Summary
肥満細胞および好塩基球の活性化によって特徴付けられるアレルギー反応は、IgEの架橋および前炎症性メディエーターの放出によって駆動される。アレルギー反応の定量的評価は、アレルゲンチャレンジ後の血管透過性の変化を監視するためにエバンスブルー色素を用いることによって達成することができる。
Abstract
アレルギー反応は、肥満細胞および好塩基球、および血管作用性のその後の放出および炎症誘発性メディエーターの活性化の結果である。感作された個体におけるアレルゲンへの暴露は、生命を脅かすアナフィラキシーにマイナー紅斑によって異なる臨床症状をもたらす可能性がある。研究室では、さまざまな動物モデルは、アレルギー反応を駆動するメカニズムを理解するために開発されている。本明細書では、局所的なアレルギー反応を定量化するために、血管透過性の変化を測定するための詳細な方法を記載している。ローカルアナフィラキシーアッセイは、最初に1920年代に報告された、と小島らによって公表さテクニックから適応されています。 2007年に1。このアッセイでは、OVAに感作したマウスは、車両と左耳にし、OVAでの右耳にチャレンジする。これは、エバンスブルー色素の静脈内注射が続く。十分エバンスブルーを注入した後、動物を中に浸出している染料を安楽死させている耳にホルムアミド中で一晩抽出した。抽出された色素の吸光度を分光光度計で定量化される。この方法は、確実に地元のアレルギー反応の視覚的および定量化可能な症状をもたらす。
Introduction
I型過敏症は、肥満細胞および好塩基球の表面上のIgE抗原によって誘発される架橋によって媒介される。これは、細胞の脱顆粒およびヒスタミン、トリプターゼ、および血小板活性化因子2のような血管作動および炎症誘発性メディエーターの放出をもたらす。脱顆粒中に予め形成されたメディエータの放出に続いて、肥満細胞を合成し、プロスタグランジンおよびロイコトリエンを放出し、さらに血管透過3を増加させる。初期臨床反応が急速に発生し、「即時反応」と呼ばれている。皮膚では、膨疹·アンド·フレア応答は、抗原チャレンジの数分以内に容易に見ることができる。チャレンジの用量に応じて、それは数時間後に「後期応答」を観察することができる。後期相腫れ、組織2への局部的な浮腫および白血球動員によるものである。ヒスタミン、一般的に参加している主要なメディエーターであると考えられて即時アレルギー反応は、ヒスタミン受容体1（HR1）に作用して血管やヒスタミン受容体2（HR2）上で発現平滑筋上に発現する。複合効果は、炎症4の部位で血流および血管透過性を増加させる。
アレルギーの動物モデルのさまざまなアレルギー性喘息、全身性アナフィラキシーおよびアナフィラキシーの局所モデルを含むアレルギー性炎症に関与する機構を研究するために開発されてきた。静脈内の色素投与が出版物は1920年代5に戻って、この技術の出会い系を記述すると、ほぼ一世紀のための動物モデルでのローカライズされたアレルギー反応を測定するために使用されています。ウサギおよびモルモットは、即時型過敏反応をテストするために使用される第一の動物モデルであった、そして最も敏感な応答は、一般に、耳5,6で見出された。アッセイは、後に、ラット7およびマウス8で使用するために検証された。
歴史的に、実験方法のさまざまな前の色素の注入は、染料の注入に先立っての抗原の注射への抗原の注射、及び染料と抗原の同時注射を含む、使用されている。アレルギー反応を測定するための手段としての静脈内投与の染料は、それが受動的、能動測定するために使用され、受動的な反応5,9を逆にすることができるように汎用性の高いアッセイである。数多くの染料は、トリパンブルー、ポンタミンスカイブルー、エバンスブルー、チバガイギーブルー536、インドインク5,6,9を含むアレルギー反応を評価するために利用されてきた。 0.5％エバンスブルー溶液は、現在、皮膚にアレルギー反応を測定するために使用される標準的な染料である。
チャレンジに対するアナフィラキシー反応は一過性である。最大強度は10内に到達する-染料注入の15分であり、染料に関係なく9に使用される動物種の、チャレンジ後30分以上を投与された場合も反応は見られない。色素血管外遊出の定量化は、元あったLY青色色素7-9で示されるように膨疹の大きさを測定した。さらに、脱顆粒したマスト細胞の数は、反応部位から皮膚組織を切除し、7トルイジンブルーで染色することにより定量することができる。肥満細胞は、高親和性IgE受容体FcεRIとを発現している主ローカルな細胞集団であるように、マスト細胞脱顆粒は、多くの場合、皮膚、IgE媒介アレルギー応答のためのマーカーとして使用される。組織への色素血管外遊出を測定するための分光光度技術は1990年代にラット10およびマウス11における受動皮膚アナフィラキシー（PCA）のために開発された。
次のローカルアナフィラキシーアッセイプロトコルは、1。小島らから適応し、アレルギー反応を誘発するための抗原として鶏卵卵白アルブミン（OVA）を利用した。しかしながら、所望であれば、OVA以外の抗原を使用してもよい。アッセイは、その後、血管permeabilitの変化を監視するためにエバンスブルー色素を使用する細胞のIgE架橋およびヒスタミン放出をマストに起因し発生するyの。
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Protocol
1感作マウス
- 20ミリグラム/ mlの最終濃度になるように1×PBS中のOVAを希釈することによってOVAストック溶液を調製する。クリオバイアル中にアリコートを下に凍結し、将来の使用のために-80℃で保存してください。
- 室温に20 mg / mlのOVA株の一つ以上の分量を持参してください。キャップ5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに1 mg / mlでの最終濃度になるように1×PBS中OVAを希釈する。ボルテックスを簡単に混合する。
- 1の比率：中速に設定したボルテックスで1 mg / mlのOVAを含むポリスチレンチューブを押さえながら1を生成するために、チューブをボルテックスを続けながら、十分に均質化Imjectミョウバン（40 mg / ml）を滴下して、等量のを追加免疫原に対するミョウバン。
- 渦にチューブ、テープ、チューブのキャップを置きます。最も低い設定で渦をオンにして、OVAを30分間ミョウバンに吸着することができます。
- 多くの時間は、OVA /ミョウバンを用意し、マウスを感作の間を通過させないようにしてください。感作は、OVA /ミョウバンpreparat直後に完了できない場合室温でのイオン、店舗OVA /ミョウバン。使用する前に1分間ボルテックスする。
- OVA /ミョウバン混合物で1ミリリットルのインスリン注射器をロードします。 27ゲージの針を注射器に蓋を。
- OVA50μgのマウス当たりの用量及びミョウバン2mgのためのBALB / cマウスの腹腔にOVA /ミョウバンを100μlを注入。
- ネガティブ対照として、PBSに対するマウスの別のグループを感作。 OVAを省略して、上記と同様に、ミョウバンとPBSの1：1混合物を準備します。
- 3回の注射で合計3週間、週に一度、すべてのマウス（OVAおよびPBS対照）を感作する。最後の注射の後、地元のアナフィラキシーアッセイを行う前に少なくとも2週間待ちます。
2ローカルアナフィラキシーアッセイ
- 室温にOVA原液を持参してください。 （：1×PBS中のOVAの4希釈1）を1.5 mlマイクロチューブでは、PBSで5ミリグラム/ mlの最終濃度に20 mg / mlのOVAストックを希釈する。ボルテックスを簡単に混合する。
- <RC 2を使用して、マウスを麻酔/ SUP>齧歯類麻酔システム（または同等の気化したデリバリーシステム）。イソフルランでリザーバを入力し、O 2気流をオンにします。誘導チャンバ内にマウスを置き、麻酔を開始するために、5％イソフルランコントロールダイヤルを調整します。マウスが完全に麻酔をかけた後、移動性の欠如によって示される、深い麻酔を維持するために、3％イソフルランコントロールダイヤルを調整します。この手順の麻酔の目的は、動物を固定化することです。耳と尾静脈注射は動物に重大な痛みや苦痛を引き起こさない。
注：イソフルランは、人間の生殖系に悪影響を及ぼす可能性があります。廃ガスを中和するために換気の良い部屋で使用し、誘導室に掃気キャニスターを取り付けてください。イソフルランの使用中に妊娠している場合は、露出を最小限にするために、炭素フィルターマスクを着用してください。 - 31 G針でキャップされた3月10日のccインスリン注射器にロード5 mg / mlのOVAを10μlの。 10μlの別の3月10日のccインスリン注射器をロード1倍のPBS。
- 解剖顕微鏡を使用して、OVA50μgののチャレンジ用量のために、麻酔したマウスの右耳にOVAを10μlを注入する。このよう20μgのような他の用量もまた、許容可能である。
- 15ミリリットルコニカルチューブの周りにスコッチテープ（粘着面を上に）ラップ、注射のために耳を安定させるために。テープに右耳の背側を固定します。耳の二枚の葉の間に針のベベル側を上に挿入します。ゆっくりあらゆる血管をヒットしないように注意しながら、耳組織の中心にOVAを注入。
- 上記と同じ方法を使用して、陰性対照として左耳にPBS10μlを注入する。
- 3分待ちます。
- この時間の間に、拘束具にマウスを配置し、血管を拡張するために加熱ランプ下または1分間の温水浴中で尾を保持する。
- 27 G針でキャップされた1ミリリットルのインスリン注射器を使用して、ゆっくりとテールVに0.5％エバンスブルー色素を200μl注入マウスのEIN。全体を200μlのが投与される前に、急速な注入は、血管構造を破壊することができる。この場合は、尾の反対側に静脈内に染料の残りの容積を注入しようとする。
- 10分待ちます。
- マウスを安楽死させると、鉗子や外科用ハサミを使用して、両耳を削除します。
- に圧力が耳の中央に注射部位に適用されていないことを確認して、鉗子で耳の端をつかむ。近くにカットして、できるだけ多くの耳組織を削除ではなくを通じて、耳の付け根で軟骨に存在する尾根。毛皮少量の切除された耳の上に存在してもよい。これは、アッセイには影響しません。
- 一定分量1.5mlのマイクロチューブにホルムアミド700μlの。耳ごとに1つのチューブ（マウスあたり2の管）を準備します。
注：ホルムアミドは、催奇形性、変異原性、および刺激物である。手袋、眼の保護、保護面を着用すること。取り扱いには妊娠中の女性は注意が必要ですsのホルムアミドは胎児毒性があります。 - 、ホルムアミド、チューブにキャップをし、63℃に設定し、ドライ熱浴中で一晩インキュベートし、耳を追加します。耳はまだインキュベーション後に、わずかに青い表示される場合があります。しかし、染料の大部分は、ホルムアミド中に抽出されます。
- 96ウェルプレートに、二重に、各サンプルを300μlを追加。それが試料中に存在する場合に毛皮を転送避ける。彼らは吸光度の読み取りに影響を与えるように、ウェル中に存在気泡がないことを確認します。
- 96ウェルプレートに、二重に、ホルムアミドを300μlを追加。これらのウェルはブランクとして使用されます。
- 620 nmの吸光度を測定するための分光光度計を使用してください。各サンプル読みからホルムアミド井戸を引きます。
注：すべての実験は制服サービス大学施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下で実施した。
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Representative Results
成功した検定を受けた動物は、青色に見える皮膚や目を持つことになります。 PBS感作動物は、したがって、両方の耳が（ 図1A）白のままべきで、PBSまたはOVAチャレンジのいずれかに反応すべきではない。 OVA感作動物では、PBSチャレンジを受け取っ耳（左）は、注射部位の局所的な方法で完全に白か軽く青のどちらかである必要があります。 OVAチャレンジを受けた耳（右）は染料の管理（ 図1B）の後に10分の間に次第に暗く青いなるはずである。
PBS感作動物は、PBSとOVAチャレンジ（ 図2A）の両方に無視できる吸光度の読み取りを持つことになります。 OVA感作動物では、PBS注射は一般的に0.13の平均吸光度読み取りと0.04の標準偏差になる。逆に、0.58の平均吸光度読み取りと0.18の標準偏差が50μgのOVAチャレンジの結果（FIグレ2B）。必要であれば、チャレンジのために使用されるOVAの量は、個別の実験のために調整することができる。例えば、0.30の平均吸光度と0.10の標準偏差（ 図2C）中20μgのOVAチャレンジの結果は、しかし、チャレンジ20μg未満、信頼性のある結果が得られない場合があります。 OVA濃度の変化は、最適化されており、使用前に検証する必要があります。
PBSの吸光度がOVAの吸光度と比較して結果をグラフィカルに、対にすることができる。あるいは、結果は、各個別の動物についてOVA吸光度から差し引いPBS吸光度を、単一の値としてプロットすることができる。
図1：PBSおよびOVA感作動物において、耳の色素沈着。 （A）。 PBS感作動物での耳の色素沈着。 5でチャレンジ（PBSでチャレンジ）左耳と右耳（0μgのOVAは）無色素血管外漏出はほとんど示しています。（B）。 OVA感作動物での耳の色素沈着。ブルー色素血管外遊出がないことによって示されるように、（PBSでチャレンジ）、左耳にはアレルギー反応は存在しない。 （50μgのOVAでチャレンジ）右耳が増加血管透過性を示す明るい青色着色、耳組織における細胞活性化の直接的な結果を示している。
図2：OVA感作動物のための代表的なOD値は 620nmで採取分光光度測定から導出OD値（A）。 PBS感作動物では50μgのOVAチャレンジ。両方のPBSとOVA挑戦のためのOD値は無視できる。（B）。 OVA感作動物では50μgのOVAチャレンジ。 OD値<0.2およびOVAチャレンジRESUにおけるPBSチャレンジ結果OD値> 0.3におけるLTS。（C）。 20μgのOVAチャレンジ。 OD値のPBSチャレンジの結果<0.2。右の耳がわずかに使用OVAの小さいチャレンジ用量によるOD値が低下している。
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Discussion
アレルギー性疾患の多数のマーカーが気道チャレンジの設定における気管支肺胞洗浄液中へ循環させるヒスタミン、Th2サイトカインの産生、および細胞動員のレベルの変化を含む、アレルゲン攻撃後のアレルギー反応の強度を評価するために使用される。これらのパラメータの変化をモニタリングすること、アレルギー反応を研究するために重要であるが、生物学的マーカーは、常に臨床アレルギー性疾患と相関しない。このプロトコルで説明ローカルアナフィラキシーアッセイは、ローカライズされたアレルギー性疾患の相関としてローカライズされた血管透過性の再現性のある測定を提供する。ブルー色素血管外漏出を使用することにより、このプロトコルは、可視化およびローカライズされたアレルギー反応の相対的な定量化の両方を可能にします。臨床スコアリングに依存するアレルギーアッセイとは対照的に、（分光光度吸光度によって測定される青色色素の血管外遊出）このアッセイの一次結果は、簡単に観察者バイアスを受けない。もう一つのアドバntage動物が潜在的アレルゲンチャレンジと色素投与によって引き起こされる不快感を制限し、すぐに攻撃後に安楽死させていることである。 ら 10は 、血管透過性の変化の連続測定を可能にする秋山らによって記載ハンドヘルド分光光度計の別の使用。しかし、エバンスブルー色素は有毒であり、注入は、最終的に動物が安楽死される必要につながる。
このアッセイは長所がいくつかありますが、それはやや技術的に困難であるという制限がありません。信頼性の高い結果が一貫して成功した耳と尾静脈注射に依存している。血管の明らかな穿刺耳注入の結果場合全体チャレンジ用量は、耳に投与されない場合、またはエバンスブルー静脈内注射が完了していない場合、動物は、解析から除外されるべきである。当研究室では、研究者らは、セベのための皮内耳の注射を練習しなければならなかった能力を開発する前に、RAL週間。加えて、アッセイのための適切なコントロールを実行することが重要です。動物は針の挿入により引き起こされる損傷に対してわずかに異なって応答するように見える具体的には、PBS注射を日常、内部対照として使用されるべきである。 PBSの読みは、注射そのものによって誘発される血管透過性の変化のベースライン測定値を与える。皮内、耳内注射を使用する代わりに、アッセイはまた、マウスの背中の皮膚に適用することができる。研究者らは、あまり技術的に困難であるためにこのルートを見つけることができ、、加えて、それは同時に複数の抗原のテストを行うことができます。
チャレンジ用量は、実験に応じて操作することができるように、ローカルアナフィラキシーアッセイは、非常に用途が広い。それはアレルギー反応の変化を見る必要がある場合、それは、20μgのような低級OVAチャレンジ用量を、使用することが有益であり得る。これは、のように、吸光度の変化を監視する感受性の増加を可能にするそれは、細胞活性化のための飽和点に到達することをにくくなる。
さらに、このアッセイは、受動皮膚アナフィラキシー（PCA）を研究するために使用することができる。この設定では、抗原特異的IgEは、他に片耳車両に注入される。 24時間後、動物は、抗原とエバンスブルー色素を静脈内チャレンジを与えられている。 PCAモデルは、実験に使用する動物の数を完了するのにかかる時間を短縮し、研究者はIgEの架橋の特異的な効果を見ることを可能にする。
実行するために長いを取ったにもかかわらず、この論文に記載のアクティブ皮膚アナフィラキシー（ACA）モデルを使用することにはいくつかの利点があります。抗原を模倣感作は、通常、全身で、人々が一般的に流通してアレルゲン特異的IgEおよびIgGの両方を持っているように、個人が、アレルギー性疾患を発症するプロセスに毎週暴露により感作。 IgEの架橋は、MAの主な手段であるが、第細胞脱顆粒、肥満細胞はまた、IgGの架橋に応答する。研究者は唯一のIgE媒介性疾患に加えて、アレルギー反応のメカニズムを調査するためにそのため、ACAモデルが可能になる。使用感作の方法は、研究者の裁量である間に結論として、地元のアナフィラキシーアッセイは、汎用性と感作の方法論のさまざまな使用することができます。
耳の腫脹、アレルギー応答を評価するための一般的に使用されるマーカーは、また、OVAチャレンジ後に測定することができる。私たちは、OVAでチャレンジした耳は、1時間のポスト噴射にてPBSでチャレンジ耳よりも著しく膨潤を有することを見出した。エバンスブルー試験とは対照的に、私たちは測定機器を使用するときに耳の圧縮によって変更することができる耳の厚さの測定は血管外遊出を染色し、耳の厚さの研究者の間で大きなばらつきを示すことよりも感受性が低いことを観察した。
マウス以外の株BALB / cがローカルアナフィラキシーアッセイのために使用することができる。しかし、吸光度の測定値は、使用した株によって多少異なります。強力なTh2応答を発症するそれらの傾向にあるため、BALB / cマウスは、一般的に、このアッセイで信頼性の高い、再現性のある測定値を生成する。
このアッセイは、抗原の多様な感作動物でのローカライズされたアレルギー反応の定量化が可能になります。アッセイは首尾よくOVAおよびキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）のような一般的なアレルゲンを用いて実施されているように、抗原の選択は、可撓性である。また、感作の代わりに、局所アレルギー反応は、抗体を注入することによって、ナイーブ動物中で誘発することができる好塩基球および肥満細胞上の架橋のIgEまたはIgE受容体、またはそのようなCD200R3 1と、これらの細胞上の非IgEの活性化受容体を連結することにより。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27 G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
References
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- Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
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