Questo studio confronta due diversi metodi di isolamento dei monociti umani per ottenere cellule dendritiche (DC) in vitro. I monociti vengono selezionati per adesione o arricchiti negativamente per separazione magnetica. La resa e la vitalità dei monociti, insieme alla vitalità dell'MDDC, alla proliferazione e all'espressione del marcatore di superficie CD11c/CD14 saranno confrontate tra i due metodi.
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Articolo metodologico
Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule dendritiche (DC) sono cellule presentanti l'antigene del sistema immunitario che svolgono un ruolo cruciale nelle risposte dei linfociti, nei meccanismi di difesa dell'ospite e nella patogenesi dell'infiammazione. L'isolamento e lo studio delle DC sono stati importanti nella ricerca biologica a causa delle loro caratteristiche distintive. Sebbene siano mediatori chiave essenziali del sistema immunitario, le DC sono molto rare nel sangue, rappresentando circa lo 0,1-1% delle cellule mononucleate totali del sangue. Pertanto, le alternative per i metodi di isolamento si basano sulla differenziazione delle DC dai monociti isolati dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). L'utilizzo di tecniche di isolamento adeguate che combinano semplicità, convenienza, elevata purezza e alta resa delle celle è imperativo da considerare. Nel presente studio, verranno confrontati due metodi distinti per la generazione di DC. I monociti sono stati selezionati per aderenza o arricchiti negativamente utilizzando la procedura di separazione magnetica seguita dal differenziamento in DC con IL-4 e GM-CSF. La vitalità, la proliferazione e il fenotipo dei monociti e dell'MDDC sono stati valutati utilizzando coloranti di vitalità, saggio MTT e analisi dei marcatori di superficie CD11c/CD14 mediante citometria a flusso di imaging. Sebbene il metodo di separazione magnetica abbia prodotto una percentuale significativamente più alta di monociti con una maggiore capacità proliferativa rispetto al metodo di adesione, i risultati hanno dimostrato la capacità di entrambe le tecniche di generare contemporaneamente monociti in grado di proliferare e differenziarsi in MDDC CD11c+ vitali dopo sette giorni di coltura. Entrambi i metodi hanno prodotto > 70% di MDDC CD11c+. Pertanto, i nostri risultati forniscono intuizioni che contribuiscono allo sviluppo di metodi affidabili per l'isolamento e la caratterizzazione delle DC umane.
Introduzione
Le cellule dendritiche (DC) sono mediatori essenziali del sistema immunitario innato e adattativo. La loro funzione di indurre risposte immunitarie primari e facilitare lo sviluppo della memoria immunologica. Queste cellule sono i principali responsabili per la cattura l'antigene, la migrazione e la stimolazione delle cellule T e sono quindi indicati per le cellule presentanti l'antigene come professionali (APC) 1 .Manipulation delle DC potrebbe essere utilizzato in una vasta gamma di settori di ricerca e in ambito clinico per il trattamento di diverse malattie infiammatorie come l'HIV 6,7, il cancro, le malattie autoimmuni 8
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Protocollo
studi del sangue umano complessivi sono stati esaminati e approvati dal Institutional Review Board (IRB) di FIU, protocollo IRB approvazione # IRB-13-0440. leukopaks umani sono stati acquistati dalla banca del sangue comunità in Miami, FL.
1. Isolamento di PBMC da Tecnica gradiente di densità standard
- Eseguire una diluizione 1: 1 di sangue con soluzione salina 1x-tampone fosfato in un pallone T75.
- Pipettare 15 ml di soluzione gradiente di densità in 50 ml provette da centrifuga e accuratamente strato (25 - 30 ml / provetta) del sangue diluito su tutto questo gradiente.
- Centrifugare per 20 minuti a 1200 xg co....
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Risultati
Monociti Resa dalla separazione magnetica è superiore rispetto a monociti Resa secondo il metodo Aderenza
I dati presentati in Figura 1 mostra PBMC e conta delle cellule monociti dal metodo di esclusione del trypan blue alla data di isolamento delle PBMC e separazione dei monociti. In media, monociti isolati con il metodo aderenza rappresentato circa il 6,2 per cento di PBMC totali, ment.......
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Discussione
Sulla base delle note difficoltà di isolare e generando MDDCs dal sangue umano, il presente studio ha lo scopo di fornire un confronto completo dei due metodi consolidati per la generazione di MDDCs. Il primo metodo rispetto è un metodo tradizionale consolidata per generare MDDCs sfruttando la capacità dei monociti di aderire al vetro o plastica (metodo aderenza) 21,22,27. Il metodo aderenza è veloce ed economica, e non richiede l'uso di attrezzature complesse. Tuttavia, alcuni svantaggi di questo process.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori non rivelano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questa ricerca è supportata dal National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, premio K99/R00 AA021264. Un ulteriore supporto di laboratorio come parte del pacchetto di avvio è stato ricevuto dal Dipartimento di Immunologia, dall'Istituto di Farmacologia NeuroImmunitaria, dall'Herbert Wertheim College of Medicine e dall'Ufficio di Ricerca e Sviluppo Economico della FIU. Gianna Casteleiro è stata supportata da NIH/NIGMS R25 GM061347. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Deve essere utilizzato presso RT |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Tampone di lisi | Qualità Biologico | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotico-Antimicotico (100x) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| tampone RoboSep | StemCell | 20104 | |
| EasySep Kit per l'arricchimento di monociti umani | StemCell | 19059 | |
| TC20 Contatore di cellule automatizzato | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Colorazione blu di tripano (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 lettore multimodale | Biotek | 7131000 | |
| XTT Bioreagente sale di sodio (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Bioreagente dimetilsolfossido (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Tiazoil-blu tetrazolio bromuro (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodio Dodecil Solfato (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Fenazina Metosolfato (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Siero Umano Inattivato (HI) | Chemicon | S1-100ML | |
| Citometro a flusso Accuri C6 BD | Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Citometro a flusso | EMD Millipore | 100300 |
Riferimenti
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Banchereau, J., Stein....
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Ristampe e permessi
