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Immunology and Infection

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Published: October 18, 2016 doi: 10.3791/54296
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

Introduction

As células dendríticas (CDs) são mediadores essenciais dos sistemas imunitários inato e adaptativo. Eles funcionam para induzir respostas imunitárias primárias e facilitar o desenvolvimento de memória imunológica. Estas células são os principais responsáveis para a captura de antígeno, migração e estimulação das células T e, portanto, são chamados de células apresentadoras de antígenos, como profissionais (APCs) 1 .Manipulation de DCs poderiam ser utilizados em uma ampla variedade de campos de pesquisa e na prática clínica para o tratamento diferente doenças inflamatórias, tais como o VIH 6,7, 8 cancro, doenças auto-imunes, 9 e 10 respostas alérgicas. DCs também estão sendo usados para a investigação de abuso de substâncias, a fim de resolver os mecanismos desconhecidos e vias, tais como aqueles associados à dependência de álcool 11-14, dependência de drogas 13,15, ea combinação de infecção e abuso de substâncias HIV 16-19. Estes estudos em curso e futuros estudos in campo da imunologia fazer na geração in vitro de DCs extremamente importante para a investigação. No entanto, existem várias dificuldades associadas com o isolamento de DC a partir do sangue humano como elas constituem apenas 0,1-1% do total de células mononucleares de sangue 20.

Até à data, alguns dos métodos bem estabelecidos para a geração de DC in vitro consiste em plástico ou vidro aderência de monócitos 21,22, centrifugação em gradiente de densidade de 23, a separação com base marcador específico, tais como triagem de células activadas magnética 22, triagem de células activadas fluorescentes 24, a selecção positiva de monócitos CD14 + utilizando nanopartículas magnéticas revestidas com dextrano 25, e isolamento rápido de monócitos altamente purificados através de selecção celular negativa totalmente automatizado 26. No entanto, o melhor método de escolha permanece controverso. Portanto, para melhorar as técnicas de geração de DC, vários métodos têm sido desenvolvidos nos quaiso grau de pureza destas células pode ser aumentada pela diferenciação de células progenitoras CD34 + purificadas e os monócitos isolados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) 27. Como mencionado antes, um método amplamente utilizado e popular para a geração de células dendríticas derivadas de monócitos (MDDCs) é explorar a capacidade dos monócitos para aderir ao vidro ou de plástico (método de aderência) 21,22,27. O método de aderência é um método rápido e simples que não requerem o uso de equipamento complexo. No entanto, algumas desvantagens deste processo incluem a contaminação de linfócitos, baixa flexibilidade, e monócitos manipulação transitória 28. Um método alternativo para o método de aderência é o isolamento magnético de monócitos a partir de PBMC totais, particularmente com o uso de um kit de enriquecimento de monócitos humanos, que se destina a isolar os monócitos a partir de PBMC por selecção negativa 26. Durante este procedimento, as células não desejadas são dirigidos para a remoção com tetraméricacomplexos de anticorpo e as partículas magnéticas revestidas com dextrano. A vantagem deste método de isolamento é que as células marcadas não desejados são separados usando um íman enquanto as células alvo podem ser vertida livremente fora para um novo tubo sem a necessidade de colunas. Até à data, com a disponibilidade de anticorpos monoclonais específicos que pode marcar populações de células únicas, a técnica de separação magnética tornou-se não só de um método adicional, mas também uma necessidade para o isolamento de células raras no campo da imunologia. Por exemplo, técnicas como a célula magnética triagem com paramagnéticas MACS-nanopartículas disponíveis comercialmente têm facilitado o desenvolvimento de novas abordagens para a investigação e aplicações clínicas 22,29. Além disso, estudos recentes que compararam geração de DC a partir de métodos de aderência de monócitos e tecnologia MACS têm demonstrado uma maior pureza DC e viabilidade usando MACS monócitos 22,30 separados.

Os presentes estudos atuaisuma comparação entre dois métodos para a geração de DC humanas a partir de monócitos isolados a partir de PBMC: 1) isolamento de monócitos por adesão e 2) isolamento de monócitos por selecção negativa utilizando um kit comercial de enriquecimento de monócitos humanos. Este estudo fornece evidências para mostrar que o processo de separação negativa selecção magnética para isolar monócitos gera o maior rendimento de monócitos com nenhuma diferença significativa na viabilidade de monócitos, quando comparados com os monócitos isolados pelo método de aderência. Por sua vez, depois de sete dias, os monócitos isolados por separação magnética diferenciada em MDDCs com significativamente maior capacidade proliferativa e maior quantidade de células que expressam duplo positivo (CD11c + / CD14 +) fenótipo sem afectar a viabilidade MDDC. No geral, o presente estudo difere dos estudos anteriores referidos acima, uma vez que demonstra a capacidade de ambas as técnicas para gerar, simultaneamente, os monócitos que são capazes de proliferar e de se diferenciar em CD11c +MDDCs (> 70%) após sete dias em cultura, sem comprometer a sua viabilidade. Além disso, a abordagem actual fornece pela primeira vez caracterização de diferentes populações CD11c / CD14 MDDCs por citometria de fluxo de imagem.

Em resumo, uma vez que as DCs desempenhar um papel central em relação à investigação no domínio da imunologia, diferentes parâmetros devem ser tomadas em consideração quando se considera como eles são derivados e métodos que são utilizados para isolar e cultivar-los in vitro. Portanto, este estudo tem como objetivo fornecer informações em dois métodos diferentes de isolamento de monócitos e como esses métodos afetam diferencialmente viabilidade de monócitos e de rendimento, eventualmente, afetar a viabilidade das células dendríticas, proliferação e fenótipo. Estes resultados irão contribuir significativamente para o campo da imunologia e irá proporcionar um protocolo detalhado de DC isolamento, purificação, e caracterização.

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Protocol

estudos de sangue humano em geral têm sido revistos e aprovados pelo Institutional Review Board (IRB) da FIU, o protocolo IRB aprovação # IRB-13-0440. leukopaks humanos foram adquiridos a partir do banco de sangue da comunidade em Miami, FL.

1. Isolamento de PBMC pela técnica de gradiente de densidade padrão

  1. Efectuar uma diluição de 1: 1 de sangue com solução salina 1x com fosfato tamponada num frasco T75.
  2. Pipetar 15 ml de solução de gradiente de densidade em 50 ml de tubos de centrífuga e cuidadosamente camada (25 - 30 ml / tubo) do sangue diluído ao longo deste gradiente.
  3. Centrifugar durante 20 minutos a 1200 xg, com uma aceleração e desaceleração do de 0.
  4. Após centrifugação, recolher a camada de interface (células brancas do sangue) em 50 ml de um novo tubo de centrífuga e lavar as células duas vezes em PBS (3 min a 1080 xg). Elimine o sobrenadante de cada vez.
  5. as células com tampão de lise de cloreto de amónio-potássio-(ACK) tratar (para lisar os glóbulos vermelhos). Adicionar 10 ml de tampão e emCubate durante 15 min a 4 ° C.
  6. Lavar as células duas vezes com PBS, centrifuga-se durante 3 min a 1080 xg e elimine o sobrenadante de cada vez.
  7. Guardar o sedimento, que conterá as PBMC.
  8. Proceda com método de purificação de monócitos de escolha.

2. Método de Monócitos A purificação por aderência

  1. Prepare meio de cultura celular completo, contendo L-glutamina (300 mg / ml) e suplementado com penicilina (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) e soro fetal bovino a 10%.
  2. Permitir PBMC a aderir durante cerca de 2 horas através da sua cultura num frasco de T75 a uma concentração de 5 x 10 7 células por 10 ml de meio completo a 37 ° C e 5% de CO2 num incubador humidificado.
  3. Após a incubação, remover as células flutuantes não aderentes da garrafa de cultura e lavar cuidadosamente as células aderentes duas vezes com PBS.
  4. Incubar as células aderentes no meio de cultura celular completo suplementado com 2 ul / ml de granulócitos humano-macrophage factor de estimulação de colónia (GM-CSF) e interleucina 4 (IL-4), armazenado a uma concentração de estoque de 10 jig / ml.
  5. Alterar a metade do meio e reabastecer citocinas cada 48 horas.
  6. Permitir 5 - 7 dias para a diferenciação de monócitos em MDDCs.

3. Método de Monócitos A purificação por separação magnética

  1. Recolhe CMSPs de técnica de gradiente de densidade padrão, verter para um tubo de poliestireno de 5 ml e re-suspensão em tampão de PBS a uma concentração de células / ml.
  2. Adicionar cocktail de enriquecimento de células de monócitos humanos utilizando 50 uL / ​​mL, misturar bem e incubar a 4 ° C durante 10 min.
  3. Após a incubação, adicionar partículas magnéticas, utilizando células 50 uL / ​​mL, misturar bem e incubar a 4 ° C durante 5 min.
  4. Trazer a suspensão celular até um volume total de 2,5 ml por adição de tampão PBS, misturar bem por pipetagem para cima e para baixo 2 - 3 vezes.
  5. Colocar o tubo de poliestireno sem uma tampa para o dispositivo magnético e deixada em repouso à TA durante dois0,5 min.
  6. Após a incubação e, em um movimento contínuo, pegar o imã e despeje a fração de monócitos purificado desejado em um 50 ml tubo de centrifugação limpo.
  7. Incubar as células aderentes no meio completo de cultura de células suplementado com 2 ul / ml de factor estimulante de colónias (GM-CSF) de granulócitos-macrófagos humanos e de interleucina 4 (IL-4), armazenado a uma concentração de estoque de 10 jig / ml.
  8. Cada 48 horas, mudar metade do meio, spin para baixo em 1080 xg durante 5 minutos e re-suspender pellet com as novas mídias (cRPMI) e citocinas.
  9. Permitir 5 - 7 dias para a diferenciação de monócitos em MDDCs.

4. Azul de Tripano ensaio de exclusão de Viabilidade

Nota: Use esta técnica para obter rendimento celular e viabilidade de PBMC, monócitos e MDDCs.

  1. Células colheita usando o padrão tripsina-EDTA e executar lavagens dos frascos e o sedimento de células utilizando PBS. Dependendo do tamanho do grânulo, resuspender em 5 a 10 ml de PBS para dissolver o sedimento.
  2. Num tubo de micro-centrifugação, efectuar uma diluição 1: 1 de reagente azul de tripano com sedimento celular diluído.
  3. A partir desta mistura, uma alíquota de 10 ul em uma célula de contagem corrediça e ler os resultados usando um contador de células automatizado de acordo com o protocolo do fabricante. Se um contador de células automatizado não está disponível, uma contagem de células semelhante é possível utilizando um hemocitómetro ou um contador manual.

Ensaio 5. MTT

  1. As células em placas a uma concentração de 4 x 10 4/100 ul de meio completo a cada poço numa placa de 96 poços. Permita 24 horas para as células a ajustar à cultura.
  2. Incubar e efectuar leituras a 0 (dia 0), 36 (dia 3) e 84 (dia 7) horas, respectivamente.
  3. No final da incubação desejado, remover a mídia e substituir com 100 ul de PBS sozinho.
  4. Preparar 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio solução de brometo (MTT) (5 mg / ml) por adição de 10 ml de dimethsulfóxido il (DMSO) a 1 g de sulfato de dodecilo de sódio (SDS).
  5. Adicionam-se 10 ul (5 mg / ml) de uma solução de MTT a cada poço e incubar a 37 ° C durante 2 horas adicionais.
  6. Após a incubação, remova sobrenadantes que contêm PBS e mistura MTT não convertidos (solução amarela-cor).
  7. Adicionar 100 ul de solução de SDS-DMSO a cada poço e incubar durante uma hora adicional.
  8. Ler a absorvância a 540 nm utilizando um leitor de microplacas.

6. Análise de Coloração da superfície celular por citometria de fluxo de imagem

  1. Após 7 dias de diferenciação de monócitos purificados, dispensar 1x10 6 alíquotas de células das células dendríticas derivadas de monócitos para o número apropriado de tubos de 1,5 ml.
  2. Comece a coloração da superfície celular por células de bloqueio, utilizando 50 ul de calor inactivados (HI) de soro humano, incubar a 4 ° C durante 10 min.
  3. Após a incubação, as células centrifugar a 720 xg durante 5 minutos, rejeitar o sobrenadante.
  4. A célula pellet, adicionar respectivos anticorpos fluorocromo-conjugados (por exemplo, anti-CD11c ou anti-CD14) e incubar a 4 ° C durante 20 minutos ao abrigo da luz. Em tubos separados, prepare individuais manchado de fluorocromos amostras / ml), uma vez que são necessários para a compensação.
  5. Após a incubação, lavar as células duas vezes com 1 ml de tampão PBS e centrifugação de cada vez a 720 xg durante 5 min.
  6. As células protegidas da luz Mantendo, re-suspender em tampão de PBS a uma concentração de células / 100 ul para análise de citometria de fluxo.
  7. A fim de porta em células viáveis, adicionar 1 ml de DAPI a cada tubo antes de adquirir as células no fluxo de imagens de células única citometria de instrumento de acordo com as instruções do fabricante.

7. Análise estatística

  1. Entrada de todos os dados em uma planilha.
  2. Comparar resultados utilizando t-teste do estudante e / ou one-way ANOVA, conforme apropriado.
  3. Considerar as diferenças estatisticamente significativas se p <0,05.

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Representative Results

Rendimento de monócitos por separação magnética é superior em comparação com monócitos Rendimento pelo Método A adesão

Os dados apresentados na Figura 1 PBMC exibição e as contagens de células de monócitos pelo método de exclusão de azul de tripano no dia do isolamento de PBMCs e separação de monócitos. Em média, os monócitos isolados pelo método de adesão responsáveis ​​por aproximadamente 6,2 por cento do total de PBMC enquanto monócitos isolados por separação magnética foi responsável por até 25 por cento de PBMCs. A análise estatística revelou que a percentagem de monócitos gerados por separação magnética foram significativamente mais elevados (≥ 4 vezes). Os dados são expressos como média ± DP de pelo menos três experiências independentes. A análise estatística usando t de Student -test mostrou uma diferença significativa de rendimento monócitos quando comparados os dois métodos (p ≤ 0,0005).

_content "fo: manter-together.within-page =" 1 "> monócitos Isolamento por adesão e por separação magnética não afetam monócitos Viabilidade

Após o isolamento de monócitos por as duas técnicas diferentes descritos acima, os ensaios de viabilidade foram realizados para assegurar que os métodos utilizados não eram citotóxicos e afectar a viabilidade das células. Os dados apresentados na Figura 2 mostram a média da percentagem de monócitos isolados viáveis por qualquer método de aderência ou por separação magnética. As células viáveis ​​foram contadas utilizando o método de exclusão de azul de tripano no dia do isolamento. Comparando percentagem de viabilidade de monócitos entre os dois métodos de isolamento revelou que a diferença entre os dois grupos não era estatisticamente significativa. Além disso, a média da percentagem de monócitos isolados viáveis ​​por adesão foi 91,75% ± 1,66 e a média da percentagem de monócitos isolados por viáveis ​​magnseparação etic foi 87,4% ± 2,75. Estes dados de viabilidade foram avaliadas a partir de pelo menos três experiências independentes. A significância estatística foi determinada utilizando o teste t de estudante.

Células derivadas de monócitos isolados por separação magnética mostram um aumento significativo na proliferação celular em comparação com células derivadas a partir de monócitos adquiridos pelo Método A aderência

MTT foi utilizado como um ensaio colorimétrico para medir a proliferação celular. Em células vivas, a cor amarela do tetrazole o MTT é reduzido a formazano púrpura, o qual é facilmente medido utilizando um espectrofotómetro. Os dados apresentados na Figura 3 demonstram que ambos os processos de isolamento de monócitos conduzir a proliferação celular mais elevada ao longo de um período de 7 dias como medido por um aumento na absorvância no dia 0 (método de aderência: 0,22 ± 0,02 vs método magnética: 0,38 ± 0.02), Dia método 3 (adesão: 0,28 ± 0,02, método magnética: Método de 0,55 ± 0,05) e no dia 7 (adesão: 0,36 ± 0,01, magnético = 0,66 ± 0,006). No entanto, ao contrário do ensaio de XTT (dados não mostrados), o ensaio de MTT revelou um aumento significativo na proliferação de células de MDDCs a partir de monócitos isolados por separação magnética em comparação com MDDCs de monócitos adquiridos pelo método de aderência no dia 0 (p = 0,003), dia 3 (p = 0,006), e 7 dias (p = 0,002). A proliferação celular foi também considerado significativamente diferente entre os dias 0 e 3 (p = 0,003), e entre os dias 0 e 7 (p <0,001) no grupo de MDDCs a partir de monócitos purificados através de separação magnética. Além disso, observou-se uma diferença significativa na proliferação celular entre o dia 0 e no dia 7 em MDDCs a partir de monócitos purificados por aderência (P = 0,008). ensaio de MTT foi realizado usando MDDCs adquiridos a partir de três experiências diferentes. A significância estatística foi determinada utilizando análise de variância e teste t de Student, P ≤ 0,05 wcomo considerado significativo, e valores de p são anotadas no gráfico, a menos que não houve significância estatística.

Caracterização de MDDCs por CD11c e CD14 coloração da superfície celular

Após cultura monócitos durante sete dias com IL-4 e GM-CSF, MDDCs obtido a partir de monócitos isolados por métodos de aderência e isolamento magnético foram caracterizados na Figura 4. A caracterização mostrou baixa única de CD14 + / fenótipo CD11c- ou população puramente monocítica em ambos os métodos, aderência = 1% ± 1,0 contra magnético = 1% ± 0,0 e alta CD11c total + fenótipo, aderência = 72% ± 11 contra magnético = 79% ± 19. no entanto, quando o CD14 total + população foi analisada mais, houve um rendimento elevado de células dupla positivas para CD11c e CD14 em ambos os métodos de separação magnética dando um maior número de CD11c e CD14 dupla positivapopulação quando comparado com o método de aderência, a aderência = 49% ± 7 versus magnética = 73% ± 15. Embora, houve um maior rendimento de MDDCs com fenótipo positivo dupla via de separação magnética, o CD11c positivo e negativo da população CD14 de MDDCs foi maior no método de aderência; aderência = 23% ± 7 versus magnética = 6% ± 7. Na Figura 4B, a intensidade média de fluorescência (MFI) de cada marcador individual foram olhou na população fechado e mostrou alta intensidade de CD14 em células CD14 + população, intensidade equivalente de ambos CD11c e CD14 em dobro população positiva e alta intensidade CD11c em CD11c + e CD14- população. Em resumo, embora o isolamento magnético dá uma maior percentagem de CD11c + / CD14 + células, o que pode ser palco diferenciado MDDCs primeiros que ainda não abandonaram o marcador monocítica (CD14), o método de adesão dá uma maior percentagem de CD11c + / CD14-, que pode ser uma fase tardia diferenciado população MDDC. em additião, coloração DAPI foi realizada para confirmar os resultados de viabilidade e para assegurar uma caracterização foi realizada em MDDCs vivo. A percentagem de DAPI negativo / células vivas (aderência = 76 ± 7 versus magnética = 67 ± 1) não são significativamente diferentes entre os dois métodos confirmando ambos os métodos não afetam a viabilidade das MDDCs após sete dias de cultura.

figura 1
Figura 1. Rendimento de monócitos por separação magnética é superior em comparação com Monócitos Rendimento pelo Método A aderência. Cerca de 6,2% de monócitos foram isolados a partir de PBMC utilizando o método de aderência, enquanto ~ 25% de monócitos foram obtidas usando o método de separação magnética. Os dados são expressos como média ± DP de pelo menos três experiências independentes. t-teste estatístico análise utilizando aluno mostrou uma diferença significativa de rendimento monócitos quando comparados os dois métodos(p = 0. 00005). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Isolamento de monócitos por adesão e por separação magnética não afectam Monócitos Viabilidade. A média da percentagem de monócitos isolados viáveis por adesão foi 91,75% ± 1,66 e a média da percentagem de monócitos isolados viáveis por separação magnética era de 87,4% ± 2.75. Os dados são expressos como média ± DP percentagem de células viáveis ​​de pelo menos três experiências independentes. Não foi observada diferença significativa na viabilidade celular quando comparados os dois métodos de purificação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Células derivadas a partir de monócitos isolados por separação magnética mostram um aumento significativo na proliferação celular em comparação com células derivadas a partir de monócitos Adquirida pelo Método A adesão. Um aumento significativo de absorvância foi observado para ambos os métodos em ambos os dias 3 e 7 dias quando se comparam os valores contra os seus respectivos controles de dia 0. Além disso, análise de variância e teste t de estudante também mostrou uma diferença significativa na absorção de captação MTT quando comparados os dois métodos (p ≤ 0,05). Os dados são expressos como média ± DP de três experiências independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. Caracterização dos MDDCs por CD11c e gráfico A) Bar CD14 coloração celular Surface. Representando as diferentes populações (% fechado para fora das células individuais). Primeiro, as células vivas (DAPI-) foram fechado a partir de células individuais no total. Em seguida, células CD14 + / CD11c-, CD11c +, CD11c + / CD14 + e CD11c + / CD14- foram fechado de DAPI- (viva) população. CD11c + população é o somatório das duas regiões CD11c + / CD14 + e CD11c + / CD14-. B) gráficos representativos que mostram a intensidade de fluorescência média (IFM) valores tanto para CD11c e CD14 em cada subpopulação de células. C) diagramas de dispersão representativas de células marcadas com CD11c-APC e CD14-APCcy7 fechado na população de células DAPI negativo (vivo) para ambos os métodos magnéticos e de aderência. galeria de imagem representativa de células individuais (selecionada em azul nos gráficos de dispersão) pertencentes a cada sub-população de células, CD11c + / CD14- (fechado em laranja), CD11c + / CD14 + (fechadoem vermelho), e CD14 + (fechado em roxo). Na galeria de imagem de células individuais, a cor vermelha representa CD11c marcado com APC e cor amarela representa CD14 marcado com APCcy7. Nos gráficos de dispersão, as cores escolhidas para a porta das populações são aleatórios e não se correlacionam com as imagens de células reais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Com base nas dificuldades conhecidas de isolar e gerando MDDCs de sangue humano, o presente estudo teve como objetivo fornecer uma comparação global dos dois métodos bem estabelecidos para a geração de MDDCs. O primeiro método de comparação é um método tradicional bem estabelecida para gerar MDDCs, explorando a capacidade dos monócitos para aderir ao vidro ou de plástico (método de aderência) 21,22,27. O método de aderência é rápido e de baixo custo, e não requer o uso de equipamento complexo. No entanto, algumas desvantagens deste processo incluem a contaminação de linfócitos, baixa flexibilidade, monócitos transiente 22,30,31 manipulação. O segundo método alternativo é comparado o isolamento magnético de monócitos a partir de sangue total de células mononucleares periféricas (PBMC), utilizando um kit de enriquecimento de monócitos humanos 26, o qual está concebido para isolar os monócitos a partir de PBMC por selecção negativa. A vantagem deste método de isolamento é que as células não desejadassão etiquetados e separados utilizando um íman, enquanto as células alvo são vertida livremente fora para um novo tubo sem a necessidade de colunas e sem atacar directamente as células com anticorpos. Independentemente do método de isolamento de monócitos (aderente contra a separação magnética), depois de ambos os processos, um dos passos críticos dentro do protocolo é a estimulação in vitro de monócitos com granulócitos macrófagos factor de estimulação de colónia de (GM-CSF) e interleucina-4 ( IL-4), os quais são necessários para gerar MDDCs. Este é um protocolo comum e bem estabelecida para gerar MDDCs a partir de células mononucleares do sangue sem comprometer a captura de antigénio e característica capacidade de processamento de 32 MDDCs imaturos. Uma das principais limitações das técnicas vulgarmente utilizadas para a geração in vitro de DCs é o baixo rendimento de células precursoras, tais como os monócitos. Como relatado acima, monócitos isolados pelo método de adesão responsáveis ​​por aproximadamente 6,2 por cento do total PBMCs, enquanto monócitos isolados por separação magnética foi responsável por até 25 por cento de PBMCs. De acordo com a literatura, varia para a contagem de glóbulos brancos diferencial em adultos normais para monócitos é 2-10%, enquanto as DCs 31 constituem apenas 0,1-1% do total de células mononucleares de sangue 20. Por isso, o elevado rendimento de monócitos (~ 25%), obtido após o isolamento magnético poderia ser devido a impurezas de população de células e falta de anticorpo e / ou de partículas magnéticas de ligação para células não desejadas.

Para conseguir um alto rendimento e pureza dos monócitos isolados, todas as etapas críticas do protocolo deve ser cuidadosamente seguido. Durante o isolamento de PBMCs a partir do sangue por centrifugação com gradiente de densidade padrão, existem alguns passos críticos. Em primeiro lugar, pipetagem e cuidadosamente camadas de sangue sobre a solução do gradiente de densidade em 50 ml tubos de centrífuga é um passo que requer prática desde pipetando duramente pode causar a mistura desta solução e sangue,o que pode levar a uma camada de PBMC fraca que é difícil de isolar, ou pode resultar na mistura total de células vermelhas do sangue com PBMC. Neste passo, é importante para manter um fluxo constante e relativamente lenta de pipetagem para ter uma camada bem definida de sangue e uma camada distinta de PBMC. Em segundo lugar, a centrifugação no passo seguinte com uma aceleração e desaceleração 0 é muito crítico. Se estas configurações não são usados ​​para o primeiro passo de centrifugação, que irá conduzir a mistura de sangue com a solução do gradiente de densidade de forma irregular e não se separará as CMSPs do resto dos componentes do sangue. Em terceiro lugar, é importante para incubar as PBMC com amónio-cloro e potássio (ACK) de tampão de lise por não mais do que o tempo optimizado (10 - 15 min) uma vez que mais de incubação com ACK pode levar à redução de PBMC viáveis, juntamente com as células vermelhas do sangue . Além disso, é também importante para a realização das lavagens com PBS após incubação ACK. No entanto, se as células vermelhas do sangue não são lisadas com o primeiroACK passo e eles ainda continuam a aparecer depois de lavagens, uma nova rodada de lise ACK é altamente recomendado.

Após o isolamento de células brancas do sangue, existem alguns passos críticos para manter em mente quando se realiza o método de adesão para gerar monócitos. Em primeiro lugar, lavando os linfócitos flutuantes após duas horas de incubação de PBMC é muito importante uma vez que a presença de linfócitos flutuantes podem causar menos monócitos aderir e podem também resultar em menor pureza MDDC. Embora esses passos de lavagem são críticos, e excessivo de lavar dura (mais do que o recomendado, ou seja, duas vezes) pode causar a lavagem da monócitos aderentes demais, resultando em menor rendimento de monócitos. Em segundo lugar, incubação das células com meio completo e citocinas é crítica uma vez que as citoquinas são responsáveis ​​para a diferenciação de monócitos em MDDCs. Além, mudando meios e repondo as citocinas cada 48 horas é importante para a diferenciação e sobrevivência das células. Enquanto mudar de mídia, é também crucial para salvar as MDDCs flutuantes e devolvê-los de volta para a cultura junto com meios frescos e citocinas uma vez que existem algumas MDDCs que podem desprendem da superfície durante o processo de diferenciação. É também importante ter a certeza de que os monócitos são semeadas a concentração recomendada, ligado e estreitamente espaçadas porque precisam de célula para célula de contacto, a fim de crescer. Ao realizar o método de separação magnética para gerar monócitos, existem alguns passos críticos, a fim de obter um bom rendimento e elevada pureza de monócitos. Primeiro, é essencial para manter a concentração de células recomendado pelo fabricante. Também é importante para não perturbar o tubo de poliestireno quando colocado no íman, pois pode levar a uma menor rendimento e menor pureza. Como apresentado acima, esta técnica conduz a um rendimento significativamente mais elevado de monócitos (Figura 1) quando comparado com o método de aderência, o que pode estar relacionado com a presença de outro Cells. Além disso, quando as células foram caracterizadas por citometria de fluxo, o método magnética mostra uma percentagem mais elevada de células duplamente positivas (CD11c + / CD14 +), o qual pode estar correlacionada com a presença de outras células ou pode ser também devido à presença de diferentes fases de MDDC diferenciação.

Outro aspecto importante da geração in vitro MDDC independentemente de rendimento e pureza, é a capacidade de gerar MDDCs viáveis e proliferativas. O estudo actual fornece evidência para demonstrar que ambos os métodos de purificação de induzir a proliferação de MDDCs (Figura 3), como mostrado pelo aumento da actividade metabólica de células durante sete dias em cultura. Além disso, a geração de MDDCs a partir de monócitos purificados através de separação magnética mostraram uma taxa significativamente mais alta de proliferação para comparar MDDCs geradas a partir de monócitos purificados por adesão (Figura 3). Esses achados estão de acordo com a literatura anterior demonstrando que generation de DC a partir de células CD34 + é um processo proliferativo, devido à presença de progenitores de DC proliferativas no sangue humano 27, 33. No entanto, existem resultados controversos, demonstrando que os monócitos também podem se diferenciar em DCs sem qualquer evidência de proliferação 34,35. É relevante salientar que há muita controvérsia sobre a geração in vitro de DCs e sobre se DCs são gerados a partir de precursores de proliferação ou a partir de diferenciação de monócitos. Por exemplo, a produção in vitro de DC a partir de células do sangue periférico aderentes foram mostrados para também o enriquecimento em células progenitoras que são capazes de proliferação após a exposição ao GM-CSF 27 e também há provas que demonstram que o rendimento de DCs derivadas, na presença de GM-CSF e IL-4 não pode ser expandido para além do número de monócitos de partida 33. No geral, o presente estudo demonstra um aumento na proliferação de monocytic células em cultura que, por sete dias resultar numa população total de MDDCs com> 70% CD11c + fenótipo (aderência = 72% ± 11 contra magnético = 79% ± 19). É importante salientar que, quando uma análise mais aprofundada fenotípica foi realizada, embora não significativa, os monócitos isolados pelo método de separação magnética resultou em MDDCs com um fenótipo positivo superior duplo (aderência = 49% ± 7 CD11c + / CD14 + em relação magnética = 73% ± 15 CD11c + / CD14 +), enquanto que os monócitos isolados por aderência resultou em MDDCs com um fenótipo superior único positivo (aderência = 23% ± 7 CD11c + / CD14- contra magnético = 6% ± 7 CD11c + / CD14-). MDDCs com maior fenótipo positivo duplo (CD11c + / CD14 +) podem estar sob estágios iniciais de diferenciação, enquanto MDDCs com um fenótipo positivo simples superior pode estar sob últimos estágios de diferenciação.

Em resumo, este estudo fornece evidência para suportar que a seleção negativa separação magnética procedure para isolar os monócitos gera o rendimento mais elevado de monócitos com nenhuma diferença significativa na viabilidade de monócitos quando comparada com monócitos isolados pelo método de aderência. Por sua vez, depois de sete dias, os monócitos isolados por separação magnética diferenciada em MDDCs com significativamente maior capacidade proliferativa e maior quantidade de células que expressam duplo positivo (CD11c + / CD14 +) fenótipo sem afectar a viabilidade MDDC. Ao comparar os dois métodos, os resultados demonstraram a capacidade de ambas as técnicas para gerar, simultaneamente, os monócitos que são capazes de proliferar (Figura 3) e de diferenciação (Figura 4) para CD11c + MDDCs após sete dias de cultura uma vez que ambos os métodos produziram> 70% CD11c + MDDCs . No entanto, uma análise mais aprofundada olhar para marcadores de maturação pode ser útil para caracterizar plenamente a população MDDC funcional. Em conclusão, ambos os métodos são alternativas vantajosas para o isolamento de MDDCs CD11c + e provide um rendimento adequado para aplicações de pesquisa e pode até ser útil para aplicações clínicas futuras. O laboratório está concentrado na geração de MDDCs para estudar os efeitos do abuso de álcool e outras substâncias de abuso no sistema imune inato, em particular a capacidade dessas substâncias para modificar MDDC fenótipo e função. Por conseguinte, o estudo irá fornecer uma linha de base de caracterização MDDC e melhorar a capacidade para avançar com a experimentação, a fim de elucidar os mecanismos moleculares que medeiam a função de células dendríticas derivadas de monócitos no contexto de abuso de substâncias.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-5442-03 Must be used at RT
Phosphate-buffered saline (PBS) Life Technologies 10010-023
ACK Lysing buffer Quality Biological 118-156-101
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240-062
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000-044
RoboSep buffer StemCell 20104
EasySep Human monocyte enrichment kit StemCell 19059
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0101
FITC-Dextran Sigma Aldrich FD4-100MG
Trypan blue stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Synergy 2 multi-mode reader Biotek 7131000
XTT Sodium salt bioreagent (XTT) Sigma Aldrich X4626-100MG
Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) Sigma Aldrich D8418-500ML
Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) Sigma Aldrich m5655-500MG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0302
Phenazine Methosulfate (DMSO) Sigma Aldrich P9626-1G
Inactivated (HI) Human Serum Chemicon S1-100ML
Accuri C6 Flow Cytometer BD Accuri 653119
FlowSight Amnis Flow Cytometer EMD Millipore 100300

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