Introduction
수지상 세포 (DC가)는 타고난 및 적응 면역 시스템의 중요한 매개체이다. 이들은 차 면역 반응을 유도하는 면역 학적 기억의 개발을 용이하게하는 기능을한다. 이러한 세포는 항원을 포획, 마이그레이션 및 T 세포 자극을 주로 담당하므로 수지상 .Manipulation 다른 치료 연구의 다양한 분야에 걸쳐 상기 임상 환경에서 이용 될 수있는 한 같은 전문 항원 제시 세포 (APC를)라고 이러한 HIV 6,7 암 (8)과 같은 염증성 질환,자가 면역 질환 9 및 알레르기 반응 (10). 수지상은 또한 알코올 의존 11-14, 13, 15, 약물 의존성, 및 HIV 감염 및 약물 남용 16-19의 조합과 관련된 것과 같은 미지의 메커니즘 경로를 해결하기 위해 약물 남용 연구에 이용되고있다. 이러한 지속적인 연구와 미래 연구 조사 전n은 면역학 분야의 연구에 매우 중요한 수지상 세포의 체외 세대합니다. 총 혈액 단핵 세포 (20)의 1 % - 그러나, 이들이 0.1를 구성하는 인간 혈액 수지상 세포 분리와 연관된 여러 가지 어려움이있다.
지금까지 DC가 체외의 생성에 대한 확립 된 방법 중 일부는 (22) 자기 활성 셀 정렬, 형광 활성화 된 셀 정렬로 단핵 세포 (21, 22)의 플라스틱이나 유리 준수, 밀도 기울기 원심 분리 (23), 특정 마커 기반의 분리 구성 24, 덱스 트란 코팅 자성 나노 입자 (25), 및 완전 자동화 된 음의 셀 선택 (26)를 사용하여 고순도 단핵 세포의 신속한 분리를 사용하여 CD14 +의 단핵 세포의 긍정적 인 선택. 그러나 선택의 가장 좋은 방법은 논란이 남아있다. 따라서, DC 생성 기술을 개선하기 위해 다양한 방법이있는 개발되어왔다이러한 세포의 순도가 크게 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리 정제하여 27 CD34 + 조상 세포 및 단핵 세포의 분화에 의해 증가 될 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이, 단핵구 유래 수지상 세포 (MDDCs)을 생성하는 광범위하게 사용되는 대중적인 방법은 유리 또는 플라스틱 (접착 방법) 21,22,27에 부착 단구의 능력을 조사하는 것이다. 접착력 방법은 복잡한 장비의 사용을 요구하지 않고 신속하고 간단한 방법이다. 그러나,이 방법의 단점은 림프구 오염, 낮은 유연성, 단핵구 과도 조작 (28)를 포함한다. 접착력 방법의 대체 방법은 특별히 음성 선별 (26)에 의해 한 PBMC로부터 단핵구를 분리하기 위해 디자인 된 인간 단핵구 보충 키트를 사용하여, 총 한 PBMC로부터 단핵구를 자기 분리한다. 이 절차를 수행하는 동안, 원치 않는 세포는 테트라와 제거를 대상으로항체 복합체 및 덱스 트란 코팅 된 자성 입자. 이 분리 방법의 장점은 원치 않는 표지화 된 세포가 표적 세포를 자유롭게 열 필요없이 새로운 튜브 속으로 주입 될 수 있지만 자석을 이용하여 분리되어 있다는 것이다. 지금까지 고유 한 세포 인구 레이블을 수있는 특정 단일 클론 항체의 가용성, 자기 분리 기술은 추가 방법,하지만 면역학 분야의 희귀 세포의 분리에 대한 필요성 단순히되고있다. 예를 들면, 자기 셀과 같은 기술 연구 및 임상 응용 22,29 새로운 방법의 개발을 용이 한 시판 상자성 나노 입자-MACS 선별. 또한, 단핵구의 부착 및 MACS 기술 방법에서 DC 생성을 비교하는 최근의 연구 조사는 단핵 세포 22,30 분리 MACS를 사용하여 더 높은 DC 순도 및 생존 능력을 증명하고있다.
본 연구의 선물상업용 인간 단핵구 보충 키트를 사용하여 접착 한) 단핵 세포 분리 및 2) 단핵 세포 분리 음성 선별 기준 : PBMC를 분리 인간 단핵구로부터 수지상 세포의 생성에 대한 두 가지 방법의 비교. 이 연구는 부착 방법에 의해 고립 된 단핵구와 비교했을 때 단핵구를 분리 할 수있는 음의 선택 자기 분리 절차는 단핵 세포 생존 능력에 유의 한 차이 단핵 세포의 가장 높은 수율을 생성하는 보여주는 증거를 제공합니다. 차례로, 7 일 후에, 자기 분리에 의해 고립 된 단핵구는 MDDC 생존에 영향을주지 않고 상당히 높은 증식 능력과 더블 플러스 (중 CD11c + / CD14 +) 표현형을 발현하는 세포의 높은 양의 MDDCs로 분화. 그것은 동시에 증식과의 CD11c로 분화 할 수있는 단핵 세포를 생성하는 두 가지 기술의 능력을 입증 때문에 전체적으로 현재 연구 + 위에서 언급 한 선행 연구와 다르다자신의 가능성을 손상시키지 않고 문화 7 일 후에 MDDCs (> 70 %). 또한, 현재의 방법은 유동 세포 계측법 촬상 다를은 CD11c / CD14 MDDCs는 인구의 처음 특성을 제공한다.
수지상은 면역학 분야의 연구에 관한 초점 역할 때문에 이들이 유도 된 어떤 방법은 시험관 내에서 이들을 분리하고 배양하기 위해 사용되는 방법을 고려하면 요약하면, 다른 파라미터가 고려되어야한다. 따라서 본 연구는 두 가지 단핵구 분리 방법 및 방법이 방법은 차등 결국 수지상 세포 생존, 증식 및 단핵구의 표현형에 영향을 생존 및 수율에 영향을 통찰력을 제공하는 것을 목적으로한다. 이러한 발견은 면역학 분야에 크게 기여하고 DC 분리, 정제 및 특성에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다.
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Protocol
전체 인간의 혈액 연구를 검토하고, IRB 프로토콜 승인 번호의 IRB-13-0440 FIU의 임상 시험 심사위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다. 인간 leukopaks 마이애미, 플로리다의 지역 사회 혈액 은행에서 구입 하였다.
표준 밀도 그라데이션 기법에 의해 PBMC를 1. 분리
- T75 플라스크에 1 배 - 인산 완충 생리 식염수와 혈액의 1 희석 : 1을 수행합니다.
- 피펫 (15) 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 밀도 구배 용액의 ml를 조심스럽게 층 -이 그라데이션을 통해 희석 된 혈액 (25 ~ 30 ㎖ / 튜브).
- 1의 가속과 0의 감속 1,200 XG에서 20 분 동안 원심 분리기.
- 원심 분리 후, 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 계면 층 (백혈구)를 수집하여 PBS로 두 번 (1080 XG에서 3 분) 세포를 세척 하였다. 때마다 뜨는 폐기하십시오.
- 암모늄, 염화 칼륨, 용균 (ACK) 완충액으로 세포를 치료 (적혈구를 용해시키기 위해). 버퍼와 10 ML을 추가4 ℃에서 15 분 동안 cubate.
- 1,080 XG에서 3 분 동안, PBS로 두 번 원심 분리기 세포를 씻고마다 상층 액을 버린다.
- PBMC를을 포함하는 펠렛을 저장합니다.
- 선택의 단핵 세포 정제 방법으로 진행합니다.
준수 방법 2. 단핵구 정화
- L 글루타민 하였다 (300 mg / ㎖)을 포함한 전체 세포 배양 배지를 준비 페니실린 (50 U / ㎖) -streptomycin (50 μg의 / ml) 및 10 % 소 태아 혈청.
- 이 PBMC를 가습 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 완전 배지 10 ㎖ 당 5 × 107 세포의 농도에서 T75 플라스크에 이들을 배양하여 약 2 시간 동안 부착 할 수있다.
- 배양 후, 배양 플라스크에서 비 부착 떠있는 세포를 제거하고 부드럽게 PBS로 두 번 부착 세포를 씻는다.
- 인간 과립구 macr 2 μL / mL로 보충 된 완전 세포 배양 배지에서 부착 세포를 부화ophage 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 인터루킨 4 (IL-4)를 10 μg의 / ㎖ 스톡 농도로 저장된다.
- 매체의 절반을 변경하고 사이토 카인마다 48 시간을 보충.
- MDDCs에 단핵 세포의 분화 7 일 - 5 허용합니다.
자기 분리 방법 3. 단핵구 정화
- 5 ml의 폴리스티렌 튜브에 붓고 세포 / ml의 농도로 PBS 버퍼에 일시 중지 다시 표준 밀도 구배 기법으로부터 PBMC를 수집.
- 50 μL / ㎖의 세포를 사용하여 인간 단핵 세포 농축 칵테일을 추가 잘 혼합하고 10 분 동안 4 ° C에서 품어.
- 배양 후, 50 μL / ml의 세포를 사용하여 자성 입자를 추가 잘 혼합하여 4 ℃에서 5 분간 배양한다.
- , PBS 완충액을 첨가하여 2.5 ml의 총 부피까지 세포 현탁액을 가지고 다운이 닫 피펫 팅하여 잘 혼합하고 - 3 회.
- 자기 장치에 캡없이 폴리스티렌 튜브를 삽입하고이 동안 실온에서 방치0.5 분.
- 배양 후와 하나의 연속 동작으로, 자석을 선택하고 깨끗한 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 원하는 정제 단핵 세포 분획을 붓는다.
- 전체 세포 배양 인간 과립구 - 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)을 2 μL / mL로 보충 된 배지 4 인터루킨에 부착 세포를 부화 (IL-4)를 10 μg의 / ㎖ 스톡 농도로 저장된다.
- 모든 48 시간은 매체의 절반을 변경 5 분 동안 1,080 XG에 스핀 다운 및 새로운 미디어 (CRPMI) 및 사이토 카인과 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- MDDCs에 단핵 세포의 분화 7 일 - 5 허용합니다.
4. 트리 판 블루 제외 생존 분석
참고 : PBMC를, 단핵구 및 MDDCs의 세포 수율과 생존을 얻기 위해이 기술을 사용합니다.
- 표준 트립신 EDTA를 사용하여 플라스크하고 PBS를 이용하여 세포 펠렛의 세척을 수행 수확 세포. 펠렛의 크기에 따라 재펠렛을 용해 PBS 5 내지 10 ml의 정지.
- 희석 된 세포 펠렛과 트리 판 블루 시약 1 희석 마이크로 원심 분리 튜브에 1을 수행한다.
- 이 믹스에서 셀에 나누어지는 10 μl의 슬라이드를 계산하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 자동 세포 계수기를 사용하여 결과를 참조하십시오. 자동 세포 계수기를 사용할 수없는 경우 유사한 세포 수는 혈구 또는 수동 계수기를 사용하여 가능하다.
5. MTT 분석
- 웰 96 웰 플레이트의 각으로 완전한 미디어 4 × 10 100분의 4 μL의 농도로 플레이트 세포. 세포는 문화에 적응하기위한 24 시간을 허용합니다.
- 품어 각각 0 (0 일), 36 (3 일), 84 (7 일) 시간에 측정을 수행합니다.
- 원하는 배양 완료시, 미디어를 제거하고 혼자 PBS 100 ㎕로 교체합니다.
- 준비 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) - 다이 메틸 10 ㎖를 첨가하여 -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 용액 (MTT) (5 ㎎ / ㎖)도데 실 황산나트륨 1g을 (SDS)에 일 설폭 사이드 (DMSO).
- 각 웰에 MTT 용액 10 μL (5 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 추가 2 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 부화 후, PBS와 회심 MTT 혼합물 (노란색 컬러 솔루션)를 포함 상층 액을 제거합니다.
- 각 웰에 SDS-DMSO 용액 100 μl를 추가하고 하나의 추가 시간 동안 배양한다.
- 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 참조하십시오.
6. 세포 표면 이미징 유동 세포 계측법에 의해 염색 분석
- 정제 단핵 세포에서 분화 7 일 후, 1.5 ml의 튜브의 해당 번호로 단핵구 유래 수지상 세포의 1 × 6 전지 씩 분배.
- 불 활성화 열 50 μL (HI) 인간 혈청을 사용하여 차단하는 세포에 의해 세포 표면의 얼룩을 시작, 10 분 동안 4 ° C에서 품어.
- 배양 후, 원심 분리기 세포 5 분 720 XG에는, 상층 액을 버린다.
- PELLE 셀t는 각각의 형광 색소 - 컨쥬 게이트 된 항체 (예, 항 중 CD11c 또는 항 CD14)를 첨가하고, 빛으로부터 보호 된 20 분 동안 4 ℃에서 배양한다. 그들은 보상을 위해 필요하기 때문에 별도의 튜브에서) 하나의 형광 색소 묻은 샘플 / ㎖를 준비합니다.
- 배양 후, 5 분 동안 720 XG에서 PBS 버퍼와 원심 분리기 1 ㎖ 때마다 두 번 세포를 씻으십시오.
- 빛으로부터 보호 셀을 유지하는 유동 세포 계측법 분석을위한 세포 / 100 ㎕의 농도로 PBS 완충액에 재현 정지.
- 생존 세포의 게이트하기 위해, 종래 제조업체의 지시에 따라 악기 계측법 단세포 촬상 흐름 세포를 취득하여 각 튜브에 DAPI 1 μL를 추가한다.
7. 통계 분석
- 입력 스프레드 시트에있는 모든 데이터.
- 학생의 t-시험 및 / 또는 편도 적절한 ANOVA를 사용하여 결과를 비교한다.
- 페이지의 경우 <0.05 통계적으로 유의 한 것으로 차이를 고려한다.
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Representative Results
자기 분리에 의해 단핵구의 수율은 준수 방법에 의해 단핵구 수익률에 높은를 비교한다
PBMC를하고 단핵 세포의 분리 분리의 날에 트리 판 블루 배제 법에 의해 그림 1 표시 PBMC와 단핵구 세포 수에 제시된 데이터. 자기 분리에 의해 격리 된 단핵 세포는 PBMC를의 최대 25 %를 차지하면서 평균적으로 부착 방법에 의해 고립 된 단핵구는 총 PBMC를 약 6.2 %를 차지했다. 통계 분석은 자기 분리에 의해 산출 단핵 세포의 비율이 상당히 높은 (≥ 4 배)이었다 것으로 나타났습니다. 데이터는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SD로 나타낸다. 두 가지 방법 (0.0005 ≤ p)를 비교했을 때 단핵구 수율의 유의 한 차이를 보였다 -test 학생의 t을 사용하여 통계 분석.
1 "> 단핵구 분리 준수에 의해 자기 분리에 의해 단핵구 생존에 영향을주지 않습니다"유지 - together.within 페이지를 = FO "_content상술 한 두 가지 다른 기술에 의해 단핵구 분리 후, 생존력 분석법이 사용되는 방법은 세포 독성 및 세포의 생존에 영향을 미치지 않았다되도록 하였다. 이 데이터는도 2에 표시하거나 부착 방식에 의해, 자기 분리에 의해 분리 가능한 단구의 비율의 평균을 제시 하였다. 생존 세포를 분리하는 날에 트리 판 블루 배제 방법을 사용하여 계산 하였다. 두 개의 분리 방법 사이 단핵구의 비교 %의 생존율은 두 그룹 사이의 차이가 통계적으로 유의하지 않았다 것으로 나타났습니다. 또한, 접착에 의해 분리 가능한 단구의 비율의 평균은 1.66 ± 91.75 %이고, 실용적인 단구의 비율의 평균 MAGN 의해 단리etic 분리는 2.75 ± 87.4 %이었다. 이들 생존 데이터는 적어도 3 개의 독립적 인 실험에서 평가되었다. 통계 중요성은 학생의 t-test를 이용하여 측정 하였다.
자기 분리에 의해 격리 된 단핵구 유래 세포는 준수 방법에 의해 획득 단핵구에서 유래 세포에 비해 세포 증식의 상당한 증가를보기
MTT 세포 증식을 측정하는 비색 분석을 사용 하였다. 살아있는 세포에 MTT의 황색 테트라 색상을 쉽게 분광 광도계를 사용하여 측정된다 자주색 포르 마잔으로 환원된다. 0.22 ± 0.02 대 자성 방법 : 0.38 ± 0도 3에 제시된 데이터는 0 일에서의 흡광도 증가 (접착 법에 의해 측정 한 단핵구 분리 모두 처리 7 일의 기간에 걸쳐 높은 세포 증식으로 이어질 것으로 보여0.02), 3 일 (부착 방법 : 0.02 ± 0.28, 자성에있어서 0.55 ± 0.05), 7 일 (부착 방법 : 0.36 ± 0.01, 0.66 ± 자기 = 0.006). 그러나, XTT 분석 달리 (데이터 미도시)에서, MTT 분석은 0 일째 (p = 0.003), 제 3 일에 접착 방식에 의해 취득 된 단핵구로부터 MDDCs에 비해 자기 분리에 의해 단리 단핵구로부터 MDDCs의 세포 증식에 상당한 증가를 보여 (P = 0.006)과 7 일 (p = 0.002). 세포 증식은 일 0, 3 (P = 0.003) 사이의 유의 한 차이 것으로 확인하고, 일 0 단핵 세포에서 MDDCs의 그룹 내 7 (P <0.001) 사이에 자기 분리를 통해 정제 하였다. 또한, (P = 0.008)로 정제 부착 단핵구에서 0 일 및 7 일에 MDDCs 간 세포의 증식에 유의 한 차이가 관찰되었다. MTT 분석은 세 가지 실험으로부터 얻은 MDDCs를 사용하여 수행 하였다. 통계적 유의성 승 0.05 ≤ ANOVA와 학생의 t-test를, 페이지를 사용하여 측정 하였다중요한 고려으로 유의 한 차이가 발견되지 않는 한, 및 P 값은 그래프에 설명되어 있습니다.
중 CD11c 및 CD14 세포 표면 염색에 의한 MDDCs의 특성
IL-4와 GM-CSF와 7 일 동안 단핵 세포를 배양 한 후, MDDCs가 준수 및 자기 분리 방법에 의해 고립 된 단핵 세포에서 얻은 그림 4 특징으로했다. 특성화는 두 가지 방법 낮은 단일 CD14 + / CD11c- 표현형 또는 순수 단핵구 인구를 밝혀, 0.0 높은 총의 CD11c + 표현형, 준수 = 72 % ± 1 = 자기 % 대 1.0 ± 준수는 = ± 1 % (19) 그러나, 총 CD14 + 인구가 추가로 분석했을 때, 높은 수율이 있었다 = 79 % 자기 대비 ± 11 중 CD11c 긍정적 인 더블 CD14의 높은 수를 나타내는 자기 분리와 두 방법에서의 CD11c과 CD14에 대한 이중 양성 세포인구 접착력 방법에 비해, 준수 = 49 % 자기 대 ± 7 = 73 % ±, MDDCs의 자기 분리, 긍정적 중 CD11c 및 CD14 부정적인 인구를 통해 이중 긍정적 인 표현형과 MDDCs의 높은 수율이 높은이었다 15. 있지만 접착력 방법에있어서; 도 4b에서 ± 7, 각각의 마커의 평균 형광 강도 (MFI)가 문이 인구를 보았고, CD14 + 인구에서 CD14의 높은 강도를 보였다 = 6 % 자기 대비 ± 7 준수 = 23 %, 모두 동등한 강도 이중 긍정적 인 인구의 CD11c + 및 CD14- 인구에서 높은하는 CD11c 강도의 CD11c 및 CD14. 요약하면, 자기 분리 아직 단핵구 마커 (CD14)를 적하하지 않은 초기 분화 MDDCs 수있다하는 CD11c + / CD14 + 세포의 높은 비율을 제공에도 부착 방법은 + / CD14-, CD11c 양성의 높은 비율을 제공하는 MDDC 인구 차별화 늦은 단계 일 수있다. 되어온에서이온은 DAPI 염색은 생존 결과를 확인하고 특성이 살아있는 MDDCs에서 수행되었다 있도록 하였다. DAPI 음 / 살아있는 세포의 비율 (준수 = 67 ± 1 = 자기 대 76 ± 7)없는 문화 칠일 후에 MDDCs의 생존에 영향을 미치지 않는 두 가지 방법을 확인하는 두 가지 방법 사이에 유의 한 차이가 있습니다.
자기 분리에 의해도 1 단핵구 수율 준수 방법에 의해 단핵구 수득 이상 비교된다. 단핵구의 약 6.2 %가 ~ 단핵구의 25 %는 자기 분리 방법을 사용하여 수득 하였다 동안 부착 방법을 사용하여 PBMC를 분리 하였다. 데이터는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SD로 나타낸다. 두 가지 방법을 비교했을 때 통계 분석을 사용하여 학생의 t-테스트는 단핵 세포 수율의 유의 한 차이를 보였다(P = 0 00005). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
단핵구 분리 준수에 의해 및 자기 분리에 의해 그림 2. 단핵구 생존에 영향을주지 않습니다. 준수하여 분리 가능한 단핵 세포의 비율의 평균은 1.66 ± 91.75 %이었고 자기 분리에 의해 분리 가능한 단핵 세포의 비율의 평균이었다 87.4 % ± 2.75. 데이터는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 생존 세포의 평균 ± SD 퍼센트로 표현된다. 모두 정제 방법을 비교할 때 유의 한 차이가 세포 생존에 관찰되지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
자기 분리에 의해 격리 된 단핵구에서 유래 그림 3. 세포 준수 방법에 의해 단핵구 획득 유래 세포에 비해 세포 증식의 상당한 증가를 표시합니다. 흡광도의 상당한 증가는 모두 3 일 및 7 일에 두 방법 모두에서 관찰 된 값을 비교할 때 두 가지 방법 (0.05 ≤ p)를 비교할 때 또한 일 0의 각각의 컨트롤에 대해, ANOVA와 학생의 t 테스트는 MTT 흡수의 흡광도에서 유의 한 차이를 보였다. 데이터는 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SD로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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다른 집단 (단일 세포에서 문 %)을 대표하는 CD11c 및 CD14 세포 표면 염색. A) 막대 그래프로 MDDCs 그림 4. 특성. 첫째, DAPI- (살아) 세포는 총 단일 세포 게이트 하였다. 그런 다음, CD14 + / CD11c-, 중 CD11c +를, 중 CD11c + / CD14 +와의 CD11c + / CD14-는 DAPI- (살아) 인구에서 문이되었다. 중 CD11c + 인구는 라벨이 지역의 CD11c + / CD14 +와의 CD11c + / CD14-. B) 세포의 모든 모집단. C) 세포의 대표 산포도에서의 CD11c과 CD14 모두 평균 형광 강도 (MFI) 값을 보여주는 대표적인 그래프의 요약입니다 자기와 부착 방법 모두 DAPI 마이너스 (살아) 세포 인구에 게이트의 CD11c-APC 및 CD14-APCcy7와. 게이트 셀의 각 하위 집단에 속하는 (캐터 플롯에서 파란색에서 선택) 단일 세포의 대표 이미지 갤러리, 중 CD11c + / CD14- (주황색 문)의 CD11c + / CD14 + (빨간색)과 CD14 + () 보라색 문. 단일 세포의 이미지 갤러리에서 붉은 색의 CD11c이 APC로 표지과 노란색 컬러가 APCcy7으로 표시 CD14를 나타냄. 스 캐터 플롯에서 인구 게이트에 선택한 색상은 랜덤이며, 실제 셀 이미지에 상관하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
단리 인간 혈액으로부터 MDDCs를 생성하는 알려진 문제에 기초하여, 본 연구는 MDDCs의 생성이 잘 확립 된 방법의 포괄적 인 비교를 제공하는 것을 목표로. 비교 첫 번째 방법은 유리 또는 플라스틱 (접착 방법) 21,22,27에 부착 단구의 능력을 이용하여 MDDCs을 생성하는 잘 정립 된 전통적인 방법이다. 접착력 방법은 빠르고 효과적인 비용 및 복잡한 장비의 사용을 요구하지 않는다. 그러나,이 방법의 단점은 림프구 오염, 낮은 유연성, 단핵구 과도 조작 22,30,31를 포함한다. 비교 2 대안 방법에 의해 음성 선별 된 PBMC로부터 단핵구를 분리하기 위해 디자인 된 인간 단핵구 농축 키트 (26)를 사용하여 전체 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단핵구를 자기 분리한다. 이 분리 방법의 장점은, 원하지 않는 셀이며표지와 표적 세포를 자유롭게 열 직접 항체로 세포를 표적으로하지 않고도 새로운 튜브 속으로 주입하면서 자석을 이용하여 분리된다. 상관없이 단핵 세포 분리 방법 (자기 분리 대 부착) 두 절차 후, 프로토콜 내의 중요한 단계 중 하나는 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자와 단핵 세포의 시험 관내 자극이다 (GM-CSF) 및 인터루킨 -4 ( MDDCs를 생성하는 데 필요한 IL-4). 이 항원 포획 미숙 MDDCs (32)의 처리 능력의 특성을 손상시키지 않고 혈액 단핵 세포에서 MDDCs를 생성하는 공통의 잘 확립 된 프로토콜이다. 일반적으로 수지상 세포의 시험 관내 생성에 사용 된 기술의 주요 한계들 중 하나는 단핵구와 같은 전구 세포의 낮은 수율이다. 위의보고 된 바와 같이, 부착 방법에 의해 고립 된 단핵구는 총 P의 약 6.2 %를 차지골수는 동안 자기 분리에 의해 격리 된 단핵 세포는 PBMC를 최대 25 %를 차지했다. 총 혈액 단핵 세포 (20)의 1 % - DC가 0.1을 구성하면서 10 % 31 - 문헌에 따르면, 2 내지 단핵구 정상 성인의 차등 백혈구위한 범위이다. 따라서, 자기 분리 후의 단핵 세포의 높은 수율 (~ 25 %) 세포 인구 및 원치 않는 세포에 결합하는 항체 및 / 또는 자성 입자의 부족의 불순물로 인해 수 있습니다.
분리 된 단핵 세포의 높은 수율 및 순도를 달성하기 위해, 프로토콜의 모든 중요한 단계 신중 따라야한다. 표준 밀도 구배 원심 분리에 의해 혈액으로부터 PBMC를 단리하는 동안 몇 가지 중요한 단계가있다. 먼저, 피펫 조심스럽게 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 밀도 구배 용액 위에 피 레이어링이 용액과 혈액의 혼합을 야기 할 수 가혹 피펫 때문에 연습을 필요로하는 공정이며,이는 분리하기 어렵다 약한 PBMC 층을 초래할 수 있거나, 한 PBMC와 적혈구의 완전한 혼합이 발생할 수있다. 이 단계에서, 혈액의 잘 정의 된 층과 구별 PBMC 층을 가지고 피펫의 일정하고 상대적으로 느린 흐름을 유지하는 것이 중요하다. 둘째, 가속 및 감속 1 0 다음 단계의 원심 분리는 매우 중요하다. 이러한 설정은 제 원심 분리 단계를 사용하지 않는 경우에는 불규칙 밀도 구배 용액과 혈액의 혼합을 초래할 것이고, 혈액 성분의 나머지로부터 분리 된 PBMC를하지 않을 것이다. 적혈구와 함께 가능한 한 PBMC의 감소로 이어질 수 ACK와 이상 배양 이후 - (15 분 10) 셋째, 최적화 된 시간보다 더 이상 버퍼를 용균 암모늄 - 염화 - 칼륨 (ACK)로 PBMC를 품어하는 것이 중요하다 . 또한, ACK 배양 후 PBS 세척을 실시하는 것도 중요하다. 그러나, 적혈구가 제에 용해되지 않으면ACK 단계 및 그들은 여전히 세척 후 계속 표시는 ACK의 용균의 또 다른 라운드는 것이 좋습니다.
백혈구 분리 한 후, 단핵 세포를 생성하는 준수 방법을 수행 할 때 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, PBMC를 배양 2 시간 후에 플로팅 림프구를 세척하는 부동 림프구의 존재가 덜 단핵구가 부착시킬 수 있으며, 하부 MDDC 순도 될 수 있기 때문에 매우 중요하다. 이러한 세척 단계가 중요 과도하고 가혹한 세척 있지만 (이상 권장보다, 즉, 두 번)보다 낮은 단핵구 수율의 결과로, 너무 부착 된 단핵 세포를 세척을 일으킬 수 있습니다. 사이토 카인은 MDDCs에 단핵구의 분화에 대한 책임 때문에 둘째, 완전 배지 및 사이토 카인으로 세포를 배양하는 것이 중요합니다. 게다가, 미디어를 변경하고 사이토 매 48 시간 보급하는 세포의 분화 및 생존에 중요. 미디어를 변화시키면서, 상기 부동 MDDCs 저장 및 분화 과정에서 표면으로부터 분리 할 수있는 MDDCs이 있기 때문에 새로운 미디어 및 사이토 카인과 함께 배양 다시 반납하는 것도 중요하다. 단핵구가 권장 농도로 접종 부착하고 성장하기 위해서는 그들이 세포 접촉에 셀을 필요로하기 때문에 근접하게 이격되어 있는지 또한 중요한 확인합니다. 단핵 세포를 생성하는 자기 분리 방법을 수행 할 때, 고 수율 및 고순도의 단핵구를 얻기 위하여 몇 가지 중요한 단계가있다. 첫째, 제조자가 권장하는 세포 농도를 유지하는 것이 중요하다. 자석에 배치 때 낮은 수율과 낮은 순도로 이어질 수 있으므로, 폴리스티렌 튜브를 방해하지에 중요하다. 위에서 제시된 바와 같이, 이러한 기술은, 다른 (C)의 존재에 관련 될 수있는 부착 방법에 비해 상당히 높은 단구 수율 (도 1), 리드ELL 학생. 세포를 유동 세포 계측법에 의해 특징 될 때 또한, 자성에있어서 인해 MDDC의 다른 단계의 존재를 다른 세포의 존재와 상관 관계가 좋고, 또한 수있다 이중 양성 세포 (중 CD11c + / CD14의 +)의 높은 퍼센트를 나타낸다 분화.
무관 수율 및 순도의 체외 MDDC 발생의 또 다른 중요한 측면은 생존 및 증식 MDDCs을 생성하는 능력이다. 본 연구는 문화 칠일 동안 세포 신진 대사 활동의 증가로 도시 된 바와 같이 두 정제 방법은 MDDCs (그림 3)의 증식을 유도을 입증하는 증거를 제공합니다. 또한, 자기 분리에 의해 정제 된 단핵 세포에서 MDDCs의 발생 증식 상당히 높은 레이트가 접착 (도 3)에 의해 정제하여 단핵구로부터 발생 MDDCs 비교 하였다. 이러한 결과는 g을 보여주는 이전 문헌에 따라 아르CD34 + 세포의 수지상의 eneration 인해 인간의 혈액 (27), (33)의 증식 DC 전구 세포의 존재에 증식 과정이다. 그러나, 단핵 세포는 증식 (34, 35)의 증거없이 수지상 세포로 분화 할 수 있음을 보여 논란이 연구 결과가있다. 이 수지상 세포의 시험 관내 생성에 대한 많은 논쟁이되고 수지상 세포가 증식 전구체 또는 단핵 세포의 분화로부터 생성되는지에 관한 것으로 이는 지적 적합하다. 예를 들어, 접착 성 말초 혈액 세포로부터 DC의 시험 관내 생산은 GM-CSF (27)에 노출 된 후에 증식 할 수 있으며 수지상 수율의 존재하에 유도 된 것을 보여주는 증거가 또한 존재 전구 세포 풍부 나타났다 GM-CSF 및 IL-4는 단핵구 (33)의 개시 번호를 넘어 확장 될 수 없다. 전반적으로, 본 연구는이 월의 증식을 증가 보여줍니다칠일에 의해> 70 %의 CD11c + 표현형과 총 MDDCs 인구가 발생할 문화 ocytic 세포 (준수 = 19 ± = 79 % 자기 대 72 % ± 11). 높은 더블 긍정적 인 표현형 (준수 = 49 %로 더 표현형 분석을 수행 할 때, 중요하지 않지만, 자기 분리 방법에 의해 고립 된 단핵구가 MDDCs으로 이어진 자기 = 73 % 대 ± 7의 CD11c + / CD14 + 지적 관련 ± 15의 CD11c + / CD14 +) 접착에 의해 고립 된 단핵구가 높은 하나의 긍정적 인 표현형 (준수 = 23 % 6 % = 자기 ± 7의 CD11c + / CD14-) 대비 ± 7의 CD11c + / CD14-와 MDDCs 결과있다. 높은 하나의 긍정적 인 표현형과 MDDCs 분화의 후반 단계에서 할 수있는 반면 높은 더블 긍정적 인 표현형 (중 CD11c + / CD14의 +)와 MDDCs는 분화의 초기 단계에서 할 수있다.
요약하면, 본 연구는 음의 선택 자기 분리 procedur 것을 지원하기 위해 증거를 제공부착 방법에 의해 고립 된 단핵구와 비교했을 때 단핵구를 분리하는 전자는 단핵 세포 생존 능력에 유의 한 차이 단핵 세포의 가장 높은 수율을 생성합니다. 차례로, 7 일 후에, 자기 분리에 의해 고립 된 단핵구는 MDDC 생존에 영향을주지 않고 상당히 높은 증식 능력과 더블 플러스 (중 CD11c + / CD14 +) 표현형을 발현하는 세포의 높은 양의 MDDCs로 분화. 두 가지 방법을 비교하면, 결과는 동시에 두 가지 방법이> 70 %의 CD11c + MDDCs을 산출하기 때문에 문화에서 7 일 후에하는 CD11c + MDDCs에 (그림 4) (그림 3) 증식 및 분화 할 수있는 단핵 세포를 생성하는 두 가지 기술의 능력을 증명하고있다 . 그러나 성숙 마커를보고 추가 분석이 완전히 기능 MDDC 인구의 특성을 유용 할 수 있습니다. 결론적으로, 두 방법 중 CD11c + MDDCs과 잠의 분리에 유리 대안은연구의 응용 프로그램에 대한 충분한 수율을 IDE, 심지어 미래의 임상 응용 프로그램에 유용 할 수있다. 이 연구소는 현재 MDDC 표현형과 기능을 수정하는 이러한 물질의 특히 능력, 알코올 남용 및 선천성 면역 시스템의 남용의 다른 물질의 효과를 연구하기 위해 MDDCs의 생성에 초점을 맞추고있다. 따라서, 현재의 연구는 MDDC 특성의 기준을 제공하고, 약물 남용과 관련하여 단핵구 유래 수지상 세포 기능을 매개하는 분자 메커니즘을 규명하기 위해 추가 실험을 진행할 수있는 능력을 향상시킬 것이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at RT |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
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