Summary
アスリートは毎年数百の軽度の外傷性脳傷害（mTBI）/脳震盪を吸収する。しかし、これらの脳への帰結はあまり理解されていません。したがって、臨床的に関連する症状を一貫して複製する単一および反復mTBIの動物モデルは、mTBIおよび脳震盪の研究を進める手段を提供する。
Abstract
軽度の外傷性脳傷害（mTBI）は、混乱期、意識消失（LOC）、局所神経学的障害および記憶喪失を含む脳機能の急激な喪失をもたらし得る。接触スポーツに参加している選手は、多数のmTBIに曝される危険性が高い。スポーツ競技者の怪我のレベルでは、mTBIは肉眼的病理学的変化を引き起こさない軽度の傷害として定義されるが、自発的に解決される短期間の神経学的欠損を引き起こす。マウスおよびラットにおいてmTBIをモデル化するこれまでの試みにもかかわらず、多くの者が、頭蓋骨骨折、大脳内出血、軸索損傷および神経細胞死を含む総有害作用を報告している。本明細書では、臨床的に関連する症状を再現するmTBIの再現性の高い動物モデルを記載する。このモデルでは、カスタムメイド製の空気式衝撃装置を使用して閉鎖頭部外傷を提供しています。この衝撃は、正確な速度および変形パラメータの下で行われ、単一または反復的な脳卒中mTBIの効果に寄与するメカニズムを調べるための信頼性の高い再現性のあるモデルを作成します。
Introduction
外傷性脳傷害（TBI）は、外部の物理的な力から持続される頭部外傷として定義され、正常な脳機能の破壊をもたらす。これは、疾病予防予防センター（The Disease Control and Prevention Center）2015年の報告書によると、毎年250万人のアメリカ人が毎年TBIを維持していると推定して、社会経済的および公衆衛生上の重大な負担となっています。これは、患者の生活の質に影響を与えるだけでなく、現在、年間765億ドルと推定される、コミュニティに非常に高い経済的費用をかける。実際の脳損傷の量および急性期の症状は、軽度、中等度および重度のTBIを定義するものである。
脳震盪とも呼ばれる軽度の外傷性脳傷害（mTBI）は、毎年報告されているTBIの70％以上を占めています1 。ボクシングやサッカーを含むハイリスクの接触スポーツに参加する選手の間で最も一般的です。中等度とは異なりまたは重度のTBIの場合、mTBIに伴う即時の傷害および症状は時には顕著ではない3 。対照的に、mTBIの長期的な効果は、中等度および重度の形態で見られるものと同様に衰弱させることができます。反復性mTBIに苦しむ人々は、慢性的な外傷性脳症（CTE）ならびに他の認知および変性疾患を発症することが示されている4 。したがって、mTBI後に起こる短期症状や全体的な長期的な損傷に寄与するメカニズムをより深く理解することが重要です。
人間の場合、スポーツにおける脳震盪に関する第4回国際会議（チューリッヒ2012） 5で定義された脳震盪の定義は、スポーツ脳震盪の軽度のレベルは軽度であり、肉眼的病理学的変化を引き起こさないが、短期間の神経学的欠損自発的に解決されます。実際、受信者nt研究は、頭部衝撃遠隔測定システムを用いて、高校サッカー選手における認知障害に対するmTBIの効果を調べた。この調査では、1シーズンで20グラムを超えるヘルメットインパクトをプレイヤーが持続した回数が、最低226（平均4.7セッション）から最高1855（平均38.6 /セッション6 ）の範囲であった6 。これらの影響の大部分は、脳震盪の臨床診断をもたらさなかった。 fMRI 6を用いて脳機能の機能的変化の証拠を観察することができた。これらの機能的変化を引き起こす脳の変化は未知であり、したがって、脳震盪および副作用のあるmTBIの効果の研究を容易にするための信頼性の高い再現性のあるモデルが求められています。
マウスおよびラットでmTBIをモデル化する以前の試みにもかかわらず、多くの場合、有害作用が報告されている。特に、ほとんどのげっ歯類モデルは、より少ないthを用いてその反復性が制限されている頭蓋内出血、頭蓋骨折、重症の軸索損傷、神経細胞死、死亡率の増加などの有害な病理学的事象を有することが示されている8,9,10,11,12。ここでは、人間の脳震盪の真の定義に近いmTBIのマウスモデルについて説明する。このモデルは、ヒトのmTBIで観察される症状の多くを再現します。例えば、顕性肉眼的脳病変がなく、意識の一過性喪失をもたらす機械的力です。さらに、これまでに報告されているように、長時間にわたって単一衝撃および反復衝撃パラダイムの両方に利用できるという利点がある。
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Protocol
これらの研究は、国立研究所の保健所の実験動物のケアと使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って行った。このプロトコールは、ジョージタウン大学の動物実験および使用委員会の承認を受けた。マウスを温度制御された動物施設に収容し、12時間明/ 12時間暗サイクルで維持した。食べ物と水は自由に自由に入手できました 。
1. mTBI装置の準備
注記：mTBI装置には、衝撃パラメータを制御するデータ収集（DAQ）ボックス、衝突を実行する高速空気圧インパクタ、衝撃後にヘッドを減速するための成形ゲル充填ベースが含まれています。
- 圧縮空気をオンにし、高速空気圧インパクターを861.85 kPaの圧力設定に初期化します。
- DAQ制御システムを、2.35 m / sのピストン速度、表面滞留時間eは31.5msである。
- 正中線がインパクタ先端の軌跡と垂直になるように、成形ゲル充填ベース（圧縮率64kPa / mm）を配置します。
2. mTBIインパクト
- 使用するすべてのマウスの体重を記録する。
- 誘導チャンバー内で120秒間、酸素中3％イソフルランでマウスを麻酔する。
- マウスをmTBI装置に移し、柔軟で固定されていないノーズコーンを介して麻酔を継続する。
- ノーズコーンでは、マウスパッドの頭をゲルパッドの上に置き、頭蓋骨の平らな表面がインパクターの先端に垂直になるようにします。
- テープをマウスの頭の上に置き、平らな面を作り、耳をインパクトサイトから離します。
- ポリテトラフルオロエチレンインパクターの先端を下げて、頭の中心にある矢状の中線に合わせます。使用されるインパクタ先端部は直径10mmであり、目の真後ろから耳の正中線までの頭皮の領域を覆う。インパクタを調整してjustがマウスの頭の表面に触れる。
- インパクターの先端を引っ込め、必要なたわみ深さ（7.5 mm）を手動でダイヤルします。
- DAQコントロールシステムをアームし、トリガボタンを押してマウスの頭部に影響を与えます（特異または反復のいずれかの影響）。反復的なインパクトは、各インパクトの間に遅延なしで連続して提供されます。
- 最後のインパクトの直後に、マウスを麻酔およびmTBI装置から取り出し、仰臥位に置く。
- ストップウオッチを使用すると、右旋回の戻り（仰臥位から腹臥位へ）の戻り時間を測定し、意識の時間の損失、歩行までの時間（妨げられない歩行）を測定します。
- マウスをモニターし、正常な動作に回復すると、そのホームケージに戻ります。
- 擬似マウスは、同じ取り扱いと麻酔を受けるが、影響はない。
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Representative Results
この新しいmTBIデバイスの使用は、頭蓋骨の骨折または構造的な脳損傷のリスクを伴わずに、軽度の頭部損傷を1回および反復することを可能にする。このモデルでは、カスタムメイドの空気式テフロン・インパクター・デバイスを使用して、閉じた頭部の機械的エネルギーの影響を与えます。この衝撃は、正確な速度と変形のパラメータの下で行われ、信頼性の高い再現性のあるモデルを作成し、単一または反復的な脳震盪mTBIの効果に寄与するメカニズムを調べます （ 図1 ）。
LOCの有無は、動物モデルにおける脳震盪の重症度を評価するのに有用なツールである。右旋回時間の復帰は、単一および反復mTBI（深さ7.5 mm、 図2 ）の後にLOCを定量化するために使用した傷害重症度の急性神経学的評価である。処置の間、マウスには合計3分のイソフルランしたがって、偽を含む全てのマウスは、麻酔離脱後のLOC期間を有する。単一のmTBIは、偽のマウス（36.4±1.6sv 64.2±7.7s、n = 5、** p <0.01、 図2A ）と比較して有意にLOCを増加させる。これは、単一のmTBI（52.0±4.5sv 140.0±21.1秒、n = 5、** p <0.01、 図2B ）後の歩行時間の増加とも相関していた。反復傷害パラダイム（合計30回のインパクト、6日間の1日当たり5回のインパクト）では、すべての試験日にLOCおよび歩行時間が有意に上昇した（反復措置の分散傷害効果F 1 14 = 22.92、 p <0.0003）。全研究期間中、6日間の平均LOCは、35.5±1.4sv mTBI：64.9±1.7s、n = 8、p <0.01、 図2Cおよび平均歩行時間Sham：64.3±3.3sv mTBI：160.8 ±5.3秒、n = 8、p <0.01、lass = "xfig">図2Dミクログリア/マクロファージのIba1染色は、偽の単一のmTBIマウスと、反復mTBIマウスの視索における広範なIba1免疫反応性（ 図3 ）との間で変化を示さなかった。反復mTBIマウスは、皮質（ 図3 ）または他の脳領域において灰白質の炎症の証拠を示さなかった。
図1 ：mTBIのマウスモデルの例示的表現。 （ A ）mTBIの実施に必要なすべての材料の設定。 （ B ）マウスをイソフルラン誘導チャンバーに2分間置いた。 （ C ）mTBI装置上で、マウスを固定されていないノーズコーンに入れて麻酔を継続する。 （ D ）マウスの頭を静かにテープで平らな面にし、耳を後ろに持ちます。インパクト頭の表面にちょうど接触するように先端が下がった。 （ E ）インパクタ先端を引っ込め、必要なたわみ深さをダイヤル（インセット）を用いて下げる。 mTBIはトリガーボタンを押して実行します。 （ F ）意識の喪失は、正反射（仰臥位から腹臥位）に戻るまでの時間で測定される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2 ：単一および反復mTBIは、意識の一時的な損失を増加させ、歩行時間に戻る。単一のmTBIを受けたマウスは、擬似対照マウスと比較して（ A ）喪失意識（LOC）および（ B ）歩行時間を有意に増加させた（群当たりn = 5、** p <0.01）。反復性mTBI（6日間の1日当たり5回の影響）は、偽マウスと比較して毎日のLOCおよび歩行時間を有意に増加させる（グループ当たりn = 8、* p <0.05、** p <0.01、*** p < 0.001）。 Bonferroni post-hoc試験を用いた2元反復測定ANOVAによって分析した平均±SEMとして表したデータ。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3 ：反復mTBIは、視神経路における小膠細胞/マクロファージの活性化を誘導する。 （ A ）偽マウスにおけるIba1染色は、皮質（a1-a3）における静止ミクログリア/マクロファージおよび視神経路（a4-a6）における限定された染色を示す。 （ B ）単一のmTBIを受けるマウス（7.5mm）は、衝撃後24時間、皮質（b1-b3）および視神経路（b4-b6）の両方における偽マウスと同様のIba1染色プロフィールを有する。 （ C ）mTBIマウスの反復（6日間連続して1日5回）は、最後の影響の24時間後（7日目）に視神経路（c4-c6）では強い炎症反応を示すが、皮質）。偽、単一および反復mTBIマウスの皮質（a3、b3、c3）および視神経路（a6、b6、c6）におけるIba-1陽性小膠細胞/マクロファージの形態をそれぞれ示す拡大画像。スケールバー=200μm（A、B、C）。 50μm（a1-a5、b1-b5、c1-c5）。 20μm（a3、a6、b3、b6、c3、c6、拡大パネル）。グループあたりn = 6の画像。 Cortex（cx）、視神経路（opt）、軽度の外傷性脳損傷（mTBI）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ヒトにおいて、mTBIは、構造的損傷がない場合の機能障害によって特徴付けられる。これは、意識消失の有無にかかわらず発生する可能性がある1 。脳震盪を繰り返す暴露は、現在、CTE 4などの神経変性疾患の発症および/または進行の根底にあると考えられている。 CTEは一般的にボクサーやフットボールの選手には見られますが、反復脳震盪（意識消失をもたらさないものを含む）はCTEを開発する上で不可欠な要素であることが知られていますが、反復脳震盪が脳内で起こる明確な変化を引き起こすメカニズム。
これらのメカニズムを理解する上での大きな障害は、mTBIの影響を受ける個体で観察される重要な症状を正確に再現するモデルを開発することの難しさです。これは、急性および慢性の生物学的なパトロール震えた衝撃の根底には調査するのが難しく、新しい治療法を開発することはできません。特に、既存の脳震盪動物モデルは、広範な神経細胞の喪失、頭蓋骨の骨折および脳組織の喪失を引き起こすわずか2〜3回の反復衝撃を用いて、非常に重度である8,10,11,12。このような傷害の程度は、人の繰り返しの脳震盪後には起こらず、軽度の頭部衝撃を繰り返して繰り返す新しいモデルが必要であることが実証されています。
ここでは、頭蓋骨や脳を介してマウスから離してエネルギーを伝達するように特別に設計された特注の拡散傷害装置を使って、mTBIの新しいモデルについて説明します。シングルインパクトと反復インパクトの両方のパラダイムを通じて、このモデルは、脳卒中がどのようにして脳神経障害にどのように貢献するかを調査する手段を提供します。シングルhヒトで観察される軽度の外傷性脳損傷の特徴を再現するパラダイムであり、反復的なパラダイムは、これらの一見軽度の傷害が長期にわたり慢性および持続性の変性にどのように寄与するかを調べることを可能にする。このデバイスは、頭蓋骨骨折または構造的脳損傷のリスクなしに、mTBIヘッドの反復的な衝撃を可能にする。
多くの技術の場合と同様に、このプロトコルの特定の側面は、正確で信頼性の高い結果の生成に注意することが重要です。チャンバー誘導およびmTBI損傷の間、各マウスに一貫したレベルの麻酔を維持することが不可欠です。歩行と歩行時間はこのmTBI手順の重要な結果測定値であるため、研究者はmTBI傷害と偽動物の両方が匹敵するレベルの麻酔薬に曝されていることを確認する必要があります。具体的には、全手順の持続時間の間、マウスは、3分間の合計（2分間のインmTBIノーズコーン装置で1分）。この低レベルおよび麻酔持続時間は、他の多くのmTBIモデルよりも大きな利点であり、一貫した正反射応答時間（偽マウス20-40秒、mTBIマウス50-100秒）をもたらす。さらに、リピートmTBIパラダイムを利用する場合、研究期間中、毎日マウスの体重の記録を維持することが重要です。これは、mTBI手技の全期間を通じて、ストレスおよび一般的な動物福祉の一貫したモニタリングを確実にするためである。この手順では、マウスが撤回または単離されることはない。通常のグルーミング、飲食は、手術後1時間以内に観察されるべきである。
損傷後には、1週間の時間経過にわたる単一または複数の影響から生じる脳組織への肉眼的形態学的病理は存在しない。単一のmTBIの後に観察される唯一の細胞応答は、興奮性シナプスの一時的な減少である; th炎症、灰白質または白質の喪失、軸索損傷または細胞死はありません。 30回の反復mTBI（1日5回、6日以上）では、視力尺度の慢性炎症があり、これは以前に定量されたものと同様のレベルである1 。単一のmTBI14から数年後に慢性白質炎症が観察され、慢性炎症はリピートmTBIの歴史を持つ生きた選手で検出することができる15 。このモデルの限界は、我々のモデルでは存在しないため、視細胞外の軸索損傷または細胞死のメカニズムを研究するために使用することができないことです。また、以前に発表されたデータに基づいて、このモデルは、アルツハイマー病のマウスモデルにおいてmTBI後1ヵ月でアミロイドまたはタウの病状の変化を誘導しない13 。本発明者らは、このアミロイドおよびタウの病理の欠如が、本発明者らのモデルにおいて軸索病変の欠如に関連すると考えている。私たちのモデルは、調査するプラットフォームを提供していますニューロンネットワークの不連続な変化、シナプスの完全性および組成、および反復的な激しい打撃に続く行動の変化を食べた。これらの結果に基づいて、この新規なモデルは、制御された、厳密で効率的な方法で臨床的に関連する症候を引き起こす。このモデルのさらなる使用は、mTBIおよび脳震盪の急性および慢性の病態生理学の基礎となるメカニズムの調査を可能にする。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、神経障害および脳卒中（MPB）に関する国立研究所のR01 NS067417によって支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powerlab 8SP data acquisition (DAQ) control box | (AD instruments) | ||
| VIP 3000 calibrated vaporizer | Matrx | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Oxygen | Commercially available | ||
| Compressed Air | Commercially available | ||
| Masking Tape | Commercially available | ||
| Stop Watch | Fisher Scientific | 02-261-840 | |
| C57 Bl/6 Mice | Jackson Laboratories | ||
| Digital Scale and weigh container | Fisher Scientific | 20031 | |
| anti-Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| HRP labelled secondary | Jackson Immunoresearch | 111-035-003 |
References
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