Introduction
Las células dendríticas (DC) son mediadores esenciales de los sistemas inmune innata y adaptativa. Funcionan para inducir respuestas inmunes primarias y facilitar el desarrollo de la memoria inmunológica. Estas células son los principales responsables de captura de antígeno, la migración y la estimulación de las células T y por lo tanto se conocen como células presentadoras de antígenos (APC) profesionales 1 .Manipulation de países en desarrollo podría ser utilizado en una amplia variedad de campos de investigación y en la práctica clínica para el tratamiento de diferentes enfermedades inflamatorias tales como el VIH 6,7, cáncer, enfermedades autoinmunes 8 9, y las respuestas alérgicas 10. DCs también se están utilizando para la investigación de abuso de sustancias con el fin de resolver los mecanismos desconocidos y vías, tales como los asociados con la dependencia del alcohol 11 a 14, la dependencia de drogas 13,15, y la combinación de la infección y la sustancia VIH abuso 16-19. Estos estudios en curso y futuros estudios de investigación in el campo de la inmunología hacer en la generación in vitro de los países en desarrollo muy importante para la investigación. Sin embargo, hay varias dificultades asociadas con el aislamiento de las DC a partir de sangre humana, ya que sólo constituyen 0,1 a 1% de las células mononucleares de sangre total 20.
Hasta la fecha, algunos de los métodos bien establecidos para la generación de DCs in vitro consiste en plástico o vidrio adherencia de monocitos 21,22, densidad de centrifugación en gradiente de 23, la separación basada marcador específico tal como de células activadas por clasificación magnética 22, de células activadas por fluorescencia de clasificación 24, la selección positiva de los monocitos CD14 + utilizando nanopartículas magnéticas recubiertas de dextrano 25, y el rápido aislamiento de los monocitos altamente purificados usando selección celular negativa totalmente automatizado 26. Sin embargo, el mejor método de elección sigue siendo controvertido. Por lo tanto, para mejorar las técnicas de generación de corriente continua, varios métodos han sido desarrollados en la quela pureza de estas células se puede aumentar en gran medida por la diferenciación de las células y los monocitos purificados progenitoras CD34 + aisladas a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) 27. Como se ha mencionado antes, un método ampliamente utilizado y popular para la generación de células dendríticas derivadas de monocitos (MDDCs) es explorar la capacidad de los monocitos se adhieran al vidrio o plástico (método de adherencia) 21,22,27. El método de adherencia es un método rápido y sencillo que no requiere el uso de equipos complejos. Sin embargo, algunas desventajas de este proceso incluyen la contaminación de linfocitos, baja flexibilidad, y monocitos manipulación transitoria 28. Un método alternativo al método de adhesión es el aislamiento magnético de los monocitos de PBMC totales, en particular con el uso de un kit de monocitos enriquecimiento humano, que está diseñado para aislar los monocitos de PBMC por selección negativa 26. Durante este procedimiento, las células no deseadas son objeto de extracción con tetraméricacomplejos de anticuerpos y partículas magnéticas recubiertas de dextrano. La ventaja de este método de aislamiento es que las células marcadas no deseadas se separan mediante un imán, mientras que las células diana se pueden verter libremente fuera en un nuevo tubo sin necesidad de columnas. Hasta la fecha, con la disponibilidad de anticuerpos monoclonales específicos que pueden etiquetar las poblaciones de células únicas, la técnica de separación magnética se ha convertido en no simplemente un método adicional, sino una necesidad para el aislamiento de células raras en el campo de la inmunología. Por ejemplo, las técnicas tales como clasificación celular magnética con paramagnéticas disponibles comercialmente MACS-nanopartículas han facilitado el desarrollo de nuevos enfoques para la investigación y aplicaciones clínicas 22,29. Por otra parte, los estudios de investigación recientes que comparan la generación de DC a partir de métodos de adherencia de monocitos y la tecnología MACS han demostrado una mayor pureza y la viabilidad de CC utilizando MACS monocitos 22,30 separadas.
Los presentes estudios actualesuna comparación entre dos métodos para la generación de DCs humanas de monocitos aislados de PBMC: 1) los monocitos de aislamiento por adherencia y 2) el aislamiento de monocitos por selección negativa utilizando un kit comercial de monocitos enriquecimiento humano. Este estudio proporciona evidencia para demostrar que la selección procedimiento de separación magnética negativa para aislar monocitos genera el mayor rendimiento de monocitos con diferencias significativas en la viabilidad de monocitos en comparación con los monocitos aislados por el método de adherencia. A su vez, después de siete días, los monocitos aislados por separación magnética diferencian en MDDCs con significativamente mayor capacidad de proliferación y una mayor cantidad de células que expresan doble positivo (+ CD11c / CD14 +) fenotipo sin afectar MDDC viabilidad. En general, el estudio actual se diferencia de los estudios anteriores mencionadas anteriormente, ya que demuestra la capacidad de ambas técnicas para generar simultáneamente monocitos que son capaces de proliferar y diferenciarse en CD11c +MDDCs (> 70%) después de siete días en cultivo sin comprometer su viabilidad. Además, el enfoque actual prevé la primera caracterización de tiempo / poblaciones diferentes CD11c CD14 MDDCs por el flujo de imágenes citometría.
En resumen, ya que los países en desarrollo desempeñan un papel central en relación con la investigación en el campo de la inmunología, diferentes parámetros deben tenerse en cuenta a la hora de considerar cómo se han obtenido y qué métodos se utilizan para aislar y cultivar en vitro. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo proporcionar información sobre dos diferentes métodos de aislamiento de monocitos y cómo estos métodos afectan diferencialmente la viabilidad de monocitos y el rendimiento con el tiempo afecta a la viabilidad de células dendríticas, proliferación y fenotipo. Estos hallazgos contribuirán en gran medida al campo de la inmunología y proporcionarán un protocolo detallado de DC aislamiento, purificación y caracterización.
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Protocol
Los estudios de sangre humana en general han sido revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la UIF, el protocolo IRB # aprobación del IRB-13-0440. leukopaks humanos se adquirieron en el banco de sangre de la comunidad en Miami, FL.
1. Aislamiento de PBMC por Norma Técnica gradiente de densidad
- Realizar una dilución 1: 1 de sangre con solución salina tamponada con fosfato 1x-en un matraz T75.
- Pipetear 15 ml de la solución de gradiente de densidad en 50 ml tubos de centrífuga y cuidadosamente capa (25 - 30 ml / tubo) de la sangre diluida sobre este gradiente.
- Centrifugar durante 20 min a 1.200 xg con una aceleración de 1 y deceleración de 0.
- Después de la centrifugación, recoger la capa de interfaz (células blancas de la sangre) en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml y lavar las células dos veces en PBS (3 min a 1.080 xg). Desechar el sobrenadante cada vez.
- Tratar las células con tampón de lisis de amonio-cloruro de potasio (ACK) (para lisar las células rojas de la sangre). Añadir 10 ml de tampón y enCubate durante 15 min a 4 ° C.
- Lavar las células dos veces con PBS, centrifugar durante 3 minutos a 1.080 xg y desechar el sobrenadante cada vez.
- Guardar el precipitado, el cual contendrá los PBMCs.
- Proceder con método de purificación de monocitos de elección.
2. Monocitos purificación por adherencia Método
- Preparar medio de cultivo celular completo que contiene L-glutamina (300 mg / ml) y suplementado con penicilina (50 U / ml) -streptomycin (50 mg / ml) y suero bovino fetal al 10%.
- Permitir PBMCs que se adhieran durante aproximadamente 2 horas por cultivo en un matraz T75 a una concentración de 5 x 10 7 células por 10 ml de medio completo a 37 ° C y 5% de CO2 en un incubador humidificado.
- Después de la incubación, retirar las células flotantes no adherentes del frasco de cultivo y lavar suavemente las células adherentes dos veces con PBS.
- Se incuban las células adherentes en medio de cultivo celular completo suplementado con 2 l / ml de granulocitos humano macrophage factor estimulante de colonias (GM-CSF) y la interleucina 4 (IL-4) se almacenan a una concentración de solución madre de 10 mg / ml.
- Cambiar la mitad del medio y reponer citoquinas cada 48 hr.
- Permitir 5 - 7 días para la diferenciación de los monocitos en MDDCs.
3. monocitos purificación por el Método de Separación Magnética
- Recoger PBMCs de técnica de gradiente de densidad estándar, se vierte en un tubo de poliestireno de 5 ml y volver a suspender en tampón PBS a una concentración de células / ml.
- Añadir cóctel de monocitos enriquecimiento humano usando células de 50 l / ml, mezclar bien y se incuba a 4 ° C durante 10 min.
- Después de la incubación, añadir partículas magnéticas usando células 50 l / ml, mezclar bien y se incuba a 4 ° C durante 5 min.
- Llevar suspensión de células hasta un volumen total de 2,5 ml mediante la adición de tampón PBS, mezclar bien pipeteando arriba y abajo 2 - 3 veces.
- Coloque el tubo de poliestireno sin tapa en el dispositivo magnético y dejar de lado a TA durante 2.5 minutos.
- Después de la incubación y en un movimiento continuo, recoger el imán y verter la fracción de monocitos purificados deseada en un tubo limpio de centrifugación de 50 ml.
- Se incuban las células adherentes en medio completo de cultivo celular suplementado con 2 l / ml de granulocitos y macrófagos, factor estimulante de colonias (GM-CSF) humano y la interleucina 4 (IL-4) se almacenan a una concentración de solución madre de 10 mg / ml.
- Cada 48 horas, cambie la mitad del medio, girar hacia abajo a 1.080 xg durante 5 min y una nueva suspensión de pellets con nuevos medios (cRPMI) y citoquinas.
- Permitir 5 - 7 días para la diferenciación de los monocitos en MDDCs.
4. Trypan Blue ensayo de exclusión de viabilidad
Nota: Utilice esta técnica para obtener el rendimiento de células y la viabilidad de las PBMC, monocitos, y MDDCs.
- células de la cosecha utilizando estándar de tripsina-EDTA y realizar lavados de los frascos y el sedimento de células usando PBS. Dependiendo del tamaño de la pastilla, resuspender en 5 a 10 ml de PBS para disolver el sedimento.
- En un tubo de microcentrífuga, lleve a cabo una dilución 1: 1 de reactivo de azul de tripano con sedimento celular diluido.
- De esta mezcla, alícuota de 10 l en un recuento de células de diapositivas y leer los resultados usando un contador de células automatizado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Si un contador de células automatizado no está disponible, un recuento de células similares es posible utilizando un hemocitómetro o un contador manual.
5. Ensayo MTT
- Células de la placa a una concentración de 4 x 10 4/100 l de medio completo en cada pocillo en una placa de 96 pocillos. Permitir 24 horas para que las células se adaptan a la cultura.
- Incubar y realizar lecturas a 0 (día 0), 36 (día 3) y 84 (día 7) hr respectivamente.
- Al término de la incubación se desea, eliminar el medio y reemplazar con 100 l de PBS solo.
- Preparar 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio solución de bromuro (MTT) (5 mg / ml) mediante la adición de 10 ml de DiMethsulfóxido il (DMSO) a 1 g de dodecilsulfato de sodio (SDS).
- Añadir 10 l (5 mg / ml) de solución de MTT a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 2 horas adicionales.
- Después de la incubación, retirar los sobrenadantes que contienen PBS y la mezcla de MTT no convertido (solución de color amarillo-color).
- Añadir 100 l de solución de SDS-DMSO a cada pocillo e incubar durante una hora adicional.
- Leer la absorbancia a 540 nm utilizando un lector de microplacas.
6. Análisis de Superficie Celular La tinción por Imaging Citometría de Flujo
- Después de 7 días de diferenciación a partir de monocitos purificados, dispensar 1x10 6 alícuotas celulares de las células dendríticas derivadas de monocitos en el número apropiado de tubos de 1,5 ml.
- Comienza por tinción de la superficie celular por las células de bloqueo utilizando 50 l de inactivado por calor (HI) en suero humano, se incuba a 4 ° C durante 10 min.
- Después de la incubación, centrifugar las células a 720 xg durante 5 minutos, desechar el sobrenadante.
- A los teléfonos pellet, añadir anticuerpos conjugados con fluorocromo respectivos (por ejemplo, anti-CD11c o anti-CD14) y se incuba a 4 ° C durante 20 min protegidas de la luz. En tubos separados, preparar individuales fluorocromo manchado muestras / ml), ya que se necesitan para la compensación.
- Después de la incubación, lavar las células dos veces en 1 ml de tampón PBS y se centrifuga cada vez a 720 xg durante 5 min.
- Mantener células protegidas de la luz, re-suspender en tampón PBS a una concentración de células / 100 l para citometría de flujo análisis.
- Con el fin de puerta en células viables, añadir 1 l de DAPI a cada tubo antes de la adquisición de las células en el flujo único de imágenes de células citometría de instrumento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
7. Análisis estadístico
- Introducir todos los datos en una hoja de cálculo.
- Comparación de los resultados utilizando la prueba t de estudiante y / o ANOVA de una vía, según proceda.
- Considere diferencias estadísticamente significativas si p <0,05.
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Representative Results
Rendimiento de los monocitos por separación magnética es mayor en comparación con los monocitos por adherencia Rendimiento Método
Los datos presentados en la Figura 1 PBMC pantalla y los recuentos de células de monocitos por el método de exclusión con azul de tripano en el día del aislamiento de PBMCs y la separación de los monocitos. En promedio, los monocitos aislados mediante el método de la adhesión representaron aproximadamente el 6,2 por ciento de las PBMC totales, mientras que los monocitos aislados por separación magnética representaron hasta un 25 por ciento de las PBMC. El análisis estadístico reveló que el porcentaje de monocitos producidos por separación magnética fueron significativamente mayores (≥ 4 veces). Los datos se expresan como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. El análisis estadístico utilizando la t de Student-test mostró una diferencia significativa de rendimiento de los monocitos al comparar ambos métodos (p ≤ 0,0005).
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> El aislamiento de monocitos por adherencia y por separación magnética No le afecta la viabilidad de monocitosDespués del aislamiento de monocitos por las dos técnicas diferentes descritos anteriormente, se realizaron ensayos de viabilidad para garantizar que los métodos utilizados no eran citotóxicos y afectar a la viabilidad de las células. Los datos presentados en pantalla la figura 2 de la media del porcentaje de monocitos viables aisladas por cualquiera de los métodos adherencia o por separación magnética. Las células viables se contaron usando el método de exclusión con azul de tripano en el día del aislamiento. Comparando porcentaje de viabilidad de los monocitos entre los dos métodos de aislamiento reveló que la diferencia entre los dos grupos no fue estadísticamente significativa. Además, la media del porcentaje de monocitos viables aisladas por adherencia fue 91,75% ± 1,66 y el promedio del porcentaje de monocitos viables aislado por magnetic separación fue del 87,4% ± 2.75. Estos datos se evaluaron la viabilidad de al menos tres experimentos independientes. La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student.
Las células derivadas de monocitos aislados por separación magnética muestran un aumento significativo en la proliferación celular en comparación con las células derivadas de monocitos adquirida por Adherencia Método
MTT se usó como un ensayo colorimétrico para medir la proliferación celular. En las células vivas, el color amarillo de tetrazol de MTT se reduce a formazán púrpura, que se mide fácilmente utilizando un espectrofotómetro. Los datos presentados en la Figura 3 demuestran que ambos procesos de aislamiento de monocitos conducen a la proliferación celular más alta durante un período de 7 días según se mide por un aumento en la absorbancia a día 0 (método de adherencia: 0,22 ± 0,02 vs. método magnético: 0,38 ± 0.02), El día el método 3 (adherencia: 0,28 ± 0,02, el método magnético: Método de 0,55 ± 0,05) y el día 7 (adherencia: 0.36 ± 0.01, 0.66 ± magnética = 0,006). Sin embargo, a diferencia del ensayo XTT (datos no mostrados), el ensayo de MTT reveló un aumento significativo en la proliferación celular de MDDCs de monocitos aislados por separación magnética en comparación con MDDCs de monocitos adquiridos por el método de adherencia en el día 0 (p = 0,003), día 3 (p = 0,006), y el día 7 (p = 0,002). También se encontró la proliferación de la célula a ser significativamente diferente entre los días 0 y 3 (p = 0,003), y entre los días 0 y 7 (p <0,001) en el grupo de MDDCs de monocitos purificó a través de la separación magnética. Además, se observó una diferencia significativa en la proliferación de células entre el día 0 y día 7 en MDDCs a partir de monocitos purificados por adherencia (p = 0,008). ensayo de MTT se realizó utilizando MDDCs adquiridos a partir de tres experimentos diferentes. La significación estadística se determinó a través de ANOVA y la prueba t de Student, p ≤ 0,05 wcomo se considera significativa, y los valores p se indican en el gráfico a no ser que no se encontró significación estadística.
Caracterización de MDDCs por CD11c y CD14 de la superficie celular de tinción
Después de cultivar los monocitos durante siete días con IL-4 y GM-CSF, MDDCs obtuvieron a partir de monocitos aislados por métodos de adherencia y aislamiento magnético se caracterizaron en la Figura 4. La caracterización reveló bajo sola CD14 + / fenotipo CD11c- o población puramente monocítica en ambos métodos, la adherencia = 1% ± 1,0 frente magnética = 1% ± 0.0 y alto total de CD11c + fenotipo, la adherencia = 72% ± 11 frente magnética = 79% ± 19. Sin embargo, cuando se analizó además la CD14 + total de la población, había un alto rendimiento de células doble positivas para CD11c y CD14 en ambos métodos de separación magnética con dando un mayor número de CD11c y CD14 doble positivaspoblación en comparación con el método de la adherencia, la adherencia = 49% ± 7 frente magnética = 73% ± 15. Aunque, hubo un mayor rendimiento de MDDCs con fenotipo doble positivo a través de la separación magnética, la CD11c positivo y negativo de la población CD14 de MDDCs fue mayor en el método de adherencia; adherencia = 23% ± 7 frente magnética = 6% ± 7. En la figura 4B, la intensidad media de fluorescencia (MFI) de cada marcador individual se observó en la población cerrada y mostró una alta intensidad de CD14 en CD14 + de la población, intensidad equivalente de ambos CD11c y CD14 en la población positiva doble y una alta intensidad de CD11c en CD11c + y CD14- población. En resumen, a pesar de que el aislamiento magnético da un mayor porcentaje de CD11c + / CD14 + células, que pueden ser las primeras etapas diferenciadas MDDCs que aún no han abandonado el marcador de monocitos (CD14), el método de adherencia da un mayor porcentaje de CD11c + / CD14-, la cual puede ser una etapa tardía diferenciado población MDDC. en adicion, tinción DAPI se realizó para confirmar los resultados de viabilidad y para asegurar la caracterización se realizó en MDDCs vivo. El porcentaje de DAPI negativo / células vivas (adherencia = 76 ± 7 frente magnética = 67 ± 1) no son significativamente diferentes entre los dos métodos que confirman ambos métodos no afectan a la viabilidad de las MDDCs después de siete días de cultivo.
Figura 1. Rendimiento de monocitos por separación magnética se mayor en comparación con los monocitos por adherencia Rendimiento Método. Acerca de 6,2% de los monocitos fueron aislados de PBMC utilizando el método de la adherencia, mientras que ~ 25% de los monocitos se obtuvieron utilizando el método de separación magnética. Los datos se expresan como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. t-test estadístico usando análisis de los estudiantes mostró una diferencia significativa de rendimiento de los monocitos al comparar ambos métodos(p = 0. 00005). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Monocitos El aislamiento por adherencia y por separación magnética no afectan de monocitos viabilidad. El promedio del porcentaje de monocitos viables aisladas por adherencia fue 91,75% ± 1,66 y el promedio del porcentaje de monocitos viables aisladas por separación magnética fue 87,4% ± 2.75. Los datos se expresan como media ± SD porcentaje de células viables de al menos tres experimentos independientes. No hay diferencia significativa se observó en la viabilidad celular al comparar los dos métodos de purificación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Las células derivadas de monocitos aislados por separación magnética muestran un aumento significativo en la proliferación celular en comparación con las células derivadas de monocitos Adquirida por Adherencia Método. Se observó un aumento significativo de la absorbancia para ambos métodos tanto en el día 3 y el día 7 al comparar los valores frente a sus respectivos controles de día 0. Además, ANOVA y la prueba t de estudiante también mostraron una diferencia significativa en la absorbancia de la absorción de MTT al comparar ambos métodos (p ≤ 0,05). Los datos se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4. Caracterización de MDDCs por CD11c y CD14 tinción de la superficie celular. Gráfico A) de barras que representa las diferentes poblaciones (% cerrada fuera de las células individuales). En primer lugar, las células DAPI- (vivos) fueron cerrada a partir de células individuales en total. Entonces, CD14 + / CD11c-, CD11c +, CD11c + / CD14 + y CD11c + / CD14- fueron cerrada desde DAPI- (vivo) de la población. CD11c + población es la suma de dos regiones CD11c + / CD14 + y CD11c + / CD14-. B) gráficas representativas que muestran la intensidad de fluorescencia media (MFI) valores para ambos CD11c y CD14 en cada subpoblación de células. C) gráficos de dispersión Representante de células marcadas con CD11c-APC y CD14-APCcy7 cerrada en DAPI negativo población de células (vivas) para ambos métodos magnéticos y adherencia. galería imagen representativa de las células individuales (seleccionada en azul en los gráficos de dispersión) que pertenecen a cada sub-población de células, CD11c + / CD14- (cerrada en naranja), CD11c + / CD14 + (cerradaen rojo), y CD14 + (cerrada en púrpura). En la galería de imágenes de células individuales, el color rojo representa CD11c marcado con APC y el color amarillo representa CD14 marcado con APCcy7. En los gráficos de dispersión, los colores elegidos para puerta de las poblaciones son aleatorios y no se correlacionan con las imágenes de células reales. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Sobre la base de las dificultades conocidas de aislar y generar MDDCs a partir de sangre humana, el presente estudio tuvo como objetivo proporcionar una comparación exhaustiva de los dos métodos bien establecidos para la generación de MDDCs. El primer método en comparación es un método tradicional bien establecida para la generación de MDDCs mediante la explotación de la capacidad de los monocitos para adherirse al vidrio o de plástico (método de adherencia) 21,22,27. El método de adherencia es rápido y rentable, y no requiere el uso de equipos complejos. Sin embargo, algunas desventajas de este proceso incluyen la contaminación de linfocitos, baja flexibilidad, monocitos transitoria 22,30,31 manipulación. El segundo método alternativo comparación es el aislamiento magnético de monocitos de células totales mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando un kit de monocitos enriquecimiento humano 26, que está diseñado para aislar los monocitos de PBMC por selección negativa. La ventaja de este método es que el aislamiento de las células no deseadasse etiquetan y se separó usando un imán, mientras que las células diana se vierten libremente fuera en un nuevo tubo sin la necesidad de columnas y sin orientación directamente las células con anticuerpos. Independientemente del método de aislamiento de monocitos (adherente frente a la separación magnética), después de que ambos procedimientos, uno de los pasos críticos dentro del protocolo es la estimulación in vitro de monocitos con granulocitos macrófagos factor estimulante de colonias (GM-CSF) y la interleucina-4 ( IL-4), que son necesarios para generar MDDCs. Este es un protocolo común y bien establecido para generar MDDCs a partir de células mononucleares de sangre sin comprometer la captura de antígeno y característica de capacidad de procesamiento de MDDCs inmaduros 32. Una de las principales limitaciones de las técnicas comúnmente utilizadas para la generación in vitro de las DC es el bajo rendimiento de las células precursoras tales como los monocitos. Como se informó anteriormente, monocitos aislados mediante el método de la adhesión representaron aproximadamente el 6,2 por ciento del total de PBMC, mientras que los monocitos aislados por separación magnética representaba hasta un 25 por ciento de las PBMC. Según la literatura, los rangos para el recuento diferencial de glóbulos blancos en adultos normales para los monocitos es de 2 - 10% 31 mientras que los DC solamente constituyen 0,1 a 1% de las células mononucleares de sangre total 20. Por lo tanto, el alto rendimiento de los monocitos (~ 25%), obtenido después del aislamiento magnético podría ser debido a la impureza de la población de células y la falta de anticuerpo y / o partículas magnéticas de unión a células no deseadas.
Para lograr un alto rendimiento y pureza de los monocitos aislados, todos los pasos críticos en el protocolo deben seguir cuidadosamente. Durante el aislamiento de PBMC de la sangre mediante centrifugación en gradiente de densidad estándar, hay algunos pasos críticos. En primer lugar, el pipeteado y cuidadosamente capas de sangre sobre solución de gradiente de densidad en 50 ml tubos de centrífuga es un paso que requiere la práctica desde el pipeteado de dureza puede causar la mezcla de esta solución y la sangre,que puede conducir a una débil capa de PBMC que es difícil de aislar, o puede dar lugar a la mezcla completa de las células rojas de la sangre con PBMCs. En este paso, es importante para mantener un flujo constante y relativamente lento de pipeteado tener una capa bien definida de la sangre y una capa de PBMC distinta. En segundo lugar, la centrifugación en la siguiente etapa con una aceleración y desaceleración 1 0 es muy crítico. Si estos valores no se utilizan para la primera etapa de centrifugación, que dará lugar a la mezcla de la sangre con la solución de gradiente de densidad de manera irregular y no se separará las PBMCs del resto de los componentes de la sangre. En tercer lugar, es importante incubar los PBMCs con amonio-cloruro y potasio (ACK) de tampón de lisis para no mayor que el tiempo optimizado (10 - 15 min), ya que de incubación más largo con ACK puede conducir a la reducción de las PBMCs viables junto con las células rojas de la sangre . Además, también es importante para llevar a cabo los lavados con PBS después de ACK de incubación. Sin embargo, si las células rojas de la sangre no se lisan con la primeraACK paso y que todavía siguen apareciendo después de los lavados, otra ronda de lisis ACK es muy recomendable.
Después del aislamiento de las células blancas de la sangre, hay algunos pasos críticos a tener en cuenta al realizar el método para generar la adhesión de monocitos. En primer lugar, lavando los linfocitos flotantes después de dos horas de PBMCs de incubación es muy importante ya que la presencia de linfocitos flotantes puede causar menos monocitos se adhieran y también puede resultar en una menor pureza MDDC. Aunque estas etapas de lavado son críticos, y el lavado excesivo dura (más de lo recomendado, es decir, dos veces) puede causar el lavado de los monocitos adherentes demasiado, lo que resulta en un rendimiento menor de los monocitos. En segundo lugar, la incubación de las células con medio completo y las citocinas es crítico ya que las citoquinas son responsables de la diferenciación de los monocitos en MDDCs. En adición, el cambio de los medios de comunicación y la reposición de las citoquinas cada 48 horas es importante para la diferenciación y la supervivencia de las células. Si bien el cambio de los medios de comunicación, sino que también es crucial para salvar las MDDCs flotantes y devolverlos de nuevo en la cultura, junto con medio fresco y citoquinas, ya que hay algunos MDDCs que pueden desprenderse de la superficie durante el proceso de diferenciación. También importante para asegurarse de que los monocitos se siembran a la concentración recomendada, unidos y muy juntas, ya que necesitan las células para el contacto celular con el fin de crecer. Al realizar el método de separación magnética para generar monocitos, hay algunos pasos críticos en el fin de obtener un buen rendimiento y alta pureza de los monocitos. En primer lugar, es crítico para mantener la concentración de células recomendado por el fabricante. También es importante que no perturbe el tubo de poliestireno cuando se coloca en el imán, ya que puede conducir a menor rendimiento y menor pureza. Tal como se presenta anteriormente, esta técnica conduce a un rendimiento significativamente mayor de monocitos (Figura 1) en comparación con el método de la adherencia, que puede estar relacionada con la presencia de otro cells. Además, cuando las células se caracterizaron mediante citometría de flujo, el método magnético muestra un mayor porcentaje de células positivas dobles (+ CD11c / CD14 +), que puede correlacionarse con la presencia de otras células o también puede ser debido a la presencia de diferentes etapas de MDDC diferenciación.
Otro aspecto importante de la generación de MDDC in vitro sin tener en cuenta el rendimiento y la pureza es la capacidad de generar MDDCs viables y proliferativas. El presente estudio proporciona evidencia para demostrar que ambos métodos de purificación de inducir la proliferación de MDDCs (Figura 3) como se muestra por el aumento de la actividad metabólica celular durante siete días en cultivo. Además, la generación de MDDCs a partir de monocitos purificados por separación magnética mostró una tasa significativamente mayor de proliferación en comparación con MDDCs generadas a partir de monocitos purificados por adherencia (Figura 3). Estos resultados están de acuerdo con la literatura anterior que demuestra que generation de las DC a partir de células CD34 + es un proceso de proliferación debido a la presencia de los progenitores de DC proliferativas en la sangre humana 27, 33. Sin embargo, hay hallazgos controvertidos que demuestran que los monocitos también pueden diferenciarse en los países en desarrollo sin ninguna evidencia de proliferación 34,35. Es importante señalar que existe una gran controversia sobre la generación in vitro de los países en desarrollo y los países en desarrollo con respecto a si se generan a partir de precursores proliferantes o de la diferenciación de los monocitos. Por ejemplo, la producción in vitro de DC a partir de células de sangre periférica adherentes se ha demostrado para enriquecer también para las células progenitoras que son capaces de proliferación después de la exposición a GM-CSF 27 y también hay evidencia que demuestra que el rendimiento de las CD deriva en la presencia de GM-CSF e IL-4 no pueden ampliarse más allá del número de monocitos a partir de 33. En general, el presente estudio demuestra un aumento de la proliferación de monocytic células en cultivo que por siete días resultan en una población total de MDDCs con> 70% CD11c + fenotipo (adherencia = 72% ± 11 frente magnética = 79% ± 19). Es importante señalar que cuando se llevó a cabo más análisis fenotípico, aunque no significativa, los monocitos aislados mediante el método de separación magnética resultaron en MDDCs con un fenotipo positivo superior doble (adherencia = 49% ± 7 CD11c + / CD14 + en comparación con magnético = 73% ± 15 + CD11c / CD14 +), mientras que los monocitos aislados mediante adhesión resultaron en MDDCs con un fenotipo más alta sola positivo (adherencia = 23% ± 7 CD11c + / CD14- frente magnética = 6% ± 7 CD11c + / CD14-). MDDCs con un fenotipo positivo doble superior (CD11c + / CD14 +) pueden estar bajo las primeras etapas de diferenciación, mientras que MDDCs con un fenotipo único positivo superior pueden estar bajo las últimas etapas de diferenciación.
En resumen, este estudio proporciona evidencia para apoyar que la selección negativa procedur separación magnéticae aislar monocitos genera el mayor rendimiento de monocitos con diferencias significativas en la viabilidad de monocitos en comparación con los monocitos aislados por el método de adherencia. A su vez, después de siete días, los monocitos aislados por separación magnética diferencian en MDDCs con significativamente mayor capacidad de proliferación y una mayor cantidad de células que expresan doble positivo (+ CD11c / CD14 +) fenotipo sin afectar MDDC viabilidad. Al comparar los dos métodos, los resultados han demostrado la capacidad de ambas técnicas para generar simultáneamente monocitos que son capaces de proliferar (Figura 3) y la diferenciación (Figura 4) en CD11c + MDDCs después de siete días en cultivo, ya que ambos métodos produjeron> 70% CD11c + MDDCs . Sin embargo, un análisis más detallado mirando marcadores de maduración puede ser útil para caracterizar completamente la población funcional MDDC. En conclusión, ambos métodos son alternativas ventajosas para el aislamiento de CD11c + MDDCs y provide un rendimiento adecuado para aplicaciones de investigación y puede incluso ser útil para aplicaciones clínicas futuras. El laboratorio se centra actualmente en la generación de MDDCs para estudiar los efectos del abuso de alcohol y otras sustancias de abuso en el sistema inmune innato, en particular la capacidad de estas sustancias para modificar el fenotipo y la función MDDC. Por lo tanto, el presente estudio proporcionará una línea de base de la caracterización MDDC y mejorar la capacidad de continuar con la experimentación adicional con el fin de dilucidar los mecanismos moleculares que median la función de las células dendríticas derivadas de monocitos en el contexto del abuso de sustancias.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at RT |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
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