Summary
Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir.
Abstract
Bakteriler sıklıkla pH değişiklikleri, sıcaklık, redoks durumu, ışığa maruz kalma veya mekanik güç gibi çevresel değişikliklere maruz kalır. Bu durumların çoğu hücrede açılımı proteini neden organizmanın sağkalım üzerine olumsuz etkisi vardır. olmayan, stres-özel moleküler şaperonlar bir grup, bu stres koşullarında hayatta kalması gerekli roller oynadığı gösterilmiştir. Tamamen katlanmış ve hastabakıcı-inaktif stres önce, bu proteinler hızla açılmak ve spesifik stres koşulları altında hastabakıcı aktif hale iken. Bir kez bu koşullu düzensiz şaperonlar farklı toplama eğilimli proteinin çok sayıda bağlanan, aktive edilmiş, bunların birarada toplanmasını önlemek ve, ya doğrudan ya da dolaylı olarak non-stres koşullarına dönüş üzerine yeniden katlama proteini kolaylaştırır. onların aktivasyonu ve müşteri tanıma mekanizması hakkında daha ayrıntılı bir anlayış kazanıyor için birincil yaklaşım arınma ve subsequen içerirnitro şaperon deneyler kullanılarak bu proteinlerin t karakterizasyonu. In vivo stres deneyleri takip bağımsız in vitro sonuçlar elde onaylamak için kesinlikle gereklidir.
Bu protokol, E. şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için in vitro ve in vivo yöntemlere tarif E. coli HdeB bir asit aktive şaperon. Işık saçılım ölçümleri, in vitro olarak, kurulu bir modeli istemci protein, MDH asit ile indüklenen, toplanmayı önlemek için HdeB kapasitesi için uygun bir okuma olarak kullanılmıştır. Analitik Ultrasantrifügasyon deneyleri non-stres koşullarına döndükten sonra müşteri proteinlerin kaderi içine ışık tutacak, HdeB ve müşteri protein LDH arasındaki karmaşık oluşumunu ortaya çıkarmak için uygulanmıştır. Müşteri proteinlerin enzimatik aktivite deneyleri pH kaynaklı müşteri inaktivasyonu ve reaktivasyon üzerinde HdeB etkilerini izlemek için yapılmıştır. Son olarak, hayatta kalma çalışmaları için kullanılmıştır monitoin vivo HdeB en şaperon fonksiyonunun etkisini r.
Introduction
Mikrobiyal patojenler asit kaynaklı protein elinde tutmasına koşulları tecrübe edildiği bir ortak doğal çevre olan asidik pH gıda kaynaklı patojenler 1 karşı etkili bir bariyer görevi görür memeli mide (pH aralığı 1-4) 'dir. Amino asit yan zinciri protonasyon nedeniyle protein açılması ve agregasyonu, biyolojik süreçleri, zarar hücresel yapıları etkileyen ve en sonunda hücre ölümüne 1,2 neden olur. Bakteriyel periplazmaya pH nedeniyle gözenekli dış zar boyunca proton serbest difüzyonuna neredeyse aynı anda, çevre pH dengeye için, Gram-negatif bakterilerin periplazmik ve iç membran proteinleri asit, gerilimli şartlar altında 3 en hassas hücre bileşenleri bulunmaktadır. Hızlı asit aracılı olduğu hasarlara karşı gösterdikleri periplazmik Proteomun korumak için, Gram-negatif bakteriler asit ile aktive edilmiş periplazmik şaperonlar HdeA ve HdeB kullanmaktadır. HdeA bir şartlı bozukluğu şaperonudur
Burada yer alan protokol vivo 10 in vitro ve in HdeB pH bağımlı şaperon etkinliğini izlemek için izin diğer şaperonlar araştırmak için uygulanabilirHsp31 gibi. Seçenek olarak ise, hdeAB ifadesini kontrol transkripsiyon faktörleri karmaşık ağ potansiyel in vivo gerilme testi ile araştırılabilir. In vivo olarak, proteinlerin şaperon işlevini karakterize etmek için, farklı deney düzenekleri uygulanabilmektedir. Birinci yol proteinin açılımı stres koşullar uygulanır ve fenotipik iki ilgili geni aşırı ifade eden ya da genin bir silme taşıyan mutant türünü nitelendirilmesidir. Proteomik çalışmalar chaperone mevcut olduğu zaman, gerilimli şartlar altında, toplam artık bu proteinleri belirlemek için yapılabilir, ya da belirli bir enzimin bir şaperon etkisi Enzimatik 14-16 kullanılarak stres şartlarında belirlenebilir. Bu çalışmada, tüm büyük E. ekspresyonunu kontrol RpoH ısı şoku sigma faktörü 32. yoksun bir rpoH delesyon suşu içinde HdeB aşın tercih E. coli chaperones ve silme sens arttırdığı bilinmektedirprotein 15 açılımı neden olan çevresel stres koşullarına iTivity. HdeB in vivo şaperon aktivitesi Δ rpoH soyunun pH duyarlılığı bastırmak için kabiliyetini izleyerek tespit edilmiştir. Özet olarak, burada sunulan protokoller in vitro hem de in vivo bağlamında bir asit ile aktive edilmiş cinsten aktivitesinin karakterize edilmesi için hızlı ve basit bir yaklaşım sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekspresyonu ve periplazmik HdeB saflaştırılması
Not: HdeB E. ifade edildi polimiksin lizizi sonrasında periplazma plazmid pTrc- hdeB 10 ve saflaştırılmış barındıran E. coli hücreleri.
- E. bir gecede kültürü hazırlayın 200 ug / ml ampisilin (LB Amp) içeren 30 ml LB plazmidden pTrc- hdeB 10 barındıran E. coli hücreleri. 0.7 OD 600nm ulaşılana kadar LB Amp dört adet 1 L kültürlerinin aşılanması ve 37 ° C 'de büyümek ve 200 rpm'de. Daha sonra, HdeB ifadesinin sağlanması ve 30 ° C'ye kadar bir büyüme sıcaklığı azaltmak için 300 uM IPTG ilave edin.
- 30 ° C'de protein ekspresyonu 5 saat sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüj ile hücreler hasat edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 8000 x g'de Hücreler tekrar A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCI, pH 7.5) ve santrifüj ml tampon 100 hücre pelletini yıkayın.
- Daha sonra, tekrar süspansiyon80 hücre peleti mi, 1 mg / ml polimiksin sülfat içeren bir tampon. Dış membran etkin bozulması için, hafifçe 4 ° C 'de 1 saat süre ile süspansiyon karıştırılmıştır.
- sitoplazmik bölümünü ve hücre artıkları çıkarmak için 4 ° C'de 15,000 x g'de 20 dakika süre ile süspansiyon santrifüj. Bu ~ çözünür HdeB ihtiva eden 60 ml süpernatant sonuçlanır.
- 6 kDa MW bir diyaliz membranı kullanılarak B tamponu (20 mM Tris / HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0) 150X birim karşı gece boyunca periplazmik özü ihtiva eden üst sıvıyı Dialyze cut-off. 3 kDa'lık bir molekül ağırlığı kesmesi olan santrifüj filtre birimleri kullanarak 15 ml proteinleri konsantre edilir. 0.2 mikron gözenek filtre kullanarak protein çözüm Filtre.
- 2.5 ml / dakika bir akış oranı ile 5 kolon hacmi tampon B ile dengelenmiş olan bir anyon değiştirme kromatografisi kolonuna (kolon hacmi 5 mi) üzerine protein uygulanır. Protein kolonuna yüklenir sonra, 10 dakika ile için tampon B ile sütun yıkama/ Dakika 2.5 ml'lik bir akış oranı. 2.5 mL / dakika 6 bir akış oranı ile 50 dakika arasında bir zaman süresi içinde tampon B içinde 0.5 M NaCI, 0 ila bir doğrusal gradyan ile elüte HdeB.
- % 15 SDS-PAGE kullanılarak HdeB ihtiva eden fraksiyonlar tanımlar. 5 ul 5x indirgenmiş SDS yükleme tamponu ile 20 ul örnek karıştırın. Yük 10 jel üzerine ul Tris-glisin tamponu (14.4 g / L glisin, 2.9 g / L Tris, 1 g / L sodyum dodesil sülfat, pH 8.3) 'de çalışır. Bromophenol bant jel (~ 45 dk) tabanına yakın göç kadar 150 V jel çalıştırın.
- Havuz Tüm HdeB içeren fraksiyonlar, 4 L HdeB depolama tamponuna karşı gece boyunca 4 ° C'de diyalize (50 mM Tris / HCI, 200 mM NaCI, pH 8.0) ve bir moleküler ağırlığa sahip santrifüj filtre birimleri kullanılarak, yaklaşık 300 uM proteini konsantresi cut-off 3 kDa. Sönümleme katsayısı ε 280nm = 15595 M kullanılarak 280 nm'de HdeB konsantrasyonunu belirlemek -1 cm -1. 100 ul hacimde ve flaş ücretsiz hazırlayınsıvı azotta ze.
Not: HdeB en az 6 ay boyunca -70 ° C 'de muhafaza edilebilir.
2. Şaperon Aktivite Deneyi Malat Dehidrogenaz Unfolding Termal Kullanma (MDH)
Not: termal farklı pH değerlerinde domuz mitokondriyal malat dehidrojenaz (MDH) açılma agregasyonu üzerinde saflaştırıldı HdeB etkisi aşağıda tarif edildiği gibi gözlenmiştir. Listelenen tüm protein konsantrasyonları monomer konsantrasyonunun bakın.
- MDH hazırlanması için, bir gece boyunca 4 L tampon C (50 mM potasyum fosfat, 50 mM NaCI, pH 7.5) karşı 4 ° C'de diyaliz MDH ve 30 arasında bir molekül ağırlığı kesmesi olan santrifüj filtre birimleri kullanılarak, yaklaşık 100 um proteini konsantresi kDa.
NOT: MDH amonyum sülfat çözeltisi olarak teslim edilir olarak MDH dikkatli diyaliz gereklidir. - birikimlerin çıkması için, 4 ° C'de 20,000 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj protein. ε <(280 nm'de absorbans ile MDH konsantrasyonunu belirleyinalt> 280 nm = 7,950 M-1 cm-1). MDH 50 ul hacimde hazırlayın ve depolama için alikotları flaş dondurma.
- Sıcaklık kontrollü numune tutucu ve bir karıştırıcı ile donatılmış bir floresan spektrofotometrede 1 ml kuartz küvet yerleştirin. Set λ eski / em 350 nm.
- küvete ve ayarlamak için: (pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0 ve pH 5.0 buradan) istenen pH değerlerinde önceden ısıtılmış (43 ° C) tampon D (150 mM potasyum fosfat, 150 mM NaCl), uygun hacimleri ekleme 43 ° C'ye kadar bir küvet taşıyıcısına sıcaklık. toplam hacmi 1000 ml.
- 0.5 uM MDH ilave edildi tampon 12.5 uM HdeB (ya da seçenek olarak bir tampon kontrol HdeB depolama, aynı hacimde tampon) ekleyin. ışık saçılması izleme başlayın. MDH açılma yeterli olacak şekilde 360 saniye boyunca reaksiyon inkübe edin.
- HPO 4 2 M tamponsuz K 2 0,16-0,34 hacmi eklenerek 7 pH değerini arttırmak ve yeniden devamBaşka bir 440 sn için ışık saçılması Cording.
- nötralizasyon sonra belli bir zaman noktasında hastabakıcı yokluğunda kaydedilen MDH agregasyon derecesini ayarlamak% 100 (burada MDH maksimal ışık saçılması gözlendi 500 saniye sonra). Her belirtilen pH değeri HdeB yokluğunda MDH ışık saçılması sinyaline HdeB etkinliğini normalleştirmek.
Analitik Ultrasantrifügasyon tarafından HdeB-LDH Kompleks Oluşumunun 3. Algılama (AUC)
Not: HdeB tek başına ya da termik olarak laktat dehidrojenaz (LDH) açılma ile kompleks içinde çökelme hızı deneyleri analitik ultrasantrifüj kullanılarak yapıldı.
- 4 L tampon C (50 mM potasyum fosfat, 50 mM NaCI, pH 7.5) karşı bir gece boyunca 4 ° C 'de LDH diyaliz, LDH hazırlanması ve 30 arasında bir molekül ağırlığı kesmesi olan santrifüj filtre birimleri kullanılarak, yaklaşık 200 uM protein yoğunlaştırmak kDa.
NOT: LDH dikkatli diyaliz LD olarak gereklidirH, amonyum sülfat solüsyon olarak iletilir. - 4 ° C'de 20,000 x g'de 20 dakika süre ile agrega santrifüj LDH kaldırın. 280 nm'de absorbans ile LDH konsantrasyonunu belirlemek (ε 280 nm = 43.680 M-1 cm-1). LDH 50 ul hacimde hazırlayın ve depolama için alikotları flaş dondurma.
- 41 ° C'de 15 dakika süre ile tampon D 30 uM HdeB varlığında ve yokluğunda (sırasıyla pH 4 ve 7), 3 uM LDH inkübe edin.
Not: komple agregasyonda yükseltilmiş sıcaklıkta LDH inkübasyon ve HdeB hiç şaperon etkisi gözlemlenebilir. - Numuneler oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Sonra, standart sektörünü içeren hücrelerin içine yük numuneleri 1.2 cm uzunluğunda bulunan 2 kanallı centerpieces şeklinde. ultrasantrifüjdeki içine hücreleri yükleyin ve önceki çökelme, en az 1 saat boyunca 22 ° C'ye kadar dengeye getirin.
- Sıkma 22 ° C 'de numuneler, 12 saat süre ile, ilgili rotor 167.000 x g ve sed izlemekSürekli 280 nm'de protein imentation. Daha önce gösterildiği gibi, her kanalın geçen ışık şiddeti Absorbans yerine ölçüldüğü zaman, sinyal gürültü oranı artırıldı. Bu, daha sonra veri uydurma kalitesini arttırır.
- Sürekli c (ler) dağıtım modeli 17 kullanılarak, SEDFIT (sürüm 15.01b 2015 Aralık) veri analizi yapıyoruz. Nasıl SEDFIT kullanmayı anlatan bir öğretici referans 18 bulunabilir.
- 0,7 ME (Maksimum Entropi) regularization için güven seviyesini ayarlayın.
- SEDNTERP 19 kullanılarak tampon yoğunluğunu yanı sıra viskoziteyi hesaplayın. , Toplu müşteri protein miktarını tahmin referans olarak pH 7 pH 4'te tortulaşmış LDH integral karşılaştırmak için.
NOT: sedimantasyon dağılımın Entegrasyon SEDFIT doğrudan yapılabilir. Sedimantasyon hızı verilerini analiz etmek için alternatif bir yazılım son inceleme 20 bulunabilir. </ Li>
HdeB Varlığında 4. İzleme MDH inaktivasyonu ve Yeniden
Not: pH katlanmamış MDH yeniden katlanması ile saflaştınldı HdeB etkisi nötralizasyondan sonra MDH faaliyeti gözlenerek belirlenmiştir.
- ya da yokluğunda 25 uM HdeB mevcudiyetinde 37 ° C 'de, 1 saat boyunca (pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0 ve pH 5.0 buradan) istenen pH değerlerinde tampon D 1 uM MDH inkübe edin. Daha sonra, 10 dakika boyunca 20 ° C'ye kadar bir sıcaklık geçişi.
Not: MDH 37 ° C'den daha yüksek sıcaklıklarda kuluçkaya zaman Resim MDH yeniden katlama da HdeB mevcudiyetinde gözlenmiştir. - Asit denatüre MDH yeniden katlanması başlatma 0.5 M sodyum fosfat, pH 8.0 0,13-0,42 hacminin ilavesiyle pH 7'ye örnekleri etkisiz hale getirir.
- 20 ° C 'de 2 saat süre ile inkübasyondan sonra, 340 nm 9'da NADH düşüş gözlenerek MDH aktivitesi belirlenir.
NOT: MDH L-malat içine oksaloasetat ve NADH bağımlı bir azalma katalize eder.
Not: Deney tamponunda MDH nihai konsantrasyon 44 nM olması gerekir. - 20 ° C olarak ayarlanmış bir Peltier sıcaklık kontrol bloğu ile donatılmış bir spektrofotometre kullanılarak absorbans değişikliği, izleyin.
- pH 7.0 tutuldu 44 nM yerli MDH için MDH aktivitesi göreli bildirin.
E. tarihinde HdeB aşırı ifadesinin 5. Etkisi Asit Stres altında coli Survival
NOT: E. E. coli MG1655 genomik DNA yayınlanmış bir protokol 21 kullanılarak izole edilmiştir.
- E. hdeB yükseltin BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT ve hdeB - - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C. PCR primerleri hdeB kullanarak coli MG1655
- Aşağıdaki şekilde 50 ul PCR reaksiyonu başlatacak: 10 ul 5x polimeraz tamponu, 200 uM dNTP, 0.5 uM primer JUD2, 0.5 uM primer JUD5, 150 ng genomik DNA, MG1655, 0.5 ul DNA polimeraz, GKD 2 O 50 ul ekle.
- Şöyle hdeB amplifikasyonunu yapmak: Aşama 1: 95 ° C, 1 döngü, 5 dakika; Adım 2: 95 ° C'de 30 saniye, 55 ° C'de 30 saniye, 72 ° C, 40 döngü 30 saniye; Aşama 3: 72 ° C'de 10 dakika.
- Sınırlama mevkisi klonlama için, standart yöntemler kullanılarak plazmid pBAD18 EcoR I ve BamH I bölgeleri içine PCR fragmanı elde Klon. üreticinin talimatlarına uygun olarak bir plazmid arındırma kiti kullanılarak plazmid saflaştırılır. Sıralama 10 ile sonuçlanan plazmid doğrulayın.
- HdeB veya zorlanma BB7224 içine boş vektör kontrolü pBAD18 (Δ rpoH) (genotip ifade plazmid Dönüşümü: F - λ - e14 - [araD139] B / r [6 (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (FRUK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-fimE) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: TN 10 (Tc S) suhX401 deoC1 Arad + rpoH :: kan +; 16) kimyasal yetkili hücreleri kullanılarak.
NOT: Bu gerginlik ısıya duyarlı olduğunu. - 45 saniye 42 ° C'de ısı şoku ve önceki kaplama için Sonra, 30 ° C ve 200 rpm'de inkübe hücreleri. Pozitif klonların tek bir koloni çizgi-çıkışları gerçekleştirin ve gece boyunca 30 ° C kuluçkaya yatmaktadır. 50 mi LB Amp bir gece boyunca kültür Hazırlama 200 rpm ve 30 ° C 'de hücrelerin kültive edilmesi.
- Bir gecelik kültürler 25 mi LB Amp 40. kat seyreltilir ve HdeB protein ifadesini uyarmak üzere 30 ° C ve bir OD 600 Nm 200 rpm = 1.0, 0.5,% arabinoz (ARA) mevcudiyetinde bakterilerin yetiştirilmesi.
- pH değişim deneyler için, LB kullanmakAmp + Ara 0.5 OD 600Nm hücreleri sulandırmak ve (burada: pH 2.0, pH 3.0 ve pH 4.0) ilgili pH değerlerine ayarlamak için 5 M HCl uygun hacimleri ekleyerek.
- Belirtilen zaman noktalarında (pH 3, 2.5 dakika; pH 2, 1 dakika, pH 4, 30 dakika) sonra, 5 M NaOH uygun hacimleri ilave edilerek kültürleri nötralize eder.
- OD ölçümleri kullanılarak, 30 ° C'de 12 saat süre ile sıvı kültürde etkisiz hale kültürlerin büyümesini izlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HdeA ve HdeB E. homologdur asit stres koşulları 10 karşı periplazmik proteinlerin korumak için bilinen E. coli proteinleri. Çalışmalarımız bir asit moleküler koruyucuya aktif olarak HdeA benzer HdeB da işlev ortaya koydu. Bununla birlikte, potansiyel olarak bakteri ama HdeA 6,9,10,22 optimum pH değeri önemli ölçüde daha yüksek olan bir pH değerinde HdeA, HdeB işlevleri tersine. In vitro HdeB en şaperon aktivitesinin pH optimumu araştırmak için, yerel MDH HdeB varlığında ya da yokluğunda belirtilen pH önceden ısıtılmış (43 ° C) tampon içinde seyreltilmiştir. inkübasyondan 360 saniye sonra, kuluçka Reaksiyon nötralize edildi. Bu nötralizasyon, 43 ° C'de 9 de MDH agregasyonunu tetikler. Örnek sonuçlar HdeB yokluğunda MDH ışık saçılım sinyali nedeniyle MDH agregasyonu nötrleştirme sırasında büyük ölçüde arttırdığını göstermektedir (Şekil 1, blHer pH bildirim hattı). HdeB varlığında, ışık saçılım sinyali anlamlı HdeB MDH (Şekil 1, pH 4 ve pH 5) agregasyonunu engeller gösteren, pH 4 ve pH 5 ile nötralizasyondan sonra azaltılır. Buna karşın, pH 2 ve pH 3 ila nötralizasyondan sonra, MDH hızlı HdeB en şaperon aktivitesi için optimum pH olduğunu gösteren HdeB (Şekil 1, pH değeri 2 ve pH 3) varlığı veya yokluğu bağımsız olarak aynı ölçüde agrega HdeB saklama tamponu 4 pH arasında ve 5 pH 4'te HdeB mevcudiyetinde MDH azaltılmış ışık saçılması sinyali, şaperon işlevi nedeniyle olduğuna işaret MDH toplama (Şekil 1, geçici bellek kontrol) üzerinde herhangi bir etki. HdeA pH 2-3 de monomerik ve açık bir halde aktif şaperon ancak en veya pH 4 ila 10 daha yüksek bir faaliyet gösterir. Bu sonuçlar, HdeB pH 4 ila 10 etrafında uygun şaperon aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir.
t = "Şekil 1" src = "/ files / ftp_upload / 54527 / 54527fig1.jpg" />
Şekil 1:., Asidik pH'da HdeB bir şaperon aktivitesi 0.5 uM MDH, 43 ° C de ya da yokluğunda 360 saniye boyunca 12,5 uM HdeB mevcudiyetinde belirtilen pH değerinde önceden ısıtılmış tampon D inkübe edildi. Numunelerin pH değeri 0,16-0,34 hacim 2M tamponsuz K ilavesinden 2 HPO 4'e göre (yıldız işareti ile gösterilir) pH 7'ye yükseltildi, MDH agregasyon 350 nm'de gözlenmiştir ışık saçma ile ek bir 440 sn için ölçülmüştür nötr pH (mavi arka plan). Şekil başlangıçta Biological Chemistry dergisinde yayımlanan Dahl ve ark. 10 .Bu araştırma değiştirilir. Dahl JU, Koldewey P, Somon L, Horowitz S, Bardwell JC, bakterilerde bir asit koruyucu refakatçi olarak Jakob U. HdeB fonksiyonları. J. Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Telif Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society.s / ftp_upload / 54527 / 54527fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
diğer istemci proteinlerle de HdeB formları kararlı kompleksler, 3 uM LDH termal farklı pH koşullarında varlığında ya da 30 uM HdeB yokluğunda 41 ° C'de katlanmamış olup olmadığını gidermek için. Analitik ultrasantrifüj, bu örneklerin sedimentasyon davranışının analizi 22 ° C 'de yürütülmüştür. LDH, HdeB pH 7 ve 41 ° C'de birlikte inkübe edildi LDH özel tetramerik (120 kDa'lık bir moleküler ağırlığa) kalmış ve HdeB dimerik kalmıştır. Bu sonuçlar, proteinler, pH 7 stabil kompleksler oluşturmaz göstermiştir ve LDH 41 ° C'de (Şekil 2, yeşil hat) bir 20 dakika inkübasyondan sonra oligomerizasyonu herhangi geri dönüşü olmayan değişiklikler uğramaz. Benzer şekilde, HdeB gösteren 41 ° C ve pH 4.0 inkübasyon üzerine dimerik kaldığı düşük pH kuluçkaHdeB bile ısı şok koşullarında (Şekil 2, kırmızı çizgi) altında oligomerizasyon durumunu etkilemez evi. LDH İlk tarama (sağ üst köşede yer alan Şekil 2) Kaydedilmiş önce LDH'nin% 40 tortulaşmış olması ile gösterildiği gibi hızlı bir şekilde birleştirilmiş HdeB yokluğunda, pH 4, 41 ° C de inkübe. Kalan LDH monomer (Şekil 2, mavi çizgi) ağırlıklı olarak çöktürmek ortaya çıktı. Bunun aksine, pH 4 ile 41 ° C 'de LDH ve HdeB kuluçka 134 kDa bir molekül ağırlığına sahip yeni bir tür oluşturan iki protein için birlikte tortu (HdeB-LDH C) büyük bir kısmı neden oldu. Bu tür büyük olasılıkla HdeB dimerleri ve termal açılımı LDH arasında bir kompleks temsil eder. Ayrıca, HdeB mevcudiyetinde önce çökelme hiçbir önemli LDH çekiş eden in vitro agregasyon ölçümleri ile uyumlu biçimde gözlenmiştir. Bu sonuçlar, HdeB bölgesindeki şaperon aktivitesi göstermişlerdir onunpH 4.0 dimerik formu. Bu monomerik formda aktif şaperonudur HdeA, taban tabana zıttır. Bu pH 4 ve pH 7 arasında yapısal yeniden tabi sağlar HdeB çok dinamik yapısı HdeB en şaperon fonksiyonu 10 aktivasyonu için olası yeterlidir.
Şekil 2:. Analitik ultra-santrifüj ile pH 4'te HdeB ve katlanmamış LDH arasındaki kompleks oluşumunun saptanması 3 uM LDH tampon D, 15 dakika boyunca (150 mM KHPO 4, 150 mM NaCl) ve 10-molar fazlası HdeB mevcudiyetinde kuluçkalanmıştır pH 7 (yeşil hat) ya da 41 ° C veya pH 4 (siyah çizgi). Karşılaştırma için, LDH, tek başına (mavi çizgi) ya da tek başına HdeB (kırmızı çizgi) LDH, 4. Analitik ultrasantrifügasyon sedimantasyon hızının HdeB stokiyometri belirlemek için kullanılmıştır pH 41 ° C'de 15 dakika inkübe edildi, ve kompleks HdeB arasında oluşturulan ve dif de LDHferent pH koşulları. (Sağ üst köşede belirtildiği gibi) pH 4'te ve HdeB yokluğunda kuluçkaya zaman ilk tarama öncesinde toplanmış o ~% 40 LDH unutmayın. sedimantasyon katsayısı dağıtım arsa olduğunu göstermiştir (c (ler)) programı SEDFIT kullanılarak analiz edildi. Harfler, sırasıyla LDH veya HdeB ilgili oligomerik durumunu belirtir: HdeB D, HdeB dimer; LDH M, LDH monomer LDH t, LDH tetrameri; HdeB-LDH Cı HdeB-LDH kompleksi. Şekil Dahl ve ark. 10 modifiye edilir. Bu araştırma aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Dahl JU, Koldewey P, Somon L, Horowitz S, Bardwell JC, bakterilerde bir asit koruyucu refakatçi olarak Jakob U. HdeB fonksiyonları. J. Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Telif Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society. Ver bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sion.
HdeB nötralizasyondan sonra istemci proteinlerinin yeniden katlanmasını destekler olmadığını test etmek için, pH denatüre MDH yeniden katlanması üzerine HdeB etkisi analiz edildi. Termal denatüre MDH HdeB varlığında veya yokluğunda, farklı pH değerlerinde inkübe edildi. düşük pH inkübasyondan sonra, pH (ki MDH yeniden katlanmasını başlatır) ile nötralize edildi ve MDH aktivitesi 2 saat sonra tespit edilmiştir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, MDH önemli yeniden aktive HdeB mevcudiyetinde pH 4 ile nötralizasyondan sonra elde edildi. HdeB düşük pH inkübasyon yok oldu hiçbir MDH aktivitesi belirlendi.
Şekil 3: HdeB asit yeniden katlama enzimatik olarak aktif duruma MDH denatüre kolaylaştırır 1 uM MDH ya da yokluğunda, p 37 ° C 'de, 1 saat boyunca belirtilen bir pH değerinde tampon D inkübe edildi.25 uM HdeB bölgesinin resence. Numuneler, 0.5 M Na-2 ilave HPO 4 ile pH 7'ye nötralize edilmiştir önce Daha sonra, sıcaklık 10 dakika boyunca 20 ° C'ye kadar kaydırılmıştır. Alikotlar, 20 ° C 'de inkübasyon 2 saat sonra alındı ve MDH aktivitesi için analiz edilmiştir. yokluğunda (beyaz çubuklar) veya HdeB varlığında (siyah çubuklar) nötralizasyondan sonra MDH aktivitesi gösterilmiştir. en az 3 bağımsız ölçümlerinden elde edilen standart sapma gösterilmektedir. Şekil Dahl ve ark. 10 modifiye edilir. Bu araştırma aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Dahl JU, Koldewey P, Somon L, Horowitz S, Bardwell JC, bakterilerde bir asit koruyucu refakatçi olarak Jakob U. HdeB fonksiyonları. J. Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Telif Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society. Bu büyük halini görmek için tıklayınızrakam.
İn vitro veriler, HdeB, pH 4'te, farklı bir model istemci proteinleri bağlayan bunların birleşmesini önler ve bir kez nötral pH koşulları yüklenir yeniden katlama istemci kolaylaştırdığı ortaya koymuştur. In vivo HdeB etkilerini araştırmak için, pH değerine bağımlı kalma tahlillerinde, sıcaklığa duyarlı rpoH delesyon suşu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu soy en şaperonlar sahip değildir ve bu nedenle, yüksek sıcaklık, düşük pH veya oksidatif stres 15 karşı daha hassastır. Nötr pH koşulları altında HdeB aşırı ekspresyonu, boş vektör pBAD18 (Şekil 4, tedavi edilmemiş) barındıran kontrol suşu nispeten iyi büyümüş soyun büyüme hızı üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir. Tersine, yetenekleri açısından belirgin bir fark tespit düşük pH Akne tedavi edici gelen tekrarlanabilir geliştirilmiş kurtarma gösteren HdeB fazla sentezleyen suşu pH 3 veya pH 4 tedaviden sonra büyüme devamkontrol suşu daha tment. İn vitro veriler, aksine, bununla birlikte, HdeB varlığı da pH dimerlerin doğru HdeB oligomerizasyon durumunu da kayabilir bu hücrede HdeB yüksek konsantrasyonu nedeniyle olabilir pH 3 önemli ölçüde koruyucu bir etki vardı hücreler nereye pH 4 9,10,22 inkübe anlamlı öldürme gözlenirken pH 2 veya pH 3'e hücrelerin değişen, çok hızlı ve son derece toksik etkileri sonuçlandı 3. Not.
Şekil 4: HdeB E. korur asidik pH karşı coli. HdeB (kırmızı daireler), 30 ° C'de% 0.5 arabinoz mevcudiyetinde BB7224 (Δ rpoH) aşırı eksprese edildi. boş vektör pBAD18 barındıran BB7224 hücreleri kontrol (siyah daireler) olarak kullanılmıştır. Sol üst paneli hem st büyümesini gösterir30 ° C 'de yağmur, pH 7 Hücreler, 2.5 dakika, pH 3 (sol alt panel) ya da 30 dakika sonra da, 5 M HCI eklenerek belirtilen pH kaydırılır ve pH 2 (üst sağ panel), 1 dakika süreyle inkübe edildi pH 4 (sağ paneli alt). Daha sonra kültürler, 5 M NaOH, uygun hacimleri ilave edilerek nötralize edildi ve büyüme 30 ° C 'de sıvı ortamda izlenmiştir. Şekil Dahl ve ark. 10 modifiye edilir. Bu araştırma aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Dahl JU, Koldewey P, Somon L, Horowitz S, Bardwell JC, bakterilerde bir asit koruyucu refakatçi olarak Jakob U. HdeB fonksiyonları. J. Biol Chem. 2015, 290 (1): 65-75. doi: 10,1074 / jbc.M114.612986. Telif Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
aktivasyonu ve HdeB bir şaperon fonksiyonu mekanizmasını araştırmak için, HdeB büyük miktarlarda ifade edilmiş ve saflaştırılmış gerekir. sentezleme vektör sistemleri bir dizi bu çalışmada kullanılmıştır, her ikisi de pTrc ya pBAD vektörleri de dahil olmak üzere, bir hedef proteinin yüksek seviyeleri üretimi için kullanılabilir. Destekleyiciler E. için kolayca erişilebilir E. coli RNA polimerazı ve bir E. HdeB böylece güçlü yukarı regüle getirilmesine olanak tanıyan ifade coli suşu. Bu yönü rpoH -açıklı suşu kullanılmıştır asit stres koşulları altında HdeB in vivo aşırı çalışma için özellikle uygundur. Bu soy şaperonlar en yoksun ve böylece yüksek bir sıcaklıkta, düşük pH ve oksidatif stres 15 dahil olmak üzere çeşitli stres, karşı daha duyarlıdır. alternatif olarak, hayatta kalma ilgili geni eksik mutant yapılabilir Burada sunulan benzeyen inceler.
t "> bir şaperon aktivitesi için deney tasarımı ve tekrar katlama deneyi müşteri türü, istemci protein konsantrasyonu ve tampon koşulları açısından hem de, dikkatli bir şekilde dikkate alınmalıdır. Bu gibi tipik şaperon deneyleri, model alıcı proteinlerden, içinde sitrat sintaz, lusiferaz veya malat dehidrojenaz üre veya guanidin-HCl, yüksek konsantrasyonlarda denatüre ve agregasyonu 23,13 indükleme denatüran içermeyen tampon içerisinde seyreltilir. şaperonlar mevcudiyetinde ölçümler, proteinin agregasyonunu önlemek için derecesini yansıtmaktadır. Alternatif olarak, müşteriler, termal olarak katlanmamış ve protein birikimini Her iki durumda da, ışık saçılım ölçümleri, protein agregasyonu için, okuma çıktısı olarak kullanılır. izlenir. Aktif şaperonlar ve böylece ışık saçılım sinyali 6 bir azalmaya neden client proteinlerin ortaya konma toplanmasını önler. hem bu deney düzeneğinde, düşük pH inkübasyon ile kombine edilebilir. ek olarak mol değerlendirilmesineBelirli bir istemci protein agregasyonunu önleme kabiliyetlerini izleyerek ecular şaperon aktivitesi olmayan stres koşullarına dönüş üzerine, istemci yeniden katlanma ile şaperonlar etkisi 24 test edilebilir. İstemci proteinler inaktivasyonu ve yeniden aktivasyonu için niceliksel okuma olarak kullanılabilir enzimatik aktiviteye sahip olduğunda özellikle basittir. Şaperon aracılı yeniden katlama doğal olarak ATP-bağımlı bir işlem olduğu halde, örneğin HdeA, HdeB ve ajan olarak periplazmik şaperonlar periplasmasında 9,25 enerji eksikliği ile tutarlıdır bir ATP-bağımsız bir şekilde yeniden katlama istemci kolaylaştırmak için gösterilmiştir.Bu HdeB gibi bir asit koruyucu hastabakıcı pH optimumu incelenmesi çeşitli nedenlerden dolayı zordur: sitrat sentetaz bile köklü şaperon müşterili proteinlerinin (I) 'in agregasyonu davranışları asidik pH değerinde farklıdır; ve (ii) sadece birkaç tampon sistemleri 2-5 arasındaki bir pH aralığında çalışır ve kendine olanilgi hastabakıcı ve müşteri protein hem de tablo. Biz bu asidik pH koşulları altında ideal olmayan tampon sistemi farkında olmasına rağmen, fosfat tamponu ile sahada. Bununla birlikte, fosfat tamponu asit aktive hastabakıcı 9,22 olarak HdeA karakterize etmek için çok uygundur olduğu bulunmuştur. Toplama ölçümleri sıcaklık ya da tampon içeriğinde değişikliklere karşı çok duyarlıdır. Yalancı pozitif sonuçlar ortadan kaldırmak için, biz bu nedenle her zaman müşteri toplama üzerinde hastabakıcı depolama tampon etkisi (Şekil 1, tampon kontrolü) test etmek önerilir. Bazen müşteri protein agregasyonu bile en iyi hastabakıcı toplama süreci ile rekabet edebilecek olmayabilir o kadar hızlı gerçekleşir. Optimal tahlil koşulları bulmak için ön testler yapmak için elzemdir. Böyle bir durum için iyi bir örnek> 42 ° C arasındaki sıcaklıklarda LDH inkübasyon çok hızlı olduğu bizim ultrasantrifügasyon deneyler verilmiştir bileHdeB ilişkin bir fazlalığın mevcudiyeti LDH toplanmasını engellemez. Buna ek olarak, şaperon / birlikte-hastabakıcı oranı ve şaperon / müşteri oranı dikkatle 23 belirlenmelidir. Ön deneylerde 1 ve HdeB bir hastabakıcı faaliyeti için en uygun pH pH değeri 4 belirlenmesinde bize yardımcı: 50 MDH oranı: Biz oldukça yüksek HdeB kullanmaya başladı. En etkili oranının, 1: 25, belirleme pH 4 1: 1 ve 50: 1 arasında MDH oranı: Daha sonra HdeB analiz etmiştir. Bunun aksine, HdeA 10 olarak MDH toplama bastırılır: 1 koruyucuya: İstemci oranları 6,9,10,22. istemci oranları tamamen MDH toplanmasını bastırmak için yeterli idi: Böylece, HdeA, HdeB göre, alt hastabakıcı olarak MDH toplanmasını bastırılması daha etkili olduğu sonucuna varıldı. Protein agregasyonu şaperon aracılı bastırılması araştırmak için başka bir yaklaşım, bir dönüş yavaşlatma deneyleri, istemci agregalar, santrifüj işlemiyle çıkarıldı ve SDS-PAGE ile ölçülmüştür edildiği içerir. Bu yaklaşım, ayrıca m uygundurin vivo protein agregasyonu üzerine şaperonlar etkisini onitoring. Ya aşın veya ilgi koruyucuya eksikliği mutant suşlar, protein açılımı stres koşullarına maruz kalırlar. Daha sonra hücreler parçalanır ve çözünen ve birleştirilmiş fraksiyonlar ayrıldı ve 15,16,26 nicelendirilir.
istemci hastabakıcı kompleksinin saptanması için, analitik ultrasantrifüj uygulanır. Her iki proteinler 280 nm'de absorbe gibi, deney düzeneği dayalı doğrudan bu komplekse bağlı HdeB miktarı ve LDH monomerleri ölçmek mümkün olmadığı burada not edilmelidir. Arzu edildiği takdirde, şaperon müşterili kompleksinin stoikiometrisinin ayrı olan uyarılma maksimumuna görülebilir aralığı içinde uzanan bir kromofor ile koruyucuya ve müşteri protein etiketleme belirlenebilir. Seçenek olarak ise, kompleksler içindeki şaperonlar istemcilerin stokiyometri olarak niceliksel Western lekesiyle ile birlikte yerel PAGE kullanılarak belirlenebilir. Burada sunulan protokolleri takip ederek, biz iki moleküler şaperonlar, HdeA ve HdeB 9,10,22 karakterize başardık. Genel olarak, bu deneyler, in vitro ve in vivo olarak, protein yeniden katlanma moleküler şaperonlar potansiyel önleyicileri rolünü araştırmak için de kullanılabilir veya asit stres altındaki müşteri agregasyonunu önleme yetenekleri sentetik şaperonlar test etmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, burada sunulan protokoller aktivasyon mekanizması ışık tutmak amacıyla nokta mutasyonları ve / veya asit ile aktive edilmiş şaperonlar kesik varyantları analizler için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz Refakatçi deneyleri onu yararlı tavsiyeler Dr. Claudia Cremers teşekkür ederim. Ken Wan HdeB saflaştırma onun teknik yardım için kabul edilmektedir. Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından sağlanan bir doktora sonrası araştırma bursu ile desteklenmektedir (JCAB için) Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve JCAB ve UJJ-UD Sağlık hibe RO1 GM102829 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEB10-beta E. coli cells | New England Biolabs | C3019I | |
| Ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-3 | |
| LB Broth mix, Lennox | LAB Express | 3003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Tris | Amresco | 0826-5kg | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Polymyxin B sulfate | ICN Biomedicals Inc. | 100565 | |
| 0.2 µm pore sterile Syringe Filter | Corning | 431218 | |
| HiTrap Q HP (CV 5 ml) | GE Healthcare Life Sciences | 17-1153-01 | |
| Mini-Protean TGX, 15% | Bio-Rad | 4561046 | |
| Malate dehydrogenase (MDH) | Roche | 10127914001 | |
| Potassium phosphate (Monobasic) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| F-4500 fluorescence spectrophotometer | Hitachi | FL25 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126-5G | |
| NADH | Sigma | N8129-100MG | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9390-2.5KG | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S397-500 | |
| Lactate dehydrogenase (LDH) | Roche | 10127230001 | |
| Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392764 | |
| Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled | Beckman Coulter | 306493 | |
| AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| Wizard Plus Miniprep Kit | Promega | A1470 | used for plasmid purification (Protocol 5.1) |
| L-arabinose | Gold Biotechnology | A-300-500 | |
| Glycine | DOT Scientific Inc | DSG36050-1000 | |
| Fluorescence Cell cuvette | Hellma Analytics | 119004F-10-40 | |
| Oligonucleotides | Invitrogen | ||
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP set | Invitrogen | 10297018 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL | Millipore | UFC900324 | |
| Centrifuge Avanti J-26XPI | Beckman Coulter | 393127 | |
| Varian Cary 50 spectrophotometer | Agilent Tech | ||
| Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa | Spectrum Laboratories | 132650 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K | Millipore | UFC803024 | |
| SDS | Fisher Scientific | bp166-500 | |
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher | 4375786 |
References
- Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
- Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
- Bardwell, J. C. A., Jakob, U.
- Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).
- Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).
- Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
- Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).
- Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).
- Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).
- Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).
- Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
- Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
- Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).
- Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).
- Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).
- Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. , Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
- Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. , Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
- Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
- Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A.
- Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
- Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).
- Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
- Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
