Introduction
Dendrittiske celler (DCS) er viktige formidlere av den medfødte og ervervede immunforsvar. De fungerer å indusere primære immunresponser og legge til rette for utvikling av immunologisk hukommelse. Disse cellene er primært ansvarlig for antigen capture, migrasjon og T-celle stimulering og blir derfor referert til som profesjonell antigen-presenterende celler (APC) en .Manipulation av DC kunne benyttes over et bredt spekter av forskningsfelt og i et klinisk miljø for å behandle forskjellig inflammatoriske sykdommer så som HIV 6,7, kreft, autoimmune sykdommer 8 til 9, og allergiske reaksjoner 10. DC blir også brukt for rusmisbruk forskning for å løse ukjente mekanismer og trasé for eksempel i forbindelse med alkoholavhengighet 11-14, narkotikaavhengighet 13,15, og kombinasjonen av HIV-infeksjon og rusmisbruk 16-19. Disse pågående studier og fremtidige forskningsstudier In innen immunologi gjøre in vitro generasjon DC svært viktig for forskningen. Det er imidlertid flere problemer forbundet med å isolere DC fra humant blod som de bare utgjør 0,1 til 1% av de totale mononukleære blodceller 20.
Til dags dato, noen av de veletablerte fremgangsmåter for generering av DC in vitro består av plast eller glass tilslutning av monocytter 21,22, tetthetsgradient-sentrifugering 23, spesifikk markør basert separasjon som for eksempel magnetisk aktivert cellesortering 22, fluorescerende aktivert cellesortering 24, positiv utvelgelse av CD14 + monocytter ved hjelp av dekstran-belagt magnetiske nanopartikler 25, og rask isolering av høyt rensede monocytter ved hjelp av helautomatisk negativ celleutvalget 26. Imidlertid er den beste metoden for valg er fortsatt kontroversielt. Derfor, for å forbedre DC generasjon teknikker, har flere metoder blitt utviklet i hvilkenrenhet av disse cellene kan bli sterkt øket ved differensiering fra rensede CD34 + forløperceller og monocytter ble isolert fra perifere mononukleære blodceller (PBMC) 27. Som nevnt tidligere, er en mye brukt og populær metode for å generere stammer fra monocytter dendrittiske celler (MDDCs) for å utforske muligheten for monocytter å følge glass eller plast (etterlevelse metode) 21,22,27. Den tilslutning Fremgangsmåten er en enkel og rask metode som ikke krever bruk av komplisert utstyr. Men noen ulemper ved denne fremgangsmåte omfatter lymfocytt forurensning, lav fleksibilitet, og monocytt forbigående manipulasjon 28. En alternativ fremgangsmåte til den tilslutning metode er den magnetiske isolering av monocytter fra total PBMC, særlig ved anvendelse av en human monocytt berikelse kit, som er konstruert for å isolere monocytter fra PBMC ved negativ seleksjon 26. I løpet av denne prosedyren, er uønskede celler rettet for fjernelse med tetramertantistoff-komplekser og dekstran-belagte magnetiske partikler. Fordelen med denne isolasjonsmetoden er at de uønskede merkede celler ble separert ved hjelp av en magnet mens målceller fritt kan helles ut i en ny slange, uten behov for kolonner. Til dags dato, med tilgjengeligheten av spesifikke monoklonale antistoffer som kan merke unike cellepopulasjoner, har den magnetiske separasjonsteknikk blir ikke bare en ytterligere metode, men en nødvendighet for isolering av sjeldne celler innen immunologi. For eksempel teknikker som magnetisk cellesortering med kommersielt tilgjengelige paramagnetiske MACS-nanopartikler har muliggjort utvikling av nye tilnærminger for forskning og kliniske applikasjoner 22,29. Videre har nyere studier som sammenligner DC generasjon fra monocytt etterlevelse og MACS teknologi metoder viste en høyere DC renhet og levedyktighet ved hjelp MACS atskilt monocytter 22,30.
Studien presentereren sammenligning mellom to fremgangsmåter for generering av humane DC fra monocytter ble isolert fra PBMC: 1) monocytt isolering ved tilslutning og 2) monocytt isolert ved negativ seleksjon ved anvendelse av et kommersielt human monocytt anrikning kit. Denne studien gir bevis for å vise at den negative utvalget magnetisk separasjon prosedyre for å isolere monocytter genererer høyest avkastning av monocytter med ingen signifikante forskjeller i monocytter levedyktighet sammenlignet med monocytter isolert ved etterlevelse metode. I sin tur, etter syv dager, monocytter isolert av magnetisk separasjon differensiert i MDDCs med betydelig høyere proliferativ kapasitet og høyere beløp av celler som uttrykker dobbelt positiv (CD11c + / CD14 +) fenotype uten å påvirke MDDC levedyktighet. Totalt sett er denne studien skiller seg fra de tidligere studier som det refereres til ovenfor, siden det viser evnen av begge teknikker for samtidig å generere monocytter som er i stand til prolifererende og differensiere til CD11c +MDDCs (> 70%) etter syv dager i kultur uten å svekke deres levedyktighet. I tillegg gir dagens tilnærming for første gang karakterisering av forskjellige CD11c / CD14 MDDCs populasjoner av bilde flowcytometri.
I sammendrag, siden DC spille en fokal rolle når det gjelder forskning innen immunologi, ulike parametere må tas i betraktning når man vurderer hvor de er avledet, og hvilke metoder som anvendes for å isolere og kultur dem in vitro. Derfor sikter denne studien å gi innsikt i to ulike metoder for monocytter isolasjon og hvordan disse metodene ulikt påvirker monocytt levedyktighet og utbytte til slutt påvirker dendrittiske cellen levedyktighet, spredning, og fenotype. Disse funnene vil bidra sterkt til feltet immunologi og vil gi en detaljert protokoll for DC isolering, rensing og karakterisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Totalt humane blod studier er gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board (IRB) for EFE, IRB-protokollen godkjenning # IRB-13-0440. Menneske leukopaks ble kjøpt fra samfunnet blodbank i Miami, FL.
1. Isolering av PBMC ved Standard Tetthet Gradient Technique
- Utføre en 1: 1 fortynning av blod med 1x-fosfat-bufret saltløsning i en T75-kolbe.
- Pipetter 15 ml densitetsgradient oppløsning til 50 ml sentrifugerør og omhyggelig lag (25 - 30 ml / rør) av fortynnet blod i løpet av denne gradienten.
- Sentrifuger i 20 minutter ved 1200 xg med akselerasjon av en og retardasjon av 0.
- Etter sentrifugering, samle grensesnittlaget (hvite blodceller) inn i en ny 50 ml sentrifugerør og vaske cellene to ganger i PBS (3 minutter ved 1080 xg). Kast supernatanten hver gang.
- Behandle celler med ammonium-klorid-kalium-lysering (ACK) buffer (for å lysere røde blodceller). Tilsett 10 ml buffer og icubate i 15 minutter ved 4 ° C.
- Vask cellene to ganger med PBS, sentrifuger i 3 min ved 1080 x g og kast supernatant hver gang.
- Ta vare på pelleten, som vil inneholde PBMC.
- Fortsett med monocytt rensing metoden for valg.
2. Monocyte Rensing ved Etterlevelse Method
- Fremstille fullstendig cellekulturmedium inneholdende L-glutamin (300 mg / ml) og supplert med penicillin (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) og 10% føtalt bovint serum.
- Tillat PBMC å følge i omtrent 2 timer ved å dyrke dem i en T75-kolbe i en konsentrasjon på 5 x 10 7 celler pr 10 ml fullstendig medium ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig inkubator.
- Etter inkubering fjerne ikke-adherente celler fra flytende kulturflaske og forsiktig vaske adherente cellene to ganger med PBS.
- Inkuber adherente celler i fullstendig cellekulturmedium supplert med 2 pl / ml av human granulocytt-macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) og interleukin 4 (IL-4) som er lagret ved et lager konsentrasjon på 10 ug / ml.
- Endre halvparten av mediet og fylle cytokiner hver 48 time.
- Tillat 5 - 7 dager for differensiering av monocytter i MDDCs.
3. Monocyte Rensing av magnetisk separasjon Method
- Samle PBMC fra standard tetthetsgradient teknikk, helles i en 5 ml polystyrenrør og re-suspendere i PBS-buffer ved en konsentrasjon på celler / ml.
- Legg human monocytt anrikning cocktail ved anvendelse av 50 ul / ml celler, bland godt og inkuber ved 4 ° C i 10 min.
- Etter inkubering legge til magnetiske partikler ved hjelp av 50 ul / ml celler, bland godt og inkuber ved 4 ° C i 5 minutter.
- Bringe cellesuspensjonen opp til et totalt volum på 2,5 ml ved tilsetning av PBS-buffer, bland godt ved å pipettere opp og ned til 2 - 3 ganger.
- Plasser polystyren rør uten en hette inn i den magnetiske anordning og satt til side ved romtemperatur i 20,5 min.
- Etter inkubasjon og i en kontinuerlig bevegelse, plukke opp magneten og hell den ønskede renset monocytt fraksjon i en ren 50 ml sentrifugering tube.
- Inkuber adherente celler i fullstendig cellekulturmedium supplert med 2 pl / ml av human granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og interleukin 4 (IL-4) som er lagret ved et lager konsentrasjon på 10 ug / ml.
- Hver 48 time, endre halvparten av mediet, spinne ned ved 1080 xg i 5 min og re-suspen pellet med nye cytokiner media (cRPMI) og.
- Tillat 5 - 7 dager for differensiering av monocytter i MDDCs.
4. trypanblått Utelukkelse levedyktighet analysen
Merk: Bruk denne teknikken for å få celle yield og levedyktighet av PBMC, monocytter, og MDDCs.
- Høste celler ved anvendelse av standard trypsin-EDTA og utfører vaskinger i kolbene og cellepelleten ved hjelp av PBS. Avhengig av størrelsen av pelleten, kan desssuspendere i 5 til 10 ml PBS for å oppløse pelleten.
- I et mikro-sentrifugerør, utfører en 1: 1-fortynning av trypanblått-reagens med fortynnet cellepelleten.
- Fra denne blandingen, alikvoter 10 mL i en celle telling lysbilde og lese resultater ved hjelp av en automatisk celleteller i henhold til produsentens protokoll. Dersom en automatisk celleteller ikke er tilgjengelig, er en tilsvarende celletall mulig ved hjelp av et hemocytometer eller en manuell teller.
5. MTT analyse
- Plate-celler ved en konsentrasjon på 4 x 10 4/100 pl av komplett medium i hver brønn i en 96-brønns plate. Tillat 24 timer for cellene å tilpasse seg kulturen.
- Inkuber og utføre målinger ved 0 ° C (dag 0), 36 (dag 3) og 84 (dag 7) hr respektivt.
- Ved gjennomføring av ønsket inkubasjon, fjerne media og erstatte med 100 mL PBS alene.
- Fremstille 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetrazoliumbromid oppløsning (MTT) (5 mg / ml) ved tilsetning av 10 ml dimetylyl-sulfoksyd (DMSO) til en g natriumdodecylsulfat (SDS).
- Tilsett 10 ul (5 mg / ml) av MTT-løsning til hver brønn og inkuber ved 37 ° C i ytterligere 2 timer.
- Etter inkubasjon fjerne supernatanter som inneholder PBS og uomvendte MTT blanding (gul-farge løsning).
- Tilsett 100 ul SDS-DMSO-løsning til hver brønn og inkuber i ytterligere en time.
- Les absorbansen ved 540 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
6. Cell Surface Farging Analyse av Imaging flowcytometrisystemer
- Etter 7 dager med differensiering fra rensede monocytter, dispensere 1x10 6 celler porsjoner av monocytt-avledede dendrittceller i det riktige antall av 1,5 ml rør.
- Start celleoverflatefarging av blokkerende cellene ved anvendelse av 50 ul av varmeinaktivert (HI) humant serum, inkuber ved 4 ° C i 10 min.
- Etter inkubasjon sentrifugeres cellene ved 720 xg i 5 minutter, kaste supernatant.
- Til celle pellet, legger respektive fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer (f.eks, anti-CD11c eller anti-CD14) og inkuberes ved 4 ° C i 20 minutter beskyttet mot lys. I separate rør, forberede enkelt fluorokromkonjugerte farget prøver / ml) siden det er behov for kompensasjon.
- Etter inkubering vaskes cellene to ganger i 1 ml PBS-buffer og sentrifuger hver gang ved 720 xg i 5 minutter.
- Å holde celler beskyttet mot lys, re-suspendere i PBS-buffer ved en konsentrasjon på celler / 100 ul i strømningscytometri-analyse.
- For å gate på levedyktige celler, tilsett 1 mL av DAPI til hvert rør før anskaffelse av celler på én celle bildebehandling flowcytometri instrument i henhold til produsentens instruksjoner.
7. Statistisk analyse
- Input alle data i et regneark.
- Sammenligne resultatene med t-test og / eller enveis ANOVA som hensiktsmessig.
- Vurdere forskjellene er statistisk signifikant hvis p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monocyte Yield av magnetisk separasjon er høyere sammenlignet med Monocyte Yield ved Etterlevelse Method
Data presentert i figur 1 skjerm PBMC og monocytt-celletellinger ved trypan blå eksklusjon fremgangsmåte ved dagen for isolering av PBMC og separasjon av monocytter. I gjennomsnitt, monocytter isolert ved etterlevelse metode sto for om lag 6,2 prosent av totalt PBMC mens monocytter isolert av magnetisk separasjon sto for opp til 25 prosent av PBMC. Statistisk analyse viste at prosentandelen av monocytter som gis av magnetisk separasjon var signifikant høyere (≥ 4 ganger). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ved hjelp av studentens t-test viste en signifikant forskjell på monocytt utbytte når man sammenligner begge metodene (p ≤ 0,0005).
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Monocyte Isolering av Etterlevelse og ved magnetisk separasjon Ikke påvirk Monocyte LivskraftigEtter monocytt isolering av de to forskjellige teknikker som er beskrevet ovenfor, ble levedyktighet analyser gjennomføres for å sikre at metodene som ble brukt var ikke cytotoksiske og påvirker levedyktigheten av cellene. Dataene presentert i figur 2 visning gjennomsnittet av prosent av levedyktige monocytter isolert ved enten tilslutning metode eller ved magnetisk separasjon. Levedyktige celler ble telt ved bruk av trypan blå eksklusjon fremgangsmåte ved dag av isolasjon. Sammenligning av levedyktighet prosent av monocytter mellom de to isoleringsmetoder avslørte at forskjellen mellom de to gruppene var ikke statistisk signifikant. I tillegg er gjennomsnittet av prosent av levedyktige monocytter isolert ved tilslutning var 91,75% ± 1,66 og gjennomsnittet av prosent av levedyktige monocytter ble isolert ved magnetisk separasjon var 87,4% ± 2,75. Disse levedyktighet data ble vurdert fra minst tre uavhengige forsøk. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av t-test.
Celler avledet fra Monocytter Isolerte av magnetisk separasjon viser en betydelig økning i celleproliferasjon Sammenlignet med celler avledet fra Monocytter kjøpt opp av Etterlevelse Method
MTT ble anvendt som en kolorimetrisk assay for å måle celleproliferasjon. I levende celler, blir den gule fargen tetrazol MTT redusert til purpur formazan, som lett kan måles ved hjelp av et spektrofotometer. Dataene presentert i figur 3 viser at begge prosesser av monocytt isolasjon føre til økt celleformering i løpet av en periode på 7 dager som målt ved en økning i absorbans ved dag 0 (tilslutning metode: 0,22 ± 0,02 vs. magnetisk metode: 0,38 ± 00,02), dag 3 (etterlevelse metode: 0,28 ± 0,02, magnetisk metode: 0,55 ± 0,05) og dag 7 (etterlevelse metode: 0,36 ± 0,01, magnetisk = 0,66 ± 0,006). Men i motsetning til XTT-analysen (data ikke vist), MTT-analysen viste en signifikant økning i celleproliferasjon av MDDCs fra monocytter isolert ved magnetisk separasjon i forhold til MDDCs fra monocytter ervervet ved tilslutning fremgangsmåte ved dag 0 (p = 0,003), dag 3 (p = 0,006), og dag 7 (p = 0,002). Celleproliferasjon ble også funnet å være signifikant forskjellig mellom dagene 0 og 3 (p = 0,003), og mellom dagene 0 og 7 (p <0,001) innenfor gruppen av MDDCs fra monocytter renset ved magnetisk separasjon. Videre ble det observert en signifikant forskjell i celleformering mellom dag 0 og dag 7 i MDDCs fra monocytter renset ved adhesjon (p = 0,008). MTT Analysen ble utført ved bruk av MDDCs kjøpt fra tre ulike eksperimenter. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av ANOVA og t-test, p ≤ 0,05 wsom regnes som betydelig, og p-verdiene er notert på grafen med mindre ingen statistisk signifikans ble funnet.
Karakterisering av MDDCs av CD11c og CD14 Cell Surface Farging
Etter dyrking monocytter i syv dager med IL-4 og GM-CSF, MDDCs erholdt fra monocytter isolert ved adherens og magnetisk isoleringsmetoder ble karakterisert i figur 4. Karakteriseringen viste lav enkelt CD14 + / CD11c- fenotype eller rent monocyttisk populasjonen i begge metodene tilslutning = 1% ± 1,0 versus magnetiske = 1% ± 0,0 og høy total CD11c + fenotype, at man følger = 72% ± 11 i forhold til magnetisk = 79% ± 19. når imidlertid den totale CD14 + populasjonen ble analysert ytterligere, var det et høyt utbytte av cellene dobbel positive for CD11c og CD14 i begge metoder med magnetisk separasjon som gir et høyere antall CD11c og CD14 dobbel positivpopulasjonen sammenlignet med den tilslutning fremgangsmåten, at man følger = 49% ± 7 versus magnetisk = 73% ± 15. Selv om det var en høyere utbytte av MDDCs med dobbel positiv fenotype via magnetisk separasjon, CD11c positive og CD14 negativ populasjon av MDDCs ble høyere i tilslutning metoden; tilslutning = 23% ± 7 versus magnetisk = 6% ± 7. På figur 4B, ble den midlere fluorescensintensitet (MFI) av hvert enkelt markør så på i gated populasjonen og viste høy intensitet av CD14 i CD14 + -populasjonen, som tilsvarer intensiteten av både CD11c og CD14 i dobbel positiv befolkning og høy CD11c intensitet i CD11c + og CD14- befolkningen. I sammendraget, selv om magnetisk isolering gir en høyere prosentandel av CD11c + / CD14 + celler, som kan være tidlige stadium differensiert MDDCs som ennå ikke har falt i monocytic markør (CD14), gir tilslutning metoden en høyere prosentandel av CD11c + / CD14-, som kan være et sent stadium differensiert MDDC befolkning. i addition, DAPI farging ble utført for å bekrefte levedyktighet resultater og for å sikre karakterisering ble utført på levende MDDCs. Prosentandelen av DAPI negativ / levende celler (etterlevelse = 76 ± 7 versus magnetisk = 67 ± 1) ikke er signifikant forskjellig mellom de to metodene som bekrefter begge metodene ikke påvirker levedyktigheten til MDDCs etter syv dager i kultur.
Figur 1. Monocyte Utbytte ved magnetisk separasjon er høyere sammenlignet med Monocyte Utbytte av Adherens metode. Om 6,2% av monocytter ble isolert fra PBMC ved hjelp av fremgangsmåten tilslutning mens ~ 25% av monocytter ble oppnådd ved bruk av magnetiske separasjonsmetode. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter. Statistisk analyse ved bruk av studentens t-test viste en signifikant forskjell fra monocytt utbytte når man sammenligner begge metodene(p = 0. 00 005). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Monocyte Isolering av Etterlevelse og ved magnetisk separasjon Ikke påvirk Monocyte levedyktighet. Gjennomsnittet av prosent av levedyktige monocytter isolert ved etterlevelse var 91,75% ± 1.66 og gjennomsnittet av prosent av levedyktige monocytter isolert av magnetisk separasjon var 87,4% ± 2.75. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD prosentandel av levedyktige celler av minst tre uavhengige eksperimenter. Ingen signifikant forskjell ble observert i celleviabilitet når man sammenligner begge rensemetoder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. celler avledet fra Monocytter isolert ved magnetisk separasjon viser en betydelig økning i celleproliferasjon sammenlignet med celler avledet fra Monocytter ervervet ved Adherens metode. Det ble observert en signifikant økning i absorbans for begge metoder både dag 3 og dag 7 når man sammenligner verdiene mot sine respektive elementene dag 0. i tillegg, ANOVA og student t-test viste også en signifikant forskjell i absorbans av MTT-opptaket ved sammenligning av begge metoder (p ≤ 0,05). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
96 / 54296fig4.jpg "/>
Figur 4. Karakterisering av MDDCs av CD11c og CD14 Cell Surface Farging. A) Bar graf som representerer de ulike populasjoner (% silt ut fra enkeltceller). Først ble DAPI- (live) celler gated fra total enkeltceller. Deretter ble CD14 + / CD11c-, CD11c +, CD11c + / CD14 + og CD11c + / CD14- gated fra DAPI- (live) befolkningen. CD11c + befolkningen er summering av to regioner CD11c + / CD14 + og CD11c + / CD14-. B) Representative grafer som viser gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) verdier for både CD11c og CD14 i hver undergruppe av celler. C) Representant spredningsplott av celler merket med CD11c-APC og CD14-APCcy7 inngjerdet på DAPI negative (live) cellepopulasjon for både magnetiske og etterlevelse metoder. Representant bildegalleri fra enkeltceller (valgt i blått i spredningsplott) tilhører hver sub-populasjon av celler, CD11c + / CD14- (inngjerdet i oransje), CD11c + / CD14 + (inngjerdeti rødt) og CD14 + (inngjerdet i lilla). I bildegalleriet av enkeltceller, den røde fargen representerer CD11c merket med APC og gul farge representerer CD14 merket med APCcy7. I spredningsplott, fargene valgt å gate bestandene er tilfeldig og ikke relatere til selve celle bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Basert på de kjente vanskelighetene med å isolere og generere MDDCs fra menneskeblod, denne studien forsøkte å gi en omfattende sammenligning av to veletablerte metoder for generering av MDDCs. Den første metoden sammen er et veletablert tradisjonell fremgangsmåte for å generere MDDCs ved å utnytte muligheten av monocytter til å følge glass eller plast (tilslutning metode) 21,22,27. Den tilslutning metoden er rask og kostnadseffektiv, og krever ikke bruk av komplisert utstyr. Men noen ulemper ved denne fremgangsmåte omfatter lymfocytt forurensning, lav fleksibilitet, monocytt forbigående manipulasjon 22,30,31. Den andre alternative metoden sammen er den magnetiske isolering av monocytter fra de totale perifere mononukleære blodceller (PBMC) ved hjelp av en human monocytt berikelse sett 26, som er utformet for å isolere monocytter fra PBMC ved negativ seleksjon. Fordelen med denne isolasjonsmetoden er at de uønskede celleneer merket og separert ved hjelp av en magnet, mens målcellene blir fritt helles ut i en ny slange, uten behov for kolonnene og uten direkte rettet mot celler med antistoffer. Uavhengig av monocytt isolasjonsmetoden (vedheftende sammenlignet med magnetisk separasjon), etter at begge fremgangsmåter, en av de viktige trinnene i protokollen er den in vitro stimulering av monocytter med granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og interleukin-4 ( IL-4), som er nødvendig for å generere MDDCs. Dette er en vanlig og godt etablert protokoll for å generere MDDCs fra mononukleære blodceller uten at det går antigen fange og prosesseringskapasitet karakteristisk for umodne MDDCs 32. En av de store begrensningene av de teknikker som vanligvis anvendes for in vitro produksjon av DC er det lave utbyttet av forløperceller slik som monocytter. Som rapportert ovenfor, monocytter isolert ved etterlevelse metode utgjorde cirka 6,2 prosent av total PBMCs, mens monocytter isolert av magnetisk separasjon sto for opp til 25 prosent av PBMC. I henhold til litteraturen, varierer for differensial hvite blodceller i normale voksne for monocytter er fra 2 - 10% 31 mens DC bare utgjøre 0,1 til 1% av de totale mononukleære blodceller 20. Derfor kan den høyt utbytte av monocytter (~ 25%) ble oppnådd etter magnetisk isolasjon være på grunn av urenheter fra cellepopulasjon og mangel på antistoff og / eller magnetpulver binding til uønskede celler.
For å oppnå et høyt utbytte og renhet av de isolerte monocytter, bør alle de kritiske trinn i protokollen følges nøye. Under isolering av PBMC fra blodet ved standard densitetsgradientsentrifugering, er det noen viktige skritt. Først pipettering og omhyggelig lagdeling av blod i løpet av densitetsgradient-løsning i 50 ml sentrifugerør er et trinn som krever øvelse siden pipettering strengt kan føre til blanding av denne løsning og blod,som kan føre til en svak PBMC-lag som er vanskelig å isolere, eller det kan resultere i fullstendig blanding av røde blodceller med PBMC. I dette trinnet er det viktig å opprettholde en konstant og relativt langsom strøm av pipettering for å ha en veldefinert lag av blod og en distinkt PBMC-lag. For det andre, er sentrifugering i neste trinn med en akselerasjon og retardasjon 0 meget kritisk. Hvis disse innstillinger ikke brukes for den første sentrifugeringstrinn, vil det føre til blanding av blodet med den densitetsgradient løsning uberegnelig og vil ikke skille PBMC fra resten av blodkomponenter. For det tredje er det viktig å inkubere de PBMC med Ammonium-klorid-Kalium (ACK) lysebuffer for ikke lenger enn den optimaliserte tid (10 - 15 min) siden lengre inkubasjon med ACK kan føre til reduksjon av levedyktige PBMC sammen med røde blodlegemer . I tillegg er det også viktig å utføre de PBS-vaskinger etter ACK inkubasjon. Imidlertid, hvis de røde blodcellene ikke blir lysert med den førsteACK trinnet og de likevel fortsetter å dukke opp etter vask, blir en ny runde av ACK Lysing sterkt anbefalt.
Etter isolering av hvite blodceller, er det noen viktige skritt for å huske på når du utfører tilslutning metode for å generere monocytter. Først, vasking av de flytende lymfocyttene etter to timers inkubasjon PBMC-er svært viktig ettersom nærvær av flytende lymfocytter kan føre til mindre monocytter til å overholde, og kan også resultere i lavere MDDC renhet. Selv om disse vasketrinnene er kritiske, overdreven og hard vask (mer enn anbefalt, dvs. to ganger) kan føre til vask av de heft monocytter også, noe som resulterer i lavere monocytt yield. For det andre, inkubere cellene med komplett medium og cytokiner er kritisk siden cytokiner er ansvarlig for differensiering av monocytter i MDDCs. I tillegg, Medier og etterfylling av cytokiner hver 48 time er viktig for differensiering og overlevelse av cellene. Selv om endring av media, er det også avgjørende å lagre flytende MDDCs og returnere dem tilbake i kultur sammen med friske medier og cytokiner siden det ikke er noen MDDCs som kan løsne fra overflaten under differensieringsprosessen. Det er også viktig å sørge for at monocytter er sådd ved anbefalt konsentrasjon, festet og nær hverandre fordi de trenger celle til celle kontakt for å vokse. Når du utfører magnetisk separasjon metode for å generere monocytter, er det noen viktige skritt for å få en god avkastning og høy renhet av monocytter. For det første er det viktig å opprettholde cellekonsentrasjonen er anbefalt av produsenten. Det er også viktig å ikke forstyrre den polystyrenrør når den plasseres i magneten, da det kan føre til mindre utbytte og mindre renhet. Som presentert ovenfor, fører denne teknikken til en betydelig høyere monocytt utbytte (figur 1) i forhold til den tilslutning metode, som kan være relatert til nærværet av andre calen. Videre, når cellene ble karakterisert ved flowcytometri, viser den magnetiske metode en høyere prosentandel av doble positive celler (CD11c + / CD14 +), som kan korrelere med nærværet av andre celler, eller kan også være på grunn av tilstedeværelsen av ulike stadier av MDDC differensiering.
Et annet viktig aspekt ved in vitro MDDC generering uavhengig av utbytte og renhet er evnen til å generere levedyktige og proliferative MDDCs. Studien gir bevis for å demonstrere at begge rensemetoder indusere proliferasjon av MDDCs (figur 3), som vist ved økning i celle metabolsk aktivitet i løpet av syv dager i kultur. I tillegg, genereringen av MDDCs fra monocytter renset ved magnetisk separasjon viste en signifikant større andel av proliferasjon sammenlignet med MDDCs generert fra monocytter renset ved adhesjon (figur 3). Disse resultatene er i samsvar med tidligere litteratur viser at generation av DC fra CD34 + celler er en proliferativ prosess på grunn av tilstedeværelsen av proliferative DC progenitorceller i humant blod 27, 33. Det er imidlertid kontroversielle funn viser at monocytter kan også differensiere til DC uten noen tegn til spredning 34,35. Det er relevant å påpeke at det er mye uenighet om in vitro generasjon av DC og om hvorvidt DC genereres fra prolifererende forløpere eller fra differensiering av monocytter. For eksempel, har in vitro produksjon av DC fra adherente perifere blodceller er vist å også anrike for stamceller som er i stand til proliferasjon etter eksponering for GM-CSF 27, og det er også bevis som viser at utbyttet av DC utledet i nærvær av GM-CSF og IL-4 kan ikke utvides utover det antall monocytter som starter 33. Totalt sett er denne studien viser en økt i spredning av monocytic celler i kultur som etter syv dager medføre en total MDDCs befolkning med> 70% CD11c + fenotype (etterlevelse = 72% ± 11 versus magnetisk = 79% ± 19). Det er aktuelt å påpeke at når ytterligere fenotypisk analyse ble utført, men ikke signifikant, monocyttene isolert ved den magnetiske separasjonsmetoden medførte MDDCs med en høyere dobbel positiv fenotype (tilslutning = 49% ± 7 CD11c + / CD14 + versus magnetisk = 73% ± 15 CD11c + / CD14 +), mens monocytter ble isolert ved adhesjon resulterte i MDDCs med høyere enkelt positiv fenotype (tilslutning = 23% ± 7 CD11c + / CD14- versus magnetiske = 6% ± 7 CD11c + / CD14-). MDDCs med høyere dobbel positiv fenotype (CD11c + / CD14 +) kan være under tidlige stadier av differensiering mens MDDCs med en høyere enkelt positiv fenotype kan være under sene stadier av differensiering.
Oppsummert gir denne studien bevis for å støtte at den negative utvalget magnetisk separasjon procedure å isolere monocytter genererer høyest avkastning av monocytter med ingen signifikante forskjeller i monocytter levedyktighet sammenlignet med monocytter isolert ved etterlevelse metode. I sin tur, etter syv dager, monocytter isolert av magnetisk separasjon differensiert i MDDCs med betydelig høyere proliferativ kapasitet og høyere beløp av celler som uttrykker dobbelt positiv (CD11c + / CD14 +) fenotype uten å påvirke MDDC levedyktighet. Når man sammenligner begge metodene, har resultatene vist evnen av begge teknikker for samtidig å generere monocytter som er i stand til prolifererende (figur 3) og differensiering (figur 4) inn i CD11c + MDDCs etter syv dager i kultur siden begge metoder ga> 70% CD11c + MDDCs . Imidlertid kan videre analyse ser på modning markører være nyttig å fullt karakterisere funksjonell MDDC befolkningen. I konklusjonen, begge metodene er fordelaktige alternativer for isolering av CD11c + MDDCs og provIde en tilstrekkelig avkastning for forskningssøknader og kan også være nyttig for fremtidige kliniske applikasjoner. Laboratoriet er for tiden fokuserer på generering av MDDCs å studere effektene av alkoholmisbruk og andre stoffer av misbruk på det medfødte immunsystemet, i særlig evnen av disse stoffene til å endre MDDC fenotype og funksjon. Derfor vil denne studien tilveiebringe en grunnlinje på MDDC karakterisering og forbedre evnen til å fortsette med ytterligere eksperimentering for å belyse de molekylære mekanismer som formidler monocytt-avledede dendrittiske cellefunksjon i sammenheng med stoffmisbruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at RT |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
References
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al.
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O.
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
