer que las células madre migran extranjeros se diferencian en células glandulares que funcionan como parte de la glándula salival de acogida. Además, esta técnica de la canalización es un método de entrega rápido y efectivo para la aplicación clínica de transferencia de genes.
Aquí se ilustran los pasos necesarios para realizar el procedimiento de canalización en el ratón de la glándula salival submaxilar a través del conducto de Wharton (Fig. 1). C3H ratones (Charles River, Montreal, Quebec, Canadá) se utilizan para este experimento, que se han mantenido bajo condiciones de limpieza convencionales en el centro de la Universidad McGill de recursos animales. Todos los experimentos han sido aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad y estaban en conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales.
Para este experimento, una solución de azul tripán se infunde en la glándula a través de la abertura del conducto de Wharton con una jeringa de insulina con una aguja de calibre 29 encerrados dentro de un tubo de polietileno. Posteriormente, el ratón se diseca para demostrar que las infusiones migrado con éxito dentro de la glándula.
Protocol
1. Descripción del procedimiento
- Por vía subcutánea inyectar 1 l / g de peso corporal de 0,5 mg / ml monohidrato de sulfato de atropina (Cat # 11330, Fluka, EE.UU.) en cada ratón para evitar que las secreciones salivales de interrumpir el movimiento de las infusiones.
- Anestesiar a cada ratón con un peso corporal l / g de 100 mg / ml de ketamina y 20 mg / ml de solución de xilacina (Phoenix Científico, AR, EE.UU.) inyectó intraperitoneal (IP)
- Coloque el ratón sobre una plataforma de plástico a medida en la posición ventral: los incisivos superiores están encerrados en un alambre de metal, y los incisivos inferiores están enganchados a una cuerda elástica con el fin de mantener la boca abierta.
- Use una jeringa de insulina con una aguja de calibre 29 (Cat # 600145, Tyco Healthcare, MA, EE.UU.), colocado dentro de un tubo de polietileno de 0,58 mm de diámetro (Cat # 427410, Becton Dickinson, MD, EE.UU.; Fig. 2). El tubo de polietileno de 5 mm se inserta en la punta de una aguja de calibre 29. La aguja se utiliza como una guía rígida para mover el tubo de polietileno en el conducto de Wharton. El tubo de polietileno se introduce 5.3 mm en el interior del conducto. Tenga en cuenta que sólo el tubo de polietileno entra en el conducto de la glándula salivar, mientras que la aguja se queda fuera del conducto. Inyectan 50 ul de agua filtrada 0,4% solución de azul tripano mancha (Cat # 15250, Gibco, EE.UU.) en la glándula submandibular a través del conducto de Wharton, que se encuentra justo debajo de la lengua. La infusión se entrega de manera constante con presión positiva sobre el émbolo de la jeringa, el dedo se mantiene en el pistón, incluso después de todo, de la infusión se ha entregado a la glándula, con el fin de evitar el retroceso de la infusión intra-oral. La solución de azul tripán se usa en el video como un medio de contraste para demostrar la técnica.
- espués de la inyección de la solución de azul de tripano, el ratón fue sacrificado antes de la disección. La glándula salival es expuesta quirúrgicamente con el fin de determinar la cantidad de las infusiones se han mantenido en la glándula.
2. Los resultados representativos:
Después de las infusiones fueron inyectados, el ratón fue disecada para exponer quirúrgicamente de la glándula salival después de la cánula. Como se muestra en la imagen-2, la coloración oscura del conducto de Wharton ofrece evidencia de que la solución de azul tripán se infundió con éxito.
Figura 1. Canulación de la glándula submandibular del ratón.
Figura 2. Polietileno tubo está envuelto alrededor de la punta de una aguja de calibre 29. La aguja de la jeringa se usa como una guía rígida para mover el tubo de polietileno en el conducto de Wharton. El tubo de polietileno se inserta (cánula) 3-5 mm en el interior del conducto. Tenga en cuenta que sólo el tubo de polietileno entra en el conducto de la glándula salivar, mientras que la aguja se queda fuera del conducto.
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Discussion
Una dificultad con este método es la canalización para evitar el reflujo de la solución inyectada. Aunque la solución de azul tripan ha migrado temporalmente en la glándula salival con éxito, la secreción de la saliva puede interferir con las infusiones y causar reflujo de la solución de azul tripano de la glándula. Como medida de precaución, además de utilizar la atropina para inhibir la secreción de saliva, la cánula de polietileno deben permanecer en el conducto de Wharton y el émbolo de la jeringa cabo durante 60 segundos después de las infusiones se han depositado. Esto permitirá que la mayor parte de la solución infundida a permanecer dentro de la glándula.
Convencionalmente, la aplicación sistémica, es decir, la inyección intravenosa (IV) de las drogas / células, se ha utilizado como una aproximación clínica para la regeneración de la glándula salival. Infusiones inyectado por vía intravenosa, viajará a través de todo el sistema circulatorio, permitiendo sólo algunas de las drogas / células a migrar hacia las glándulas específicas. En comparación con el método tradicional, la aplicación local, que es la inyección de drogas / células a través del procedimiento de canalización, puede ser percibido como una forma más directa y efectiva en la reactivación de las funciones de las glándulas salivales parótidas, submandibulares y sublinguales. Por lo tanto, esta técnica de la canalización se puede utilizar como un modelo fiable para la medicina regenerativa de la glándula salival del ratón, y como una perspectiva a futuro, este procedimiento puede ser un método conveniente para su aplicación clínica.
Sería un gran placer para este artículo-visual para ser utilizado como una herramienta eficaz para los estudiantes e investigadores que estén interesados en estudios de la medicina regenerativa de la glándula salival.
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Disclosures
Todos los experimentos han sido aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad y estaban en conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Dra. Ana Cotrim de consulta técnica y al Dr. Monzur Murshed para el equipo. Este trabajo fue parcialmente financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine | Drug | Fluka | 11330 | To inhibit saliva secretion |
| Ketamine | Drug | Phoenix Scientific | Sedation | |
| Xylazine | Drug | Phoenix Scientific | ||
| Polyethylene tubing (0.58 mm diameter) | Tube | Intramedic | 427410 | To insert over tip of needle to avoid tissue injury during insertion into Wharton’s duct. |
| Ultra Comfort Insulin syringe (with a 29G needle) | Syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 600145 | |
| 4% trypan blue | Stain | GIBCO, by Life Technologies | 15250 |
References
- Fox, P. C. Acquired salivary dysfunction. Drugs and radiation. Ann N Y Acad Sci. 842, 132-137 (1998).
- Bhide, S. A., Miah, A. B., Harrington, K. J., Newbold, K. L., Nutting, C. M. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, prevention and treatment. Clin Oncol (R Coll Radiol). 21, 737-744 (2009).
- Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotech Histochem. 84, 253-260 (2009).
