Summary
Biz burada Salmonella typhimuriumyalıtım için basit ve hızlı bir yöntem tarif-biotin ve streptavidin bakterilerle kaplama tarafından phagosomes üzerinden makrofajlar içeren.
Abstract
Salmonella typhimurium insanlarda mide iltihabı neden olur fakültatif intraselüler bir bakteridir. Lamina propria, S. işgalinden sonra Typhimurium bakteriler hızla tespit ve makrofajlar tarafından phagocytized ve bozulmuş için phagosomes bilinen veziküller içinde bulunan. S. yalıtım Typhimurium-içeren phagosomes yaygın olarak kullanılan çalışma nasıl S. Typhimurium enfeksiyonu bakteriyel bozulma önlemek için phagosome olgunlaşma sürecinin değiştirir. Klasik, yalıtım bakteri içeren phagosomes Sükroz degrade Santrifüjü tarafından gerçekleştirilen. Ancak, bu işlem zaman alır ve özel ekipman ve belirli bir ölçüde beceri gerektirir. Burada açıklanan S. yalıtım için basit ve hızlı bir yöntem olduğunu Typhimurium-makrofajlar üzerinden phagosomes bakterileri biotin streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplama tarafından içeren. Bu yöntemle elde edilen phagosomes deneyleri, protein, metaboliti ve lipid çözümlemesi gibi geniş bir yelpazesi için izole phagosomes kullanımını sağlayan seçtikleri herhangi bir arabellekte askıya alınabilir. Özet olarak, bu yöntem S. yalıtım için Typhimurium-phagosomes içeren belirli, verimli, hızlı, en az ekipman için ve yalıtım Sükroz degrade-ultrasantrifüj tarafından klasik yöntem'den daha çok yönlüdür.
Introduction
Makrofajlar algılayan, yutmak ve herhangi bir yabancı parçacık mikroorganizmalar bakteri gibi işgal için apoptotik hücreler arasında değişen periferik dokularda mevcut aşağılamak özel fagositik hücreler dolaşmaktadır. Reseptör aracılı yüzey tanıma patojen belirli işaretleri (patojen ilişkili moleküler desen veya PAMPs da bilinir) mikroorganizmalar yüzeyinde yaygın olarak mevcut makrofajlar içinde hücresel membran karmaşık bir yeniden yapılanma başlatmak. sipariş surround ve patojen1işbirliği için.
Yutulmak patojen sonra phagosome bilinen bir hücre içi vezikül makrofaj tarafından yer alıyor. Diğer veziküller endosomes ve organellerin gibi olaylarla fisyon ve füzyon dizi sayesinde patojen içeren phagosome phagosomal içerik ortadan kaldırılması için gerekli proteinleri bir dizi satın aldı. Bu nedenle, phagosome enzimatik kompozisyon phagosome olgunlaşma2olarak bilinen bu işlem süresince son derece değişkendir.
Fagositoz kısa bir süre sonra karmaşık katmaninin ATPaz (v-ATPaz) Fusion endosomes3phagosome membran dahil multimeric. Bu karmaşık ATP sitozol phagosome4Lümen için gelen pompa proton için kullanır. Phagosome asitleştirme diğer veziküller5 füzyon olaylarla ve pH bağımlı degradative enzimler6çok sayıda aktivasyonu için gereklidir. Phagosome membran üzerinde hızlı bir şekilde monte başka bir multimeric enzimatik karmaşık NADPH-oksidaz (NOX) karmaşık değil. NOX karmaşık NADPH bu phagosome Lümen salgılanan ve bu önemli ölçüde katkı7yutulmak mikroorganizmaların öldürülmesi için Reaktif oksijen türleri (ROS) üretmek için oksitlenir.
Olgunlaşma ilk adımları uyguladığınızda, phagosomes işaretleri genellikle Rab5 ve erken ve geç endosomes v-ATPaz8V0 alt birim ile birlikte sırasıyla Rab7 gibi mevcut. Organellerin ve geç endosomes phagosomes füzyonu phagocytized patojen maruz hydrolytic enzimler cathepsin proteaz, lipaz ve β-galaktozidaz9gibi çok çeşitli sonuçlanır. Lümen asitleştirme da bu enzimlerin aktivasyonu için gereklidir. Örneğin, etkin kısa form üretmek için cathepsin D bölünme pH bağımlı10' dur. Bu enzimler patojen bozulmasına yol açar ve makrofaj MHC kompleksi (MHC) Sınıf II molekülleri bir adaptif immün yanıt11tetiklemek için T hücrelere tarafından sunulan kısa peptidler patojen kaynaklı üretim aracılık.
Bu nedenle, phagosome olgunlaşma doğuştan gelen bağışıklık yanıtı için çok önemlidir ve bağışıklık sisteminin doğuştan gelen ve edinilmiş silah bağlar. Patojenler ortadan kaldırılması phagosome olgunlaşma yukarıda açıklanan sürecinde makrofajlar tarafından üstesinden gelmek için stratejiler geliştirmişlerdir hiç de şaşırtıcı değil. Örneğin, hücre içi bakterilerin Mycobacterium tüberküloz ve Legionella pneumophila inhibe v-ATPaz derleme ve bunun sonucunda Lümen asitleştirme12,13 phagosome olgunlaşma önlemek . Listeria Monositogenez veya Shigella flexneri gibi diğer bakteri sitozol14,15kaçmak için phagosome membran gözenek oluşumu teşvik. Öte yandan Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) phagosome içinde onun çoğaltma16için uygun bir yer haline dönüştürmek için çarpıtma özelliklerini değiştirmek yapabiliyor. Bu yeteneği S. yapar typhimurium patojen-aracılı girişim phagosome olgunlaşma eğitim için çok ilginç bir model.
S. typhimurium insanlarda mide iltihabı neden olur fakültatif intraselüler bir bakteridir. Lamina propria, S. işgalinden sonra Typhimurium bakteriler hızla tespit ve makrofajlar tarafından phagocytized ve phagosomes17içinde bulunan. Bazı raporlar daha önce o S. tarif var Typhimurium-içeren phagosomes vericiler için hem endosomes hem de organellerin18sunmak ve diğer çalışmalar phagosome-lysosome füzyon S. engelledi bulduk Typhimurium enfeksiyonu19.
Başlangıçta, phagosome olgunlaşma üzerine S. Typhimurium enfeksiyonu ayirt mikroskobu tarafından araştırmış. Bakteri içeren izolasyonu için yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde phagosomes etkin phagosome içerik endosome ve lysosome açısından daha doğru bir çalışma. Bugüne kadar bakteri içeren yalıtımı için kullanılan ana yöntem phagosomes hücre altı ayırma Sükroz adım degradeler18,20olduğunu. Ancak, bu yöntem phagosomes mekanik zarar verebilir, phagosomal bileşenleri (protein ve yağlar) kararlılığını etkileyebilir ve zaman alıcı birden fazla Santrifüjü adımları gerektirir. Ayrıca, bir ultracentrifuge kullanımını gerektirir: her laboratuvar için erişilebilir değil özel ekipman parçası.
Son zamanlarda, yeni bir yaklaşım bakteriyel içeren izolasyonu için uygulanmış olan bakteriyel patojenler biotinylated lipopetide (Lipobiotin) ile etiketlenir phagosomes, çıkarılan manyetik boncuklar21 streptavidin Birleşik kullanarak . Önerdiğimiz alternatif tamamlayıcı bir yöntem bakteriyel yüzey Amin içeren oluştururlar NHS-Biotin ile etiketleme tarafından streptavidin Birleşik manyetik boncuklar tarafından takip. Bu yöntemle elde edilen phagosomes son derece endosome ve lysosome işaretleyicilerini zenginleştirilmiş ve deneyleri, protein analizi omics analiz için geniş bir yelpazesi için kullanılır. Ayrıca, ultracentrifuges gibi özel ekipman gerektirmez. Ayrıca, Santrifüjü adımları ortadan kaldırarak, phagosomes mekanik hasar ve istihdam süreyi önemli ölçüde azalır. Bu yöntem gibi gram-pozitif Staphylococcus aureusda bu el yazması dahil, diğer bakteriler içeren phagosomes yalıtım için kolayca adapte edilebilir. Özet olarak, bu yöntem S. yalıtım için Typhimurium-phagosomes içeren bu basit, düşük maliyetli, ve daha az zaman klasik yalıtım Sükroz tarafından alıcı degrade-ultrasantrifüj son derece oluşturma, bakteri içeren phagosomes zenginleştirilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
patojen S. kullanımıyla ilgili tüm adımları Typhimurium BSL-2 veya daha yüksek biyolojik güvenlik seviye yapılmalıdır. Kültür ve S. kaplama Typhimurium gibi kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) enfeksiyonu önlemek amacıyla laminar akış başlık altında gerçekleştirilmelidir. S. yalıtım Typhimurium-phagosomes içeren herhangi bir BSL-2 laboratuvar tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir.
kemik iliği çıkarma fareler makrofajlar içine onun farklılaşma için hayvan refah kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen ve doğa, Kuzey Ren-Vestfalya Eyalet ajansı tarafından onaylanmış Çevre ve tüketici koruma [Landesamt für Natur, Umwelt ve Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; Dosya no: 84-02.05.40.14.082 ve 84-02.04.2015.A443] ve Köln Üniversitesi.
1. Culturing S. typhimurium
- Inoculate S. Typhimurium (SL1344 zorlanma) üzerinden 5 mL bakteriyel bir döngü kullanarak beyin kalp infüzyon (BHI) suyu içine bakteriyel bir koloni.
- Bakteriyel süspansiyon bir kuluçka 37 ° C'de gecede sallayarak ile kuluçkaya.
- 19 mL konik bir şişesi BHI suyu içine 1 mL bakteriyel süspansiyon, ertesi gün, transfer ve sallayarak ile bir kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya. S.
- izlemek 600 optik yoğunluk (OD) ölçme tarafından typhimurium büyüme nm (OD 600) bir Spektrofotometre ile. Ölçümler yaklaşık her 30 dk. alınmalıdır
- Ne zaman OD 600 1.0 ulaşır, inkübatör ve transfer 50 mL tüp içine bakteriyel süspansiyon kaldırın. Santrifüj kapasitesi bakteri 5400 x g 15dk için de 4'te ° C.
- Süpernatant kaldırmak ve 10 mL steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) resuspend.
- Vasıl 5400 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj
- Süpernatant kaldırmak ve 4.9 mL steril PBS bakterilerde resuspend.
2. S. typhimurium NHS-Biotin/Streptavidin-Birleşik manyetik boncuklar ile kaplanması
- 10 mg/ml eklemek 100 µL biotin (NHS-Biotin çözünmüş Dimetil sülfoksit, DMSO) çözüm taze hazırlanmış, bakteriyel süspansiyon bağlama önceki adımda hazırlanan. Örneğin, NHS-Biotin 5 mg 0.5 mL steril DMSO içine oranında seyreltin. Mix düzgün tarafından yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting.
- Karışımı beş 1,5 mL tüpler içine split.
- Incubate 2 h üzerinde bir termo (RT) oda sıcaklığında sabit 350 rpm'de sallayarak ile için.
- RT, 10 dak için 15.000 x g, tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
- 1 ml steril PBS, RT, 10 min için 15.000 x g, santrifüj resuspend ve süpernatant atın.
- Tekrar adım 2.5 iki kez daha çözüm bağlama fazlalığı biyotin tamamen çıkarmak.
- Sonra son yıkama, pelet 1 mL steril PBS resuspend.
- 10 mg/mL manyetik boncuklar streptavidin Birleşik çözüm 1.5 mL tüp içine 100 µL transfer ve 5 dakika süreyle manyetik rafta bırakın
- Solvent bir pipet ile kaldırmak, streptavidin-Birleşik manyetik boncuklar çözüm manyetik raf almak ve 1 mL 2.7 adımda hazırlanan biotin kaplı-bakteriyel süspansiyon ile resuspend.
- Sürekli 350 rpm'de sallayarak ile 1s için RT, bir termo üzerinde Incubate.
- Çözüm manyetik raf yerleştirin; için 5 dakika bekleyin ve sonra bir pipet ile duvara uygun değil bakteri kaldırın (olarak etiketlenmiş bir tüp devam " sigara kaplı bakteri "). Tüp mıknatıs ile temas duvarına kalarak kesir biotin/streptavidin-kaplı bakteri olduğunu.
- Manyetik raf etiketli bakteri içeren tüpü çıkarması ve 1 mL steril PBS resuspend.
- Tekrar manyetik rafına yerleştirmek için 5 dakika bekleyin ve PBS kaldırmak için bir pipet kullanın.
- Adımları yineleyin 2,13 ve 2.14 iki kez daha streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplı değil tüm bakteriler kaldırmak için.
- Son yıkama sonra kaplı bakteri steril PBS 500 µL içinde resuspend ve tüp olarak etiket " kaplı bakteri ".
- Saymak birimleri (cfu) her iki oluşturan colony " sigara kaplı bakteri " ve " kaplı bakteri " tarafından BHI agar plakalar üzerinde seri dilutions kaplama çözümleri. Yaklaşık 2 x 10 8 cfu/mL kaplı-bakteri gelen ilk bakteriyel süspansiyon 20 mL OD 600 1.0 ile elde edilir. Ertesi gün makrofajlar bulaştırmak için kullanılmak üzere 4 ° C kaplı-bakteriyel süspansiyon devam.
3. Enfeksiyon BDMDs
- ne zaman bakteri kaplı biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile aynı günde tam 6 cm yemekler yemek başına 5 x 10 6 hücre yoğunluğu, farklılaşmış BMDMs 22 plaka.
- Bir sonraki günü kaplı-bakteriyel süspansiyon 5 dak için 15.000 x g, saat 4'te santrifüj kapasitesi ° C.
- Süpernatant kaldırmak ve % 10 fetal sığır serum ile (FBS) takıma Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta 10 x 10 6 cfu/mL konsantrasyonu resuspend. Makrofajlar enfeksiyon (MOI) 10, çokluğu, bulaştırmak için
- Orta BMDMs kaldırın ve hazırlanan kaplı-bakteriyel süspansiyon 5 mL ekleyin. En iyi MOI her hücre türü ya da izole phagosomes deneysel amacı için değerlendirildi.
- RT 10 dk fagositoz eşitlemek için Incubate.
- Incubate % 5 CO 2 kuluçka fagositoz başlatmak 30 dk 37 ° C'de. Diğer hücre tipleri farklı kuluçka kez bakteri içselleştirilmesi sağlamak için gerektirebilir.
- Bakteri içeren orta gelen yemekler kaldırmak ve sigara içselleştirilmiş bakteri kaldırmak için üç kez RPMI hücrelerle yıkayın.
- Sonunda sigara phagocytized bakterileri öldürmek için RPMI %10 FBS ve 50 µg/mL viomisin içeren 10 mL ekleyin. İstenen saat noktayı kadar
- 37 ° c % 5 CO 2 ile enfekte BMDMs kuluçkaya. İstenen saat noktası deneysel olarak bakteri ve hücre türü kullanılan ve analiz amacı göre belirlenmelidir. S. phagosome-endosome füzyon olaylarda erken çalışma için BMDMs, Typhimurium enfekte bir 30 dk kuluçka önerilir. Daha sonra olayları analiz için phagosomes 2 saat veya 4 h, kuluçka sonra elde edilebilir. Makrofajlar S. ile uzun süreli inkübasyon Typhimurium 24 h ötesinde makrofajlar ölümle sonuçlanır. Phagosome ayıklama muhtemelen biotin molekülleri düşmesine neden olabilir önce hücre içi enfeksiyon genişletilmiş. Ancak, biz kaybı biotin kaplı-bakteri kadar 24 h gözlemleme
4. S. yalıtım Typhimurium-Phagosomes içeren
- hazırla gerekli phagosome hacmi yalıtım arabellek (1 mM, Cytochalasin B bir final için son bir konsantrasyon dithiothreitol (DTT) ekleyerek bir 50 mM borular, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) üretici tarafından önerilen gibi 10 µM ve proteaz ve fosfataz inhibitörleri konsantrasyon.
Not: DTT ve Cytochalasin B phagosome yalıtım arabellek A eklenmesi gerekir her zaman hemen önce kullanmak. Cytochalasin B hücre membran rüptürü kolaylaştırmak sitoiskeleti bozan. - İstediğiniz zaman gelin, enfekte hücreleri ortamından çıkarmak ve steril PBS için RT. ısındı yıkayın
- Phagosom ekleyin 750 µLe yalıtım çanak A tampon ve buz üzerinde 20 dk kuluçkaya. Farklı hücre sayıları kullanırken, yalıtım arabellek A hacmi orantılı olarak ayarlanması.
- Ekleyin 250 µL phagosome yalıtım arabelleği B (50 mM borular, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM Mannitol ve 68 mM Sükroz). Rock arabellek yemeğin tam yüzey ulaştığından emin olmak için plaka. Farklı hücre sayıları kullanırken, yalıtım arabellek B hacmi orantılı olarak ayarlanması.
- Hücreleri nazikçe bir lastik polis kullanarak kazıma yemek kaldırmak ve önceden soğutulmuş 1,5 mL tüp transfer.
- 26 G iğne (bir aspirasyon artı hücre süspansiyon sayısı bir fırlatma bir kez olarak) en az 15 kere 1 mL şırınga kullanarak hücre süspansiyon geçer. Bu BMDMs sitozolik içeriğini serbest bırakmak için yeterli. İğne geçer sayısı her hücre türü için optimize edilmiş olması gerekir.
- Hücre süspansiyon manyetik raf yerleştirin ve 5 dakika bekleyin. Parçacıklardır mıknatıs için bağlı kaplı - S. içeren phagosomes Typhimurium. Süspansiyon hücresel bileşenleri geri kalanı içerir.
- Süspansiyon olarak etiketlenmiş bir 1,5 mL tüp içine transfer " sitozol ".
- İzole phagosomes ile tüp manyetik raf çıkarmak ve onları 1 mL steril PBS resuspend.
- Phagosome süspansiyon manyetik rafına yerleştirmek için 5 dakika bekleyin ve PBS kaldırın.
- Tekrarlama adım 4,9 ve izole S. yıkamayı 4.10 Typhimurium-phagosomes içeren.
- Son olarak PBS kaldırmak ve phagosomes resuspend gerekli arabellek; Örneğin, bir radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabellek protein analizi için. Yaklaşık 50-200 µg protein hücrelerinin başlangıç tutarı ve enfeksiyon MOI bağlı olarak bu protokol sonrası örnek başına elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yalıtım bakteri içeren phagosomes bu iletişim kuralı tarafından bakteri biotinylation bir ilk adım olarak gerektirir. Biz bu nedenle S. etkinliği değerlendirilir Typhimurium biotinylation biotinylated ile enfekte BMDMs confocal mikroskobu analizi tarafından mCherry -S. typhimurium Cy5-Streptavidin ile Etiketlenmiş. Kısaca, BMDMs mCherry -Sbu iletişim kuralıyla açıklandığı gibi bulaşmış. Typhimurium daha önce biotinylated ama streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile inkübe değil. 37 ° C'de 30 dk kuluçka sonra hücreleri ile sıcak PBS yıkanmış ve 20 dk RT. fiksasyon, PBS ile geniş yıkama tarafından durduruldu % 4 formaldehit ile sabit. Hücreleri sonra PBS RT. enfekte BMDMs, 5 min için Triton sonra inkübe Cy5-Streptavidin ile 4 ° C'de 20 dk için % 3 ile permeabilized Geniş yıkandıktan sonra örnekleri analiz için confocal mikroskobu (şekil 1) tarafından hazırlanmıştır. Değil biotinylated mCherry -S. Typhimurium negatif kontrol kullanıldı. Cy5-Streptavidin floresan sinyal sadece biotinylated gözlenen mCherry -S. typhimurium, o biotinylation bakteri teyit başarılı oldu. Microscopical analiz "60 X O2 NA: 1.40" kullanarak confocal mikroskop üzerinde gerçekleştirildiği amaç. Uyarma boyları fluorochromes için olduğunu 405 nm (DAPI), 559 nm (mCherry) ve 635 nm (Cy5) ve Devresel ödeme gerilim kuruldu 574v, 565v ve 443v, anılan sıraya göre.
Makrofajlar tarafından Stetikleyen immün yanıt beri. Typhimurium bağlıdır büyük ölçüde makrofaj yüzey reseptör etkinleştirme bakteriyel ligandlar tarafından Eğer sonraki test ettik Skaplama. typhimurium biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile enfekte BMDMs doğuştan gelen bağışıklık yanıtında değişiklik. İlk Skaplama olup olmadığını değerlendirildi. Typhimurium BMDMs fagositik kapasite confocal mikroskobu tarafından değişiklik. BMDMs mCherry -Sbu iletişim kuralıyla açıklandığı gibi bulaşmış. Typhimurium biotin ve manyetik boncuklar streptavidin Birleşik veya kaplamasız mCherry -Sile kaplı. typhimurium. 37 ° C'de 30 dk kuluçka sonra hücreleri ile sıcak PBS yıkanmış ve RT., 20 dk için % 4 formaldehit ile sabit PBS ile geniş yıkandıktan sonra örnekleri analiz için confocal mikroskobu tarafından hazırlanmıştır. Şekil 2' de gösterildiği gibi makrofajlar kaplanmış ve kaplanmamış mCherry -Sphagocytized. Typhimurium eşit.
Daha sonra Starafından tetiklenen inflamatuar yanıt analiz ettik. typhimurium biotin ve manyetik boncuklar (şekil 3) streptavidin Birleşik ile kaplı. Supernatants kaplanmış ve kaplanmamış S. ile enfekte BMDMs üzerinden Typhimurium enfeksiyonu için enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) salgılanan İnterlökin-6 (Il-6) 24 saat sonra toplanan. Skaplama. typhimurium biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile önemli ölçüde makrofajlar inflamatuar yanıt değiştirmek değil.
Bu iletişim kuralı kullanılarak elde edilen bakteri içeren phagosomes saflığı değerlendirmek için izole mCherry -Sanaliz ettik. Typhimurium-immunoblotting tarafından phagosomes içeren. MCherry etiket karşı belirli antikor kullanarak, mCherry ifade Sönemli zenginleştirme bulduk. typhimurium izole phagosomes (şekil 4) aynı örnekten elde edilen sitozolik kesir ile karşılaştırıldığında. MCherry - Siçeren izole phagosomes. daha önce biotin ile kaplı değil typhimurium bir negatif kontrol kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı çok bakteri zenginleştirilmiş phagosomes arınma için izin verir bu sonuçlar gösterilmektedir.
Biz sonraki gerçekleştirilen yalıtılmış phagosomes Siçeren endosome ve lysosome işaretlerinin immunoblot analiz. Typhimurium (Şekil 5). Endosome ve lysosome işaretlerinin çoğu açıkça 4 h sonrası enfeksiyon 30 dk ile karşılaştırıldığında, izole phagosomes tespit edildi. Endosomal işaretleri Rab5 zenginleştirme ve Rab7, hem de lysosome işaretleri v-ATPaz (V0 ve V1 alt birimleri) ve cathepsin D, tespit edildi. İlginçtir, cathepsin D 4 h sonrası enfeksiyon, izole phagosomes içinde sadece cleaved şeklinde gözlenmiştir. Bölünme yanlısı cathepsin d (kısa etkin form (33 kDa) üretmek için 48 kDa) yalnızca phagosomes ama bu iletişim kuralı phagosome yalıtım için özgüllük gösteren sitozol değil, oluşur.
Bu yana işaretleri üzerinden organelleri mitokondri veya endoplazmik retikulum (ER) gibi sık sık izole phagosomes, Sbakteri içeren hazırlıkları tespit edilir. Typhimurium-içeren izole phagosomes mitokondriyal taşıyıcı Tomm20 ve ER protein calnexin (şekil 6) karşı özel antikorlar ile probed. Ayrıca onları Glikoliz enzim sitozolik kirlenme izole phagosomes değerlendirmek için GAPDH karşı antikor ile test ettik. Mitokondri ve ER işaretleri Siçinde bulduk. Typhimurium-izole phagosomes ama hiçbir sitozolik kirlenme.
Çok yönlülük için yalıtım bakteri içeren phagosomes, biotin ve manyetik boncuklar streptavidin Birleşik protokolün çalışmaya kaplama yordamı gram-pozitif bakteri S. aureusuygulandı. Aynı fiksasyon istihdam ve mCherry -Siçin açıklandığı gibi protokol boyama. Typhimurium (Biz doğruladı başarılı biotinylation yeşil flüoresan protein (GFP)şekil 1) ifade -S. aureus (Şekil 7). Ayrıca, zenginleştirme endosome marker Rab7 ve lysosome işaretleri v-ATPaz (V0 alt birim) tespit ettik ve cathepsin D immunoblot analizi tarafından izole GFP -S. aureus-phagosomes (şekil 8) içeren. Cathepsin D olgun şeklini içine bölünme sadece enfeksiyon izole phagosome örnekleri ama sitozolik kesirler içinde 4 h sonra algılanabilir. S. aureusizole-içeren phagosomes GAPDH immunodetection tarafından gösterildiği gibi sitozolik kirlenme ücretsiz.
Özetle, biz bizim phagosome yalıtım Protokolü zenginleştirilmiş bakteri içeren phagosomes, sitozolik kirlenme ücretsiz yalıtım sağlar gösterdi. İzole phagosome hazırlıklar pha çalışma için endosome ve lysosome işaretleri analiz için kullanılabilirgosome olgunlaşma. Ayrıca, bu protokolü Ayagin Gram-negatif ve gram-pozitif bakteriler için kullanılabilir ve etiketleme yordamı makrofajlar bağışıklık yanıtı değiştirmez gösterildi.
Resim 1: Floresan mikroskopi analizi biotinylated S. Typhimurium Cy5-Streptavidin kullanarak. BMDMs mCherry -Sile 30 dk için bulaşmış. typhimurium bu biotinylated ("Biotinylated S. T."), bu protokol için açıklandığı gibi. Değil biotinylated mCherry -S. Typhimurium ("Değil biotinylated S. T.") bir negatif kontrol kullanıldı. Fiksasyon ve permeabilization hücrelerin sonra örnekleri Cy5-Streptavidin ile 20 dk 4 ° C'de inkübe Floresans sinyal çekirdeği (DAPI), mCherry -S. Typhimuriumve Cy5-Streptavidin confocal mikroskobu kullanılarak analiz. Cy5-Streptavidin sinyalini sadece daha önce böylece verimli biotinylation teyit biotin ile etiketli bakteri içinde tespit edilemedi. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: MCherry -Sile enfekte BMDMs Microscopical analizi. typhimurium biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplı. BMDMs bu protokol için açıklandığı gibi biotin ve manyetik boncuklar streptavidin Birleşik etiketli mCherry -S.typhimurium ile bulaşmış. 30 dk için bakteri işbirliği makrofajlar izin sonra hücre RT., 20 dk için % 4 formaldehit ile tespit edildi Makrofajlar tarafından phagocytized kaplı bakteri o zamanlar confocal mikroskobu tarafından analiz. Analiz göstermiştir ki kaplamalı bakteri alımı ("kaplamalı S. T.") etiketlenmemiş mCherry bakteri alımı için karşılaştırılabilir (" Skaplı değil. T."), biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile etiketleme gösteren fagositoz sdeğiştirmemesi. typhimurium makrofajlar tarafından. Çekirdeği ile DAPI mikroskobu görselleştirme için lekeli. Veri demek gibi ± S.E.M. gösterilir ve istatistiksel anlamlılık hesaplanan öğrenci tkullanımı-test olarak temsil edilir * p = < 0,05; ** p = < 0,01; p = < 0,001. Ölçek çubuğu 40 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Setiketli biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile Il-6 salgı BMDMs tarafından enfekte. typhimurium etiketlenmemiş Siçin karşılaştırıldığında. Typhimurium . BMDMs S. ile enfekte typhimurium bu protokol için açıklandığı gibi biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplı. Enfeksiyon 24 saat sonra supernatants ELISA tarafından Il-6 salgı daha fazla çözümleme için toplanmıştır. Supernatants kaplamasız Sile enfekte BMDMs oluştururlar. Typhimurium bir denetim olarak kullanılmıştır. Il-6 salgı kaplı Sindüksiyon. Typhimurium kaplamasız Skıyasla önemli ölçüde farklı değildi. typhimurium. Veri are göstermek demek gibi ± S.E.M. ve Öğrenci t-testi kullanılarak hesaplanan istatistiksel anlamlılık olarak temsil edilir * p = < 0,05; ** p = < 0,01; p = < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: bakteriyel zenginleştirme izole phagosomes. MCherry öğesini S. zenginleştirme typhimurium izole phagosomes 30 dk ve 4 h enfeksiyon sonra toplanan sitozolik kesir karşılaştırıldı. Β-aktin yükleme denetimi olarak kullanıldı. Negatif kontrol kaplamasız Skullanarak izole phagosomes ifade eder. typhimurium , 30 dk sonrası enfeksiyon. Etiketlenmemiş S. kullanarak phagosome yalıtım olarak beklenen son çıktı Typhimurium mCherry veya β-aktin, protokol özgüllük gösteren önemli miktarda mevcut değil. protein 20 µg örnek yüklendi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Analiz endosome ve lysosome işaretlerinin izole S. typhimurium-phagosomes içeren. Endosome işaretleri Rab5 ve Rab7 ve lysosome işaretleri v-ATPaz (V0 ve V1 alt birimleri) ve cathepsin D zenginleştirme izole Sanaliz edildi. Typhimurium-30 dk ve 4 h enfeksiyon sonra çıkarılan phagosomes içeren. Β-aktin yükleme denetimi olarak kullanıldı. protein 20 µg örnek yüklendi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Analizi, mitokondri, ER ve izole Ssitozolik işaretleri. typhimurium-phagosomes içeren. Sitozolik işaret GAPDH, ER işaret calnexin ve S. mitokondrial işaretleyicisinde Tomm20 typhimurium phagosomes 30 dk ve 4 h sonrası enfeksiyon izole immunoblotting tarafından analiz ve karşılık gelen sitozolik kesirler için karşılaştırıldığında. protein 20 µg örnek yüklü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: GFP -S. aureus Microscopical analiz enfekte makrofajlar. BMDMs Sile bulaşmış. aureus yeşil flüoresan protein (GFP) ifade wi etiketliS. etiketleme için metodoloji açıklandığı gibi th biotin typhimurium. Makrofajlar bakteri 30 dk için işbirliği izin sonra hücreleri tespit edildi. Kaplamasız S. aureus ("değil biotinylated S. A.") negatif kontrol kullanılmıştır. Fiksasyon ve permeabilization hücrelerin sonra örnekleri Cy5-Streptavidin ile 20 dk 4 ° C'de inkübe Çekirdek (DAPI), floresan sinyalini GFP -S. Aureusve Cy5-Streptavidin confocal mikroskobu tarafından analiz edildi. Cy5-Streptavidin sinyalini sadece daha önce verimli biotinylation teyit biotin ile etiketli bakteri görülebiliyordu. Ölçek çubukları 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: Analiz endosome ve lysosome işaretlerinin izole S. Aureus-phagosomes içeren. S. aureus-30 dk, 2 h ve 4 h sonrası enfeksiyon izole phagosomes içeren, immunoblotting phagosomal işaretleri Rab5, Rab7 ve v-ATPaz karşılık gelen sitozolik kesirler için karşılaştırıldığında tarafından analiz edildi. protein 20 µg örnek yüklü. Örnekleri de karşı Sizole gösteren GAPDH, spesifik bir antikor ile test edildi. Aureus-içeren phagosomes sitozolik kirlenme ücretsizdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
S. yalıtım için yeni bir yöntem Typhimurium-phagosomes bakterileri biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplama tarafından içeren burada anlatılan. Hücre zarının nazik bozulma sonra bakteri içeren phagosomes kolayca bir manyetik raf kullanarak elde edilebilir. Gösterdiğimiz bakteri etiketleme iltihap ikna etmek için kapasite patojenin koruyan ve ana hücrenin fagositik özelliğini değiştirmez. Bakteri ve endosome/lysosome bu yöntemle elde edilen phagosomes önemlisi, zenginleştirilmiş işaretleri ve sitozolik kirlenme yoksun.
Bu yöntem zaman Sükroz degrade renk ayrımı istihdam geleneksel phagosome izolasyon yöntemine göre birçok avantajı sunuyor. O zaman alan araştırmacı daha kısa sürede daha fazla örnekleri işlemek ve kolayca adımları yıkama sayısını artırarak daha saf phagosome örneklerini almak izin birden çok Santrifüjü adımı ortadan kaldırır. Bu protokol ultrasantrifüj gibi özel ve hassas ekipman ihtiyacını ortadan kaldırır. Yüksek hızlı Santrifüjü veziküller özelliklerini değiştirmek ve bu protokol için kaçınılması son verim22azaltmak olabilir. Biz de göstermiştir S. kaplama typhimurium biotin ve manyetik boncuklar streptavidin Birleşik makrofajlar fagositik kapasite değiştirmez. Ayrıca, Il-6 indüksiyon ile enfekte makrofajlar tarafından Setiketli. Typhimurium etiketlenmemiş bakteri ile enfekte makrofajlar karşılaştırıldığında değiştirilmemiş. Bu nedenle, S. kaplama Typhimurium önemli değişiklikler onların patojen neden değil. Bizim bilgi, S. kaplama Typhimurium izole phagosomes kullanmak için herhangi bir ortak Laboratuvar analiz teknikleri için bir engel temsil etmiyor.
S. typhimurium-bu yöntemle izole içeren phagosomes zenginleştirilmiş bakteri ve mevcut tipik endosomal ve0 v-ATPaz alt birimleri V ve V1 ve cleaved olgun proteaz lizozomal işaretleri D, sadece izole phagosome kesirler tespit cathepsin. Ayrıca, mitokondri ve ER işaretleri içinde izole S. bulduk Typhimurium-phagosomes içeren. Acil servis ile phagosomes etkileşimi yaygın olarak okudu rağmen proteinler üzerinden mevcut ER miktarda patojen içeren phagosomes okudu patojen ve hücre tipi ile farklı olabilir. Örneğin, brusella abortus nonprofessional fagositler izole içeren phagosomes ER işaretleri23 ancak izole makrofajlar24değil zengindir. Calnexin daha önce S. içinde algılandı Sükroz degrade18tarafından izole Typhimurium içeren phagosomes. İnert boncuk içeren phagosomes ve mitokondri yakın etkileşim da daha önce raporlanmış25Tomm20 huzurunda izole phagosomes açıklayan, olmuştur. Mitokondrial proteinler izole phagosomes L. pneumophila26 veya Mycobacterium27içeren bulundu. Ancak, sukroz degrade Santrifüjü yöntemi kullanarak izole patojen içeren phagosomes hazırlıkları bileşenlerinde mitokondri tespiti kez bu organel benzer yoğunluğu nedeniyle olduğuna inanılan ve patojen içeren phagosome ve bu nedenle, belirsiz28. Bizim yöntemi böyle bir kirlilik sorunu önler ve mitokondrial membranlar phagosomal membranlar ile karışır öneren daha güvenilir bilgi sağlar. Özet olarak, zor olacak ER ve patojen içeren mitokondrial işaretleyicilerini önlemek için phagosomes hazırlıklar, konak hücre tipi ve patojen bağlı olarak izole. İzole phagosomes saflığı doğrulanması için önerilen yöntem bakteriler Western Blot tarafından algılanması için etiketli bakteri ve belirli etiket antikorlar kullanmaktır. Biz de bu yalıtım yöntemini biotinylated-ebilmek var olmak elde edilebilir yüzey Amin grupları ile diğer mikroorganizmalar için adapte edilebilir gösterir. Örnek olarak, başarıyla S. aureusyalıtmak için bizim protokol uyguladığınız-phagosomes içeren. Bu iletişim kuralını kullanan izole S. aureus içeren phagosomes v-ATPaz (V0 alt birimi) ve Rab7, gibi lysosome ve endosome işaretleri içinde sırasıyla zenginleştirilmiş ama GAPDH gibi sitozolik işaretleri mevcut değil.
Endosomal/phagosomal veziküller patojenler bozulması için benzersiz ortamlar sağlar, ancak edinilmiş bağışıklık sistemi sinyal için antijenleri korumak. Phagosomes ve olgunlaşma süreci kapsamlı araştırdı rağmen çeşitli patojenler hosting üzerine phagosome microenvironment zor kalır. O da belirsizdir hücrelerdeki metabolik değişiklikler phagosome olgunlaşma hem de içeriğini değiştirmek nasıl. Bu nedenle, burada ayrıntılı iletişim kuralı phagosome Biyogenez ve işlev bağlamında çeşitli patolojileri, çalışma için daha fazla olanak sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Robinson'ın laboratuarında araştırma hücresel stres yanıt Aging-Associated hastalıkları, Köln Üniversitesi, Almanya Köln mükemmellik kümede fon tarafından desteklenmektedir (CECAD; DFG içinde mükemmellik girişimi Alman Federal tarafından finanse edilen ve hükümetlerin devlet) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln servet ve Maria-Pesch Vakfı Üniversitesi Köln, Almanya dan gelen hibe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
