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Immunology and Infection

इमेजिंग से फ्लो द्वारा मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं की विशेषता: दो Monocyte अलगाव प्रोटोकॉल के बीच एक तुलना

Published: October 18, 2016 doi: 10.3791/54296
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

Introduction

वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के आवश्यक मध्यस्थों हैं। वे प्राथमिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित और प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति के विकास की सुविधा के लिए कार्य करते हैं। इन कोशिकाओं प्रतिजन कब्जा, प्रवास और टी सेल उत्तेजना के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार हैं और इसलिए पेशेवर के रूप में प्रतिजन कोशिकाओं (APCs) 1 डीसी की .Manipulation अलग इलाज के लिए अनुसंधान के क्षेत्रों की एक विस्तृत विविधता में और नैदानिक सेटिंग में उपयोग किया जा सकता है के लिए भेजा जाता है ऐसे एचआईवी 6.7, कैंसर 8 के रूप में भड़काऊ रोगों, स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों 9, और एलर्जी प्रतिक्रियाओं 10। डीसी भी इस तरह के अल्कोहल निर्भरता 11-14, नशीली दवाओं पर निर्भरता 13,15, और एचआईवी संक्रमण और मादक द्रव्यों के सेवन 16-19 के संयोजन के साथ जुड़े लोगों के रूप में अज्ञात तंत्र और रास्ते हल करने के लिए मादक द्रव्यों के सेवन अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। ये चल रही पढ़ाई और भविष्य के अनुसंधान अध्ययन मैंn इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में अनुसंधान के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण डीसी के इन विट्रो पीढ़ी में बनाते हैं। कुल रक्त कोशिकाओं mononuclear 20 का 1% - हालांकि, वहाँ मानव रक्त से डीसी को अलग रूप में वे केवल 0.1 गठन के साथ जुड़े कई कठिनाइयों कर रहे हैं।

तिथि करने के लिए, डीसी में इन विट्रो की पीढ़ी के लिए अच्छी तरह से स्थापित तरीकों में से कुछ ऐसे चुंबकीय सक्रिय सेल 22 छँटाई, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई के रूप में monocytes 21,22 की प्लास्टिक या कांच पालन, घनत्व ढाल centrifugation 23, विशिष्ट मार्कर आधारित जुदाई के होते हैं 24, dextran लेपित चुंबकीय नैनोकणों 25, और पूरी तरह से स्वचालित नकारात्मक सेल के चयन का उपयोग कर 26 उच्च शुद्ध monocytes के तेजी से अलगाव का उपयोग कर CD14 + monocytes के सकारात्मक चयन। हालांकि, चुनाव का सबसे अच्छा तरीका विवादास्पद बना हुआ है। इसलिए, डीसी पीढ़ी की तकनीक में सुधार के लिए कई तरीके जिसमें विकसित किया गया हैइन कोशिकाओं की शुद्धता बहुत शुद्ध CD34 + पूर्वज कोशिकाओं और monocytes परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs), 27 से पृथक से भेदभाव से बढ़ाया जा सकता है। प्रायर उल्लेख किया है, monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (MDDCs) पैदा करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और लोकप्रिय तरीका कांच या प्लास्टिक (पालन विधि) 21,22,27 का पालन करने के monocytes की क्षमता का पता लगाने के लिए है। पालन ​​विधि एक तेजी से और सीधा तरीका है कि जटिल उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, इस प्रक्रिया के कुछ नुकसान लिम्फोसाइट संदूषण, कम लचीलापन, और monocyte क्षणिक हेरफेर 28 में शामिल हैं। पालन विधि करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका विशेष रूप से एक मानव monocyte संवर्धन किट है, जो नकारात्मक चयन 26 से PBMCs से monocytes को अलग-थलग करने के लिए बनाया गया है के उपयोग के साथ, कुल PBMCs से monocytes के चुंबकीय अलगाव है। इस प्रक्रिया के दौरान, अवांछित कोशिकाओं tetrameric के साथ हटाने के लिए लक्षित कर रहे हैंएंटीबॉडी परिसरों और dextran लेपित चुंबकीय कणों। इस अलगाव विधि का लाभ यह है कि अवांछित लेबल की कोशिकाओं एक चुंबक का उपयोग करते समय लक्ष्य कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से स्तंभों के लिए आवश्यकता के बिना एक नया ट्यूब में बंद डाला जा सकता है अलग हो रहे हैं। तिथि करने के लिए, विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कि अद्वितीय सेल आबादी लेबल कर सकते हैं की उपलब्धता के साथ, चुंबकीय जुदाई तकनीक बस नहीं एक अतिरिक्त तरीका है, लेकिन इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में दुर्लभ कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक जरूरत बन गया है। उदाहरण के लिए, इस तरह के चुंबकीय सेल के रूप में तकनीक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समचुंबक एमएसीएस-नैनोकणों के साथ छँटाई अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों 22,29 के लिए नए दृष्टिकोण के विकास में मदद की है। इसके अलावा, एककेंद्रकश्वेतकोशिका पालन और एमएसीएस प्रौद्योगिकी तरीकों से डीसी पीढ़ी की तुलना में हाल के अनुसंधान अध्ययन अलग monocytes 22,30 एमएसीएस का उपयोग कर एक उच्च डीसी शुद्धता और व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है।

वर्तमान अध्ययन प्रस्तुतएक वाणिज्यिक मानव monocyte संवर्धन किट का उपयोग कर 1) पालन द्वारा एककेंद्रकश्वेतकोशिका अलगाव और 2) एककेंद्रकश्वेतकोशिका अलगाव नकारात्मक सेलेक्शन: monocytes से मानव डीसी की पीढ़ी के लिए दो तरीके PBMCs से अलग के बीच तुलना। इस अध्ययन में यह सबूत है कि monocytes को अलग-थलग करने के लिए नकारात्मक चयन चुंबकीय जुदाई प्रक्रिया एककेंद्रकश्वेतकोशिका व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर के साथ monocytes के सबसे अधिक उपज उत्पन्न करता है जब पालन विधि से अलग monocytes के साथ तुलना में दिखाने के लिए प्रदान करता है। बदले में, सात दिनों के बाद, चुंबकीय जुदाई से अलग monocytes काफी अधिक proliferative क्षमता और डबल सकारात्मक (CD11c + / CD14 +) phenotype व्यक्त कोशिकाओं की उच्च राशि के साथ MDDCs में MDDC व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना भेदभाव। कुल मिलाकर, वर्तमान अध्ययन के बाद से यह दोनों तकनीकों की क्षमता एक साथ monocytes कि proliferating और CD11c में फर्क करने में सक्षम हैं उत्पन्न करने के लिए यह दर्शाता है पिछले अध्ययनों ऊपर संदर्भित से अलग है +MDDCs (> 70%) संस्कृति में सात दिनों के बाद उनकी व्यवहार्यता समझौता किए बिना। इसके अलावा, मौजूदा दृष्टिकोण इमेजिंग से फ्लो द्वारा विभिन्न CD11c / CD14 MDDCs आबादी के पहली बार लक्षण वर्णन के लिए प्रदान करता है।

सारांश में, के बाद से DCs एक केन्द्र इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में अनुसंधान के बारे में भूमिका निभाते हैं, विभिन्न मापदंडों को ध्यान में जब विचार है कि वे कैसे प्राप्त कर रहे हैं और क्या तरीके इन विट्रो में अलग-थलग करने और उन्हें संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है लिया जाना चाहिए। इसलिए, इस अध्ययन एककेंद्रकश्वेतकोशिका अलगाव की दो अलग अलग तरीकों और कैसे इन तरीकों विभिन्न एककेंद्रकश्वेतकोशिका व्यवहार्यता और उपज को प्रभावित करने के अंत में वृक्ष के समान सेल व्यवहार्यता, प्रसार, और phenotype को प्रभावित पर अंतर्दृष्टि प्रदान करना है। इन निष्कर्षों इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र के लिए काफी योगदान होगा और डीसी अलगाव, शुद्धि, और लक्षण की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करेगा।

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Protocol

कुल मिलाकर मानव रक्त अध्ययनों की समीक्षा की और संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) एफआईयू, आईआरबी प्रोटोकॉल अनुमोदन # आईआरबी-13-0440 के द्वारा अनुमोदित किया गया है। मानव leukopaks मियामी, फ्लोरिडा में समुदाय ब्लड बैंक से खरीदे गए थे।

स्टैंडर्ड घनत्व ढाल तकनीक द्वारा PBMCs की 1. अलगाव

  1. एक T75 फ्लास्क में 1x फॉस्फेट बफर खारा के साथ खून की 1 कमजोर पड़ने: एक 1 प्रदर्शन करना।
  2. पिपेट 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में घनत्व ढाल समाधान के 15 मिलीग्राम और ध्यान से परत - इस ढाल से ज्यादा पतला खून का (25 से 30 मिलीग्राम / ट्यूब)।
  3. 1 के त्वरण और 0 की मंदी के साथ 1,200 XG पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  4. centrifugation के बाद, इंटरफेस परत (श्वेत रक्त कोशिकाओं) एक नया 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा करने और पीबीएस में कोशिकाओं को दो बार धो (1,080 XG पर 3 मिनट)। हर बार सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  5. अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम lysing (एसीके) बफर साथ कोशिकाओं का इलाज (लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए)। बफर के और 10 मिलीलीटर जोड़ें4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए cubate।
  6. कोशिकाओं में दो बार 1,080 XG पर 3 मिनट के लिए, पीबीएस के साथ धोने सेंट्रीफ्यूज और हर बार सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  7. गोली बचाओ, जो PBMCs में शामिल होंगे।
  8. पसंद का एककेंद्रकश्वेतकोशिका शोधन विधि के साथ आगे बढ़ें।

पालन ​​विधि द्वारा 2. Monocyte शोधन

  1. पूरा सेल संस्कृति एल glutamine (300 मिलीग्राम / एमएल) और युक्त मध्यम तैयार पेनिसिलिन (50 यू / एमएल) -streptomycin (50 माइक्रोग्राम / एमएल) और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक।
  2. PBMCs उन्हें एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर पूरा माध्यम के 10 मिलीलीटर प्रति 5 एक्स 10 7 कोशिकाओं की एकाग्रता में एक T75 फ्लास्क में संवर्धन द्वारा लगभग 2 घंटे के लिए पालन करने के लिए अनुमति दें।
  3. ऊष्मायन के बाद, संस्कृति कुप्पी से गैर पक्षपाती चल कोशिकाओं को हटाने और धीरे पीबीएस के साथ दो बार पक्षपाती कोशिकाओं को धो लें।
  4. पूरा सेल संस्कृति के माध्यम से मानव granulocyte-macr के 2 μl / एमएल के साथ पूरक में पक्षपाती कोशिकाओं को सेतेophage कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) और इंटरल्यूकिन 4 (आईएल 4) 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक शेयर एकाग्रता में संग्रहीत।
  5. मध्यम के आधे बदलें और साइटोकिन्स की भरपाई हर 48 घंटा।
  6. MDDCs में monocytes के भेदभाव के लिए 7 दिन - 5 की अनुमति दें।

3. चुंबकीय जुदाई विधि द्वारा Monocyte शोधन

  1. मानक घनत्व ढाल तकनीक से PBMCs लीजिए, एक 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में डाल देना और कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में पीबीएस बफर में फिर से निलंबित।
  2. मानव monocyte संवर्धन कॉकटेल 50 μl / एमएल कोशिकाओं का उपयोग जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. ऊष्मायन के बाद, 50 μl / एमएल कोशिकाओं का उपयोग चुंबकीय कणों को जोड़ने अच्छा मिश्रण है और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. पीबीएस बफर जोड़कर 2.5 मिलीलीटर की कुल मात्रा को सेल निलंबन लाओ 2 नीचे से ऊपर pipetting और मिश्रण अच्छी तरह से - 3 बार।
  5. चुंबकीय डिवाइस में एक टोपी के बिना polystyrene ट्यूब प्लेस और 2 के लिए आरटी पर अलग सेट।5 मिनट।
  6. ऊष्मायन के बाद और एक सतत गति में, चुंबक लेने के लिए और एक साफ 50 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब में वांछित शुद्ध एककेंद्रकश्वेतकोशिका अंश डालना।
  7. पूरा सेल संस्कृति के माध्यम से मानव granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) के 2 μl / एमएल के साथ पूरक और 4 इंटरल्यूकिन में पक्षपाती कोशिकाओं को सेते (आईएल 4) 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक शेयर एकाग्रता में संग्रहीत।
  8. हर 48 घंटा, मध्यम के आधे बदलने के 5 मिनट के लिए 1,080 XG पर नीचे स्पिन और फिर से निलंबित नए मीडिया (CRPMI) और साइटोकिन्स के साथ गोली।
  9. MDDCs में monocytes के भेदभाव के लिए 7 दिन - 5 की अनुमति दें।

4. Trypan नीले अपवर्जन व्यवहार्यता परख

नोट: सेल उपज और PBMCs, monocytes, और MDDCs की व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए इस तकनीक का प्रयोग करें।

  1. मानक trypsin-EDTA का उपयोग और बोतल और सेल गोली पीबीएस का उपयोग करने का washes प्रदर्शन हार्वेस्ट कोशिकाओं। गोली के आकार पर निर्भर करता है, फिर सेपीबीएस के 5 से 10 मिलीलीटर में निलंबित गोली भंग करने के लिए।
  2. पतला सेल गोली के साथ trypan नीले अभिकर्मक के 1 कमजोर पड़ने: एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में, एक 1 प्रदर्शन करते हैं।
  3. इस मिश्रण से, विभाज्य 10 एक सेल में μl स्लाइड गिनती और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर परिणाम पढ़ा। एक स्वचालित सेल काउंटर उपलब्ध नहीं है, तो एक समान कोशिकाओं की संख्या एक hemocytometer या एक मैनुअल काउंटर का उपयोग संभव है।

5. MTT परख

  1. पूरा मीडिया के 4 एक्स 10 4/100 μl की एकाग्रता में अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक में कम से प्लेट कोशिकाओं। कोशिकाओं संस्कृति को समायोजित करने के लिए 24 घंटा की अनुमति दें।
  2. सेते हैं और क्रमश: 0 (0 दिन), 36 (3 दिन) और 84 (दिन 7) घंटा पर रीडिंग प्रदर्शन करते हैं।
  3. वांछित ऊष्मायन के पूरा होने पर, मीडिया को हटाने और अकेले पीबीएस के 100 μl के साथ बदलें।
  4. तैयार 3- (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -2,5-diphenyl tetrazolium ब्रोमाइड समाधान (MTT) (5 मिलीग्राम / एमएल) dimeth के 10 मिलीलीटर जोड़करYL sulfoxide (DMSO) सोडियम सल्फेट dodecyl की 1 ग्राम (एसडीएस) करने के लिए।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से MTT समाधान के 10 μl (5 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें और 2 अतिरिक्त घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. ऊष्मायन के बाद, supernatants जो पीबीएस और अपरिवर्तित MTT मिश्रण (पीले रंग समाधान) होते हैं हटा दें।
  7. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एसडीएस DMSO के समाधान के 100 μl जोड़ें और एक अतिरिक्त घंटे के लिए सेते हैं।
  8. 540 एक microplate रीडर का उपयोग कर एनएम पर absorbance पढ़ें।

6. सेल सतह धुंधला विश्लेषण इमेजिंग से फ्लो द्वारा

  1. शुद्ध monocytes से भेदभाव के 7 दिनों के बाद, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब की उचित संख्या में monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं के 1x10 6 सेल aliquots बांटना।
  2. (एचआई) मानव सीरम निष्क्रिय गर्मी के 50 μl का उपयोग कर अवरुद्ध कोशिकाओं द्वारा कोशिका की सतह धुंधला शुरू, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. ऊष्मायन के बाद, 5 मिनट के लिए 720 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  4. पेले सेल के लिएटी, संबंधित fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी (जैसे, विरोधी CD11c या विरोधी CD14) जोड़ने के लिए और 20 मिनट के प्रकाश से सुरक्षित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। अलग नलियों में, एकल fluorochrome से सना हुआ नमूने / एमएल तैयार) के बाद से वे मुआवजे के लिए आवश्यक हैं।
  5. ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं में दो बार हर बार पीबीएस बफर और सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर में 720 XG पर 5 मिनट के लिए धो लें।
  6. प्रकाश से सुरक्षित रखते हुए कोशिकाओं, प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए कोशिकाओं / 100 μl की एकाग्रता में पीबीएस बफर में फिर से निलंबित।
  7. व्यवहार्य कोशिकाओं पर फाटक के लिए आदेश में, एकल कोशिका इमेजिंग प्रवाह निर्माता के निर्देशों के अनुसार साधन cytometry पर कोशिकाओं को प्राप्त करने से पहले प्रत्येक ट्यूब DAPI की 1 μl जोड़ें।

7. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. इनपुट एक स्प्रेडशीट में सभी डेटा।
  2. छात्र की टी परीक्षण और / या एक तरह से उचित रूप से एनोवा का उपयोग कर परिणाम की तुलना करें।
  3. सांख्यिकीय महत्वपूर्ण पी यदि <0.05 होना करने के लिए मतभेदों पर विचार करें।

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Representative Results

चुंबकीय जुदाई से Monocyte उपज पालन विधि द्वारा Monocyte उपज के लिए बोली की तुलना में है

PBMCs और monocytes की जुदाई के अलगाव के दिन पर trypan नीले अपवर्जन विधि द्वारा चित्रा 1 प्रदर्शन PBMC और monocyte कोशिकाओं की गिनती में प्रस्तुत डाटा। औसत पर, पालन विधि से अलग monocytes कुल PBMCs का लगभग 6.2 प्रतिशत के लिए जिम्मेदार है, जबकि चुंबकीय जुदाई से अलग monocytes PBMCs के 25 प्रतिशत के लिए जिम्मेदार है। सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला है कि चुंबकीय जुदाई से मिले monocytes का प्रतिशत काफी अधिक (≥ 4 गुना) थे। डेटा के रूप में मतलब ± कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एसडी व्यक्त कर रहे हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण के छात्र टी -Test एककेंद्रकश्वेतकोशिका उपज का एक महत्वपूर्ण अंतर से पता चला जब दोनों तरीकों (0.0005 ≤ पी) की तुलना का उपयोग कर।

_content "fo: = रखने together.within-पेज" 1 "> Monocyte अलगाव पालन द्वारा और चुंबकीय जुदाई से Monocyte व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करते

दो अलग अलग ऊपर वर्णित तकनीकों के द्वारा एककेंद्रकश्वेतकोशिका अलगाव के बाद, व्यवहार्यता assays कि यह सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों साइटोटोक्सिक और कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं थे प्रदर्शन किया गया। डेटा या तो पालन विधि द्वारा या चुंबकीय जुदाई से पृथक रूप से व्यवहार्य monocytes के प्रतिशत का औसत आंकड़ा 2 प्रदर्शन में प्रस्तुत किया। व्यवहार्य कोशिकाओं अलगाव के दिन पर trypan नीले अपवर्जन विधि का उपयोग गिना रहे थे। दो अलगाव तरीकों के बीच monocytes के मुकाबले प्रतिशत व्यवहार्यता का पता चला है कि दोनों समूहों के बीच अंतर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं था। इसके अतिरिक्त, पालन द्वारा पृथक रूप से व्यवहार्य monocytes के प्रतिशत की औसत ± 1.66 91.75% थी और व्यवहार्य monocytes के प्रतिशत की औसत magn से अलगetic जुदाई ± 2.75 87.4% थी। ये व्यवहार्यता डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मूल्यांकन किया गया। सांख्यिकीय महत्व छात्र की टी परीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किया गया था।

Monocytes से ली गई कोशिकाओं चुंबकीय जुदाई से पृथक सेल प्रसार में उल्लेखनीय वृद्धि Monocytes से ली गई कोशिकाओं पालन विधि द्वारा अधिग्रहीत की तुलना में दिखाएँ

MTT सेल प्रसार को मापने के लिए एक वर्णमिति परख के रूप में इस्तेमाल किया गया था। जीवित कोशिकाओं में, MTT के पीले रंग बैंगनी tetrazole formazan, जो आसानी से एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मापा जाता है के लिए कम है। 0.22 ± 0.02 बनाम चुंबकीय विधि: 0.38 ± 0 चित्रा 3 में प्रस्तुत डाटा कि एककेंद्रकश्वेतकोशिका अलगाव के दोनों प्रक्रियाओं को 7 दिन की अवधि में उच्च सेल प्रसार करने के लिए नेतृत्व के रूप में एक 0 दिन में absorbance में वृद्धि हुई (पालन विधि द्वारा मापा का प्रदर्शन.02), दिन 3 (पालन विधि: 0.28 ± 0.02, चुंबकीय विधि: 0.55 ± 0.05) और दिन 7 (पालन विधि: 0.36 ± 0.01, चुंबकीय = 0.66 ± 0.006)। हालांकि, XTT परख के विपरीत (डेटा) नहीं दिखाया, MTT परख एक महत्वपूर्ण दिन 0 (पी = 0.003), दिन 3 पर पालन विधि द्वारा अधिग्रहीत monocytes से MDDCs की तुलना में चुंबकीय जुदाई से अलग monocytes से MDDCs की सेल प्रसार में वृद्धि का पता चला (पी = 0.006), और दिन 7 (पी = 0.002)। सेल प्रसार भी 0 दिन और 3 (पी = 0.003) के बीच काफी अलग होना पाया गया था, और 0 दिन और 7 (पी <0.001) monocytes से MDDCs के समूह के भीतर के बीच चुंबकीय जुदाई के माध्यम से शुद्ध। इसके अलावा, एक महत्वपूर्ण आसंजन (पी = 0.008) द्वारा शुद्ध monocytes से दिन में 0 और MDDCs में 7 दिन के बीच सेल प्रसार में अंतर पाया गया है। MTT परख तीन अलग-अलग प्रयोगों से प्राप्त कर लिया MDDCs का उपयोग किया गया था। सांख्यिकीय महत्व एनोवा और छात्र की टी परीक्षण, पी का उपयोग कर 0.05 ≤ डब्ल्यू निर्धारित किया गया थाके रूप में महत्वपूर्ण माना जाता है, और पी मूल्यों ग्राफ पर नोट कर रहे हैं, जब तक कि कोई सांख्यिकीय महत्व मिला था।

CD11c और CD14 कोशिका की सतह धुंधला द्वारा MDDCs की विशेषता

आईएल 4 और जीएम-सीएसएफ के साथ सात दिनों के लिए monocytes संवर्धन के बाद, MDDCs पालन और चुंबकीय अलगाव तरीकों से अलग monocytes से प्राप्त चित्रा 4 में विशेषता थे। लक्षण वर्णन दोनों तरीकों में कम ही CD14 + / CD11c- phenotype या विशुद्ध रूप से monocytic आबादी का पता चला, पालन ​​= 1 ± 0.0 और उच्च कुल CD11c + phenotype, पालन = 72% ± 1.0 बनाम चुंबकीय = 1%% ± 11 बनाम चुंबकीय = 79% ± 19. हालांकि, जब कुल CD14 + आबादी आगे विश्लेषण किया गया था, वहाँ के एक उच्च उपज था कोशिकाओं CD11c और चुंबकीय जुदाई CD11c और CD14 डबल सकारात्मक के एक उच्च संख्या देने के साथ दोनों तरीकों में CD14 के लिए डबल सकारात्मकजनसंख्या जब पालन विधि की तुलना में, पालन = 49% ± 7 बनाम चुंबकीय = 73% ± 15. हालांकि, वहाँ चुंबकीय जुदाई, CD11c सकारात्मक और नकारात्मक MDDCs की CD14 आबादी के माध्यम से डबल सकारात्मक phenotype के साथ MDDCs के एक उच्च उपज उच्च गया था पालन ​​विधि में; पालन = 23% ± बनाम चुंबकीय = 6% 7 ± 7. चित्रा 4 बी में, प्रत्येक व्यक्ति के मार्कर का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) गेटेड जनसंख्या में देखा और CD14 + जनसंख्या में CD14 के उच्च तीव्रता से पता चला रहे थे, दोनों के बराबर तीव्रता CD11c और CD14 डबल सकारात्मक जनसंख्या और CD11c + और CD14- आबादी में उच्च तीव्रता CD11c में। सारांश में, भले ही चुंबकीय अलगाव CD11c + / CD14 + कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत है, जो प्रारंभिक चरण भेदभाव MDDCs है कि अभी तक monocytic मार्कर (CD14) गिरा नहीं हो सकता है देता है, पालन विधि CD11c के एक उच्च प्रतिशत देता है + / CD14-, जो एक देर से मंच भेदभाव MDDC आबादी हो सकता है। addit मेंआयन, DAPI धुंधला व्यवहार्यता परिणामों की पुष्टि करने और यह सुनिश्चित करने के लिए लक्षण वर्णन लाइव MDDCs पर प्रदर्शन किया गया था प्रदर्शन किया गया था। DAPI नकारात्मक / जीवित कोशिकाओं के प्रतिशत (पालन = 76 ± बनाम चुंबकीय = 67 ± 1 7) नहीं दोनों तरीकों की पुष्टि संस्कृति में सात दिनों के बाद MDDCs की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करते दो तरीकों के बीच काफी अलग हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. Monocyte उपज चुंबकीय जुदाई से उच्चतर Monocyte उपज पालन विधि द्वारा की तुलना में। Monocytes के बारे में 6.2% पालन विधि का उपयोग करते समय ~ monocytes के 25% चुंबकीय जुदाई विधि का प्रयोग कर प्राप्त किया गया PBMCs से अलग थे। डेटा के रूप में मतलब ± कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एसडी व्यक्त कर रहे हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण के छात्र का उपयोग टी परीक्षण एककेंद्रकश्वेतकोशिका उपज का एक महत्वपूर्ण अंतर से पता चला जब दोनों तरीकों की तुलना(पी = 0 00005)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Monocyte अलगाव पालन द्वारा और चुंबकीय जुदाई से Monocyte व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करते। पालन द्वारा पृथक रूप से व्यवहार्य monocytes के प्रतिशत की औसत ± 1.66 91.75% थी और चुंबकीय जुदाई से पृथक रूप से व्यवहार्य monocytes के प्रतिशत का औसत था 87.4% ± 2.75। डेटा के रूप में मतलब ± एसडी कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत व्यक्त कर रहे हैं। कोई महत्वपूर्ण अंतर सेल व्यवहार्यता में मनाया गया था जब दोनों शुद्धि के तरीकों की तुलना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रकोष्ठों चुंबकीय जुदाई से पृथक Monocytes से व्युत्पन्न सेल प्रसार में उल्लेखनीय वृद्धि पालन विधि द्वारा Monocytes एक्वायर्ड से ली गई कोशिकाओं की तुलना में दिखाएँ। Absorbance में एक उल्लेखनीय वृद्धि दोनों दिन 3 और 7 दिन में दोनों तरीकों के लिए मनाया गया जब मूल्यों की तुलना इसके अलावा 0. दिन के अपने-अपने नियंत्रण के खिलाफ है, एनोवा और छात्र की टी-परीक्षण भी जब दोनों तरीकों (0.05 ≤ पी) की तुलना MTT तेज की absorbance में एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। डेटा के रूप में मतलब ± तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एसडी व्यक्त कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4. CD11c और CD14 सेल सतह धुंधला। ए) बार ग्राफ द्वारा MDDCs विभिन्न आबादी (% एकल कक्षों के बाहर gated) का प्रतिनिधित्व करने की विशेषता। सबसे पहले, DAPI- (जिंदा) कोशिकाओं की कुल एकल कक्षों से gated थे। फिर, CD14 + / CD11c-, CD11c +, CD11c + / CD14 + और CD11c + / CD14- DAPI- (जिंदा) आबादी से gated थे। CD11c + आबादी लेबल दोनों क्षेत्रों CD11c + / CD14 + और CD11c + / CD14-। बी) कोशिकाओं के हर उप-जनसंख्या। सी) कोशिकाओं के प्रतिनिधि तितर बितर भूखंडों में मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) दोनों CD11c और CD14 के लिए मूल्यों को दिखा प्रतिनिधि रेखांकन का योग है CD11c एपीसी और CD14-APCcy7 दोनों चुंबकीय और पालन के तरीकों के लिए DAPI नकारात्मक (जिंदा) सेल की आबादी पर गेटेड के साथ। एकल कक्षों के प्रतिनिधि छवि गैलरी (तितर बितर भूखंडों में नीले रंग में चयनित) कोशिकाओं में से प्रत्येक उप जनसंख्या से संबंधित, CD11c + / CD14- (नारंगी में गेटेड), CD11c + / CD14 + (गेटेड), और CD14 + लाल रंग में (बैंगनी में गेटेड)। एकल कक्षों की छवि गैलरी में, लाल रंग CD11c एपीसी के साथ लेबल और पीले रंग APCcy7 के साथ लेबल CD14 का प्रतिनिधित्व करता है प्रतिनिधित्व करता है। तितर बितर भूखंडों में, रंग आबादी फाटक के लिए चुना यादृच्छिक कर रहे हैं और वास्तविक सेल छवियों मेल नहीं खाते। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

अलग-थलग करने और मानव रक्त से MDDCs पैदा करने के नाम से जाना जाता कठिनाइयों के आधार पर, वर्तमान अध्ययन MDDCs की पीढ़ी के लिए दो अच्छी तरह से स्थापित तरीकों की एक व्यापक तुलना प्रदान करने के उद्देश्य से। पहली विधि की तुलना में कांच या प्लास्टिक (पालन विधि) 21,22,27 का पालन करने के monocytes की क्षमता का शोषण करके MDDCs पैदा करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित पारंपरिक विधि है। पालन ​​विधि तेजी से और लागत प्रभावी है, और जटिल उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, इस प्रक्रिया के कुछ नुकसान लिम्फोसाइट संदूषण, कम लचीलापन, एककेंद्रकश्वेतकोशिका क्षणिक हेरफेर 22,30,31 शामिल हैं। दूसरी वैकल्पिक विधि की तुलना में कुल परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) एक मानव monocyte संवर्धन किट 26 है, जो नकारात्मक सेलेक्शन PBMCs से monocytes को अलग-थलग करने के लिए बनाया गया है का उपयोग करने से monocytes के चुंबकीय अलगाव है। इस अलगाव विधि का लाभ यह है कि अवांछित कोशिकाओं हैलेबल और जब तक लक्ष्य कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से स्तंभों की और सीधे एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को निशाना बनाने के बिना आवश्यकता के बिना एक नया ट्यूब में बंद डाल रहे हैं एक चुंबक का उपयोग कर अलग हो रहे हैं। एककेंद्रकश्वेतकोशिका अलगाव विधि के बावजूद (बनाम चुंबकीय जुदाई पक्षपाती), दोनों प्रक्रियाओं के बाद, प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदमों में से एक granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक के साथ monocytes की इन विट्रो उत्तेजना है (जीएम-सीएसएफ) और इंटरल्यूकिन -4 ( आईएल 4), जो MDDCs उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैं। यह एक आम और अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल प्रतिजन कब्जा करने और अपरिपक्व MDDCs 32 की प्रसंस्करण क्षमता के लक्षण समझौता किए बिना रक्त कोशिकाओं mononuclear से MDDCs उत्पन्न करने के लिए है। तकनीक आमतौर पर डीसी की इन विट्रो पीढ़ी के लिए इस्तेमाल की प्रमुख सीमाओं में से एक के रूप में ऐसे monocytes अग्रदूत कोशिकाओं की कम उपज है। जैसा कि ऊपर की सूचना दी, पालन विधि से अलग monocytes कुल पी के लगभग 6.2 प्रतिशत के लिए जिम्मेदारबीएमसी, जबकि चुंबकीय जुदाई से अलग monocytes PBMCs के 25 प्रतिशत के लिए जिम्मेदार है। साहित्य के अनुसार, monocytes के लिए सामान्य वयस्कों में अंतर सफेद रक्त कोशिका गिनती के लिए पर्वतमाला 2 से है - कुल रक्त कोशिकाओं mononuclear 20 का 1% - 10% 31 जबकि डीसी केवल 0.1 गठन। इसलिए, monocytes के उच्च उपज (~ 25%) चुंबकीय अलगाव के बाद प्राप्त सेल की आबादी और एंटीबॉडी और / या चुंबकीय कण अवांछित कोशिकाओं के लिए बाध्य की कमी की अशुद्धता के कारण हो सकता है।

एक उच्च उपज और अलग monocytes की पवित्रता को प्राप्त करने के लिए, प्रोटोकॉल में सभी महत्वपूर्ण कदम सावधानी से पालन किया जाना चाहिए। मानक घनत्व ढाल centrifugation द्वारा खून से PBMCs के अलगाव के दौरान, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले, pipetting और 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में घनत्व ढाल समाधान पर खून का ध्यान लेयरिंग एक कदम है कि कठोरता से pipetting इस समाधान और रक्त का मिश्रण पैदा कर सकता है के बाद से अभ्यास की आवश्यकता है,जो एक कमजोर PBMC परत है कि अलग-थलग करने के लिए कठिन है करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, या यह PBMCs के साथ लाल रक्त कोशिकाओं की पूरी मिश्रण में परिणाम कर सकते हैं। इस चरण में, यह खून की एक अच्छी तरह से परिभाषित परत और एक अलग PBMC परत है pipetting की एक निरंतर और अपेक्षाकृत धीमी गति से प्रवाह बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, त्वरण और मंदी 1 0 के साथ अगले चरण में centrifugation बहुत महत्वपूर्ण है। इन सेटिंग्स पहले centrifugation कदम के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, यह अनिश्चित घनत्व ढाल समाधान के साथ रक्त का मिश्रण को बढ़ावा मिलेगा और रक्त घटकों के बाकी हिस्सों से PBMCs अलग नहीं होगा। तीसरा, यह अनुकूलित समय की तुलना में अब और नहीं के लिए अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम (एसीके) के साथ PBMCs बफर lysing सेते के लिए महत्वपूर्ण है - एसीके के साथ अब ऊष्मायन के बाद (10 से 15 मिनट) लाल रक्त कोशिकाओं के साथ साथ व्यवहार्य PBMCs की कमी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, यह भी एसीके ऊष्मायन के बाद पीबीएस washes बाहर ले जाने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, लाल रक्त कोशिकाओं के साथ पहली बार lysed नहीं कर रहे हैंएसीके कदम है और वे अभी भी washes के बाद प्रकट करने के लिए जारी है, एसीके lysing के दूसरे दौर के अत्यधिक की सिफारिश की है।

सफेद रक्त कोशिकाओं के अलगाव के बाद, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम है जब monocytes उत्पन्न करने के पालन विधि प्रदर्शन को ध्यान में रख रहे हैं। सबसे पहले, PBMCs ऊष्मायन के दो घंटे के बाद चल लिम्फोसाइट बंद धोने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि चल लिम्फोसाइट की उपस्थिति कम monocytes पालन करने के लिए पैदा कर सकता है और भी कम MDDC पवित्रता में परिणाम कर सकते हैं। हालांकि इन धोने कदम, महत्वपूर्ण अत्यधिक और कठोर धुलाई कर रहे हैं (अधिक की सिफारिश की तुलना में, यानी, दो बार) धोने बंद पक्षपाती monocytes भी पैदा कर सकता है, कम एककेंद्रकश्वेतकोशिका उपज में जिसके परिणामस्वरूप। दूसरा, पूरा मध्यम और साइटोकिन्स के साथ कोशिकाओं incubating महत्वपूर्ण है के बाद से साइटोकिन्स MDDCs में monocytes के भेदभाव के लिए जिम्मेदार हैं। इसके साथ - साथ, मीडिया बदल रहा है और साइटोकिन्स हर 48 घंटा भरपाई भेदभाव और कोशिकाओं के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है। मीडिया से बदल रहा है, यह भी चल MDDCs को बचाने और उन्हें वापस लौटने संस्कृति में ताजा मीडिया और साइटोकिन्स के साथ साथ के बाद से वहाँ कुछ MDDCs कि सतह से भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान अलग कर सकते हैं के लिए महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करें कि monocytes, की सिफारिश की एकाग्रता में वरीयता प्राप्त कर रहे जुड़ी है और क्योंकि वे विकसित करने के क्रम में सेल से संपर्क करने के लिए सेल की जरूरत निकट दूरी बनाने के लिए भी महत्वपूर्ण है। जब monocytes उत्पन्न करने के लिए चुंबकीय जुदाई विधि प्रदर्शन, वहाँ के लिए एक अच्छी उपज और monocytes के उच्च शुद्धता पाने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले, यह सेल एकाग्रता निर्माता से सिफारिश बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। यह भी महत्वपूर्ण है जब चुंबक में रखा polystyrene ट्यूब को परेशान नहीं करने के लिए, के रूप में यह कम पैदावार और कम शुद्धता को जन्म दे सकती है। जैसा कि ऊपर प्रस्तुत किया, इस तकनीक में काफी अधिक एककेंद्रकश्वेतकोशिका उपज (चित्रा 1) जब पालन विधि की तुलना में, जो अन्य ग की उपस्थिति के लिए संबंधित हो सकता है की ओर जाता हैएल। इसके अलावा, जब कोशिकाओं से फ्लो की विशेषता थे, चुंबकीय विधि डबल सकारात्मक कोशिकाओं (CD11c + / CD14 +) के एक उच्च प्रतिशत है, जो MDDC के विभिन्न चरणों की उपस्थिति के कारण अन्य कोशिकाओं की उपस्थिति के साथ संबंध स्थापित कर सकते हैं या यह भी हो सकता है पता चलता है भेदभाव।

इन विट्रो MDDC पीढ़ी उपज और पवित्रता की परवाह किए बिना का एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू व्यवहार्य और proliferative MDDCs उत्पन्न करने की क्षमता है। वर्तमान अध्ययन सबूत दिखाना है कि दोनों शुद्धि तरीकों MDDCs (चित्रा 3) के प्रसार के लिए प्रेरित के रूप में संस्कृति में सात दिनों के दौरान सेल चयापचय गतिविधि में वृद्धि के द्वारा दिखाया गया है। इसके अलावा, चुंबकीय जुदाई द्वारा शुद्ध monocytes से MDDCs की पीढ़ी के प्रसार का एक महत्वपूर्ण उच्च दर आसंजन (चित्रा 3) द्वारा शुद्ध monocytes से उत्पन्न MDDCs के लिए की तुलना से पता चला है। ये निष्कर्ष है कि जी का प्रदर्शन पिछले साहित्य के अनुसार कर रहेCD34 + कोशिकाओं से डीसी के eneration मानव रक्त 27, 33 में proliferative डीसी पूर्वज की उपस्थिति के कारण एक proliferative प्रक्रिया है। हालांकि, वहाँ विवादास्पद प्रदर्शन है कि monocytes भी प्रसार 34,35 के किसी भी सबूत के बिना डीसी में अंतर कर सकते निष्कर्ष हैं। वहाँ डीसी की इन विट्रो पीढ़ी के बारे में विवाद का एक बहुत है और के बारे में है कि क्या DCs proliferating व्यापारियों से या monocytes के भेदभाव से उत्पन्न कर रहे हैं कि यह कहना प्रासंगिक है। उदाहरण के लिए, इन विट्रो पक्षपाती परिधीय रक्त कोशिकाओं से डीसी का उत्पादन भी पूर्वज कोशिकाओं है कि जीएम-सीएसएफ 27 को प्रदर्शन के बाद प्रसार करने में सक्षम हैं और वहाँ भी सबूत प्रदर्शन है कि डीसी की उपज की उपस्थिति में ली गई है के लिए संतुष्ट करने के लिए दिखाया गया है जीएम- CSF और आईएल -4 monocytes 33 शुरू की संख्या से परे का विस्तार नहीं किया जा सकता। कुल मिलाकर, वर्तमान अध्ययन यह दर्शाता एक सोम के प्रसार में वृद्धि हुईसंस्कृति में ocytic कोशिकाओं है कि सात दिनों से> 70% CD11c + phenotype के साथ कुल MDDCs आबादी में परिणाम (पालन = 72% ± 11 बनाम चुंबकीय = 79% ± 19)। यह कहना है एक उच्च डबल सकारात्मक phenotype (पालन = 49% के साथ कि जब आगे प्ररूपी विश्लेषण किया गया था, हालांकि महत्वपूर्ण नहीं है, चुंबकीय जुदाई विधि द्वारा पृथक monocytes MDDCs में हुई ± 7 CD11c + / CD14 बनाम चुंबकीय = 73% + प्रासंगिक है ± 15 CD11c + / CD14 +) है, जबकि आसंजन से अलग monocytes एक उच्च एकल सकारात्मक phenotype (पालन = 23% ± 7 CD11c + / CD14- बनाम चुंबकीय = 6% ± 7 CD11c + / CD14-) के साथ MDDCs में हुई। एक उच्च डबल सकारात्मक phenotype (CD11c + / CD14 +) के साथ MDDCs भेदभाव के प्रारंभिक दौर के तहत हो सकता है एक उच्च एकल सकारात्मक phenotype के साथ MDDCs भेदभाव की देर चरणों के तहत हो सकता है।

सारांश में, इस अध्ययन सबूत है कि नकारात्मक चयन चुंबकीय जुदाई procedur समर्थन करने के लिए प्रदान करता हैई monocytes को अलग-थलग करने के लिए एककेंद्रकश्वेतकोशिका व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर के साथ monocytes के सबसे अधिक उपज उत्पन्न करता है जब पालन विधि से अलग monocytes के साथ तुलना में। बदले में, सात दिनों के बाद, चुंबकीय जुदाई से अलग monocytes काफी अधिक proliferative क्षमता और डबल सकारात्मक (CD11c + / CD14 +) phenotype व्यक्त कोशिकाओं की उच्च राशि के साथ MDDCs में MDDC व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना भेदभाव। जब दोनों तरीकों की तुलना, निष्कर्षों दोनों तकनीकों की क्षमता एक साथ monocytes के बाद से दोनों तरीकों झुकेंगे> 70% CD11c + MDDCs कि संस्कृति में सात दिनों के बाद CD11c + MDDCs में (चित्रा 3) proliferating और (चित्रा 4) फर्क करने में सक्षम हैं उत्पन्न करने के लिए प्रदर्शन किया है । हालांकि, आगे के विश्लेषण परिपक्वता मार्करों पर देख रहे हैं पूरी तरह कार्यात्मक MDDC आबादी को चिह्नित करने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है। अंत में, दोनों तरीकों CD11c + MDDCs और नीति के अलगाव के लिए लाभप्रद विकल्प हैंअनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए एक पर्याप्त उपज आईडीई और यहां तक ​​कि भविष्य नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है। प्रयोगशाला वर्तमान में MDDCs की पीढ़ी पर ध्यान दे रहा है, शराब सेवन और सहज प्रतिरक्षा प्रणाली पर दुरुपयोग की अन्य पदार्थों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से इन पदार्थों की क्षमता MDDC phenotype और समारोह को संशोधित करने के लिए। इसलिए, वर्तमान अध्ययन MDDC लक्षण वर्णन के एक आधारभूत प्रदान करते हैं और आदेश में मादक द्रव्यों के सेवन के संदर्भ में monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान सेल समारोह में मध्यस्थता आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए आगे प्रयोग के साथ आगे बढ़ना करने की क्षमता में वृद्धि होगी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-5442-03 Must be used at RT
Phosphate-buffered saline (PBS) Life Technologies 10010-023
ACK Lysing buffer Quality Biological 118-156-101
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240-062
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000-044
RoboSep buffer StemCell 20104
EasySep Human monocyte enrichment kit StemCell 19059
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0101
FITC-Dextran Sigma Aldrich FD4-100MG
Trypan blue stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Synergy 2 multi-mode reader Biotek 7131000
XTT Sodium salt bioreagent (XTT) Sigma Aldrich X4626-100MG
Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) Sigma Aldrich D8418-500ML
Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) Sigma Aldrich m5655-500MG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0302
Phenazine Methosulfate (DMSO) Sigma Aldrich P9626-1G
Inactivated (HI) Human Serum Chemicon S1-100ML
Accuri C6 Flow Cytometer BD Accuri 653119
FlowSight Amnis Flow Cytometer EMD Millipore 100300

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 116 मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं monocytes अलगाव की तकनीक प्रतिरक्षा प्रणाली चुंबकीय जुदाई
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Figueroa, G., Parira, T., Laverde, A., Casteleiro, G., El-Mabhouh, A., Nair, M., Agudelo, M. Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols. J. Vis. Exp. (116), e54296, doi:10.3791/54296 (2016).

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