Summary
Vi beskriver her en enkel og rask metode for isolering av Salmonella typhimurium-som inneholder phagosomes fra makrofager ved belegg bakterier med biotin og streptavidin.
Abstract
Salmonella typhimurium er en facultative intracellulær bakterie som forårsaker gastroenteritt hos mennesker. Etter invasjonen av lamina propria, S. Typhimurium bakterier er raskt oppdaget og phagocytized av makrofager, og finnes i blemmer kjent som phagosomes for å svekkes. Isolering av S. Typhimurium-som inneholder phagosomes mye brukt til å studere hvordan S. Typhimurium infeksjon endrer prosessen med phagosome modning å hindre bakteriell degradering. Klassisk, isolering av bakterier inneholder phagosomes er utført av sukrose gradient sentrifugering. Men denne prosessen er tidkrevende og krever spesialisert utstyr og en viss grad av fingerfølsomhet. Beskrevet her er en enkel og rask metode for isolering av S. Typhimurium-som inneholder phagosomes fra makrofager ved belegg bakterier med biotin-streptavidin-konjugerte magnetiske perler. Phagosomes ved denne metoden kan bli suspendert i en buffer for valg, tillater bruk av isolerte phagosomes for et bredt spekter av analyser, som protein, metabolitten og lipid analyse. I sammendraget, denne metoden for isolering av S. Typhimurium-som inneholder phagosomes er bestemt, effektiv, rask, krever minimum utstyr og er mer allsidig enn den klassiske metoden for isolasjon av sukrose forløpning-ultracentrifugation.
Introduction
Makrofager sirkulerer spesialiserte phagocytic celler som oppdage, sluker og svekke en utenlandsk partikkel tilstede i perifere vev, alt fra apoptotisk cellene til å invadere mikroorganismer som bakterier. På overflaten reseptor-mediert anerkjennelse av patogene bestemt markører vanligvis finnes på overflaten av mikroorganismer (kjent som patogen-forbundet molekylær mønster eller PAMPs), iverksette makrofager en omfattende omorganisering av mobilnettet membranen i for surround og phagocytize den patogen1.
Svelget lett patogen finnes deretter i macrophage i en intracellulær vesicle kalles phagosome. Gjennom en serie av fusjon og fisjon hendelser med andre blemmer som endosomes og lysosomer kjøper patogen inneholder phagosome et sett av proteiner kreves for eliminering av phagosomal innhold. Derfor er enzymatisk sammensetningen av phagosome svært variabel i løpet av denne prosessen, som kalles phagosome modning2.
Kort tid etter fagocytose, multimeric komplekse mer ATPase (v-ATPase) er innlemmet i phagosome membranen av fusjon med endosomes3. Dette anlegget benytter ATP å pumpe protoner fra stoffer til lumen av phagosome4. Forsuring av phagosome er avgjørende for fusion hendelser med andre blemmer5 og for aktivering av et stort antall pH-avhengig degradative enzymer6. En annen multimeric enzymatisk kompleks som er raskt montert på phagosome membranen er den NADPH-oxidase (NOX). NOX komplekse oxidizes NADPH for å produsere reaktive oksygen arter (ROS) som utskilles i phagosome lumen og som bidrar betydelig til drapet av svelget lett mikroorganismer7.
I de første trinnene i modning presentere phagosomes markører vanligvis som Rab5 og Rab7 for tidlige og sene endosomes henholdsvis sammen med V0 delenhet av v-ATPase8. Blanding av phagosomes med lysosomer og sent endosomes fører eksponering for phagocytized patogen en rekke hydrolytisk enzymer som katepsin proteaser, lipases og β-galactosidase9. Forsuring av lumen er også nødvendig for aktivering av disse enzymene. For eksempel er spalting av katepsin D å produsere aktive kortformen pH-avhengig10. Disse enzymene fornedre patogen og megle produksjon av patogen-avledet kort peptider som presenteres av macrophage store histocompatibility kompleks (MHC) klasse II molekylene T celler å utløse en adaptiv immunrespons11.
Derfor phagosome modning er avgjørende for medfødte immunforsvaret og linker medfødte og adaptive armene av immunsystemet. Det er ingen overraskelse at patogener har utviklet seg strategier for å overvinne eliminering av makrofager gjennom ovenfor beskrevet phagosome modning. For eksempel hindre intracellulære bakterier Mycobacterium tuberculosis og Legionella pneumophila phagosome modning av hemme v-ATPase montering og påfølgende lumen forsuring12,13 . Andre bakterier som Listeria monocytogenes eller Shigella flexneri skape pore i phagosome membranen å flykte i stoffer14,15. På den annen siden, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) er kjøpedyktig endre egenskapene for phagosome i vacuole å transformere det til et egnet sted for sin replikering16. Denne evnen gjør S. typhimurium en veldig interessant modell for å studere patogen-mediert forstyrrelser av phagosome modning.
S. typhimurium er en facultative intracellulær bakterie som forårsaker gastroenteritt hos mennesker. Etter invasjonen av lamina propria, S. Typhimurium bakterier er raskt oppdaget og phagocytized av makrofager, og finnes i phagosomes17. Enkelte rapporter har tidligere beskrevet at S. Typhimurium-som inneholder phagosomes presentere beslutningstakere for både endosomes og lysosomer18og andre studier har funnet phagosome-lysosome fusion forhindret på S. Typhimurium infeksjon19.
I utgangspunktet phagosome modning på S. Typhimurium infeksjon har blitt undersøkt av immunofluorescence mikroskopi. Utvikling av teknikker for isolering av bakterier inneholder phagosomes aktivert en mer nøyaktig studie av phagosome innholdet i markører endosome og lysosome. Til dags dato, den viktigste metoden brukes for isolering av bakterier inneholder phagosomes er det subcellular fraksjoneres på sakkarose trinnet graderinger18,20. Denne metoden krever imidlertid flere sentrifugering trinn som kan forårsake mekanisk skade phagosomes, kan påvirke stabiliteten av phagosomal komponenter (proteiner og lipider) og tidkrevende. Dessuten, det krever bruk av en ultracentrifuge: spesialisert utstyr som ikke er tilgjengelig for hvert laboratorium.
Nylig en ny tilnærming er utlignet mot isolasjon av bakteriell inneholder phagosomes, der bakteriell patogener er merket med biotinylated lipopetide (Lipobiotin) og senere utdraget benytter streptavidin-konjugerte magnetiske perler21 . Vi foreslå en alternativ komplementære metode ved merking bakteriell overflaten Amin inneholder makromolekyler med NHS-Biotin etterfulgt av streptavidin-konjugerte magnetiske perler. Phagosomes ved denne metoden er høyanriket i endosome og lysosome indikatorer og kan brukes for et bredt spekter av analyser, fra protein analyse til omics analyse. I tillegg krever den ikke spesialisert utstyr som ultracentrifuges. Videre ved å eliminere punktene sentrifugering, er både mekaniske skader på phagosomes og tiden ansatt betydelig redusert. Denne metoden kan lett tilpasses for isolering av phagosomes som inneholder andre bakterier, som de Gram-positive gule stafylokokker, også inkludert i dette manuskriptet. I sammendraget, denne metoden for isolering av S. Typhimurium-som inneholder phagosomes er en enkel, kostnadseffektiv, og mindre tidkrevende enn klassisk isolasjon av sukrose forløpning-ultracentrifugation, gjengivelse svært beriket bakterier inneholder phagosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle trinnene med bruk av patogene S. Typhimurium må utføres i BSL-2 eller høyere biologisk sikkerhet nivå anlegget. Kulturen og belegg av S. Typhimurium, samt infeksjon av Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMDMs) må utføres under laminær strømning hette å hindre forurensning. Isolasjon av S. Typhimurium-som inneholder phagosomes kan utføres på alle BSL-2 laboratoriebenk.
utvinning av benmarg fra mus for dens differensiering i makrofager ble utført institusjonelle retningslinjer på dyrevelferd og godkjent av Nordrhein-Westfalen statlig organ for naturen, Miljø og forbrukerbeskyttelse [Landesamt für Natur, Umwelt og Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; Filen nei: 84-02.05.40.14.082 og 84-02.04.2015.A443] og Universitetet i Köln.
1. Culturing S. typhimurium
- Inoculate S. Typhimurium (SL1344 belastning) fra en enkelt bakterie kolonien i 5 mL av hjernen hjertet infusjon (BHI) kjøttkraft bruker en bakteriell loop.
- Ruge bakteriell suspensjon i en inkubator på 37 ° C over natten med skjelvende.
- På dagen overføre 1 mL av bakteriell suspensjon til 19 mL av BHI kjøttkraft i en konisk bolle og ruge på 37 ° C i en inkubator med skjelvende.
- Overvåke S. Typhimurium vekst ved å måle optisk densitet (OD) på 600 nm (OD 600) med et spektrofotometer. Målingene skal tas omtrent hver 30 min.
- Når OD 600 når 1.0, fjerne bakteriell suspensjon fra inkubator og overføring til 50 mL tube. Sentrifuge bakterier 5400 x g i 15 min 4 ° C.
- Fjerne nedbryting og resuspend i 10 mL steril fosfat-bufret saltoppløsning (PBS).
- Sentrifuger 5400 x g i 15 min på 4 ° C.
- Fjerne nedbryting og resuspend bakterier i 4,9 mL steril PBS.
2. Belegg av S. typhimurium med NHS-Biotin/Streptavidin-konjugerte magnetiske perler
- legge 100 µL av 10 mg/mL biotin koble løsning (NHS-Biotin oppløst i dimethyl sulfoxide, DMSO) nylagde, til bakteriell suspensjon utarbeidet i forrige trinn. For eksempel fortynne 5 mg NHS-Biotin i 0,5 mL steril DMSO. Blandingen riktig av pipettering opp og ned flere ganger.
- Delt blandingen inn fem 1,5 mL rørene.
- Incubate for 2 timer ved romtemperatur (RT) på en termoblokken med konstant rister på 350 rpm.
- Sentrifuge rør på 15 000 x g i 10 min på RT og kast nedbryting.
- Resuspend i 1 mL steril PBS, sentrifuge 15.000 x g for 10 min på RT og kast nedbryting.
- Gjenta trinn 2.5 to ganger for å fjerne overflødig biotin kobling løsningen.
- Etter siste vask, resuspend pellet i 1 mL steril PBS.
- Overføre 100 µL av 10 mg/mL streptavidin-konjugerte magnetiske perler løsning til en 1,5 mL tube og la den på magnetiske stativet for 5 min.
- Fjerne løsemiddelet med en pipette, ta streptavidin-konjugerte magnetiske perler løsningen fra magnetiske rack og resuspend det med 1 mL av biotin belagt bakteriell suspensjon i trinn 2.7.
- Incubate 1 h på RT på en termoblokken med konstant rister på 350 rpm.
- Plasserer løsningen på magnetiske stativet, vent 5 min og fjern med en pipette bakterier som ikke kunne plasseres på veggen (holde den i et rør som " ikke-belagt bakterier "). Brøk som følge av røret i kontakt med magneten er biotin/streptavidin-belagt bakterier.
- Fjerne røret som inneholder merket bakterier fra magnetiske rack og resuspend i 1 mL steril PBS.
- Plasser igjen på magnetiske stativet, vent 5 min og bruke en pipette fjerne PBS.
- Gjenta trinn 2.13 og 2.14 to ganger for å fjerne alle bakterier som ikke er belagt med streptavidin-konjugerte magnetiske perler.
- Etter siste vask, resuspend belagt-bakterier i 500 µL av sterile PBS og etiketten røret som " belagt bakterier ".
- Teller kolonien danner enheter (cfu) av begge " ikke-belagt bakterier " og " belagt bakterier " løsninger av plating føljetong fortynninger på BHI agar plater. Ca 2 x 10 8 cfu/mL belagt-bakterier er Hentet fra 20 mL første bakteriell suspensjon med OD 600 1,0. Holde belagt bakteriell suspensjon på 4 ° C brukes på dagen for å infisere makrofager.
3. Infeksjon av BDMDs
- samme dag når bakterier er belagt med biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler, plate fullt differensiert BMDMs 22 i 6 cm retter på en tetthet av 5 x 10 6 celler per parabolen.
- På dagen sentrifuge belagt bakteriell suspensjon 15.000 x g i 5 min på 4 ° C.
- Fjerne nedbryting og resuspend i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 10% fosterets bovin serum (FBS) i en konsentrasjon av 10 x 10 6 cfu/mL.
- å infisere makrofager på et mangfold av infeksjon (MOI) av 10, fjerne mediet fra BMDMs og legge 5 mL belagt bakteriell suspensjon forberedt. Optimal MOI vurderes for hver celle type eller eksperimentelle formålet med de isolerte phagosomes.
- Incubate på RT for 10 min å synkronisere fagocytose.
- Incubate på 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator for 30 min å starte fagocytose. Andre celletyper kan kreve forskjellige inkubasjon ganger å sikre internalization bakterier.
- Fjern bakterier som inneholder mediet fra retter og vaske cellene med RPMI tre ganger for å fjerne ikke-internalisert bakterier.
- Endelig legge 10 mL av RPMI som inneholder 10% FBS og 50 µg/mL gentamycin å drepe alle ikke-phagocytized bakterier.
- Ruge de infiserte BMDMs på 37 ° C med 5% CO 2 før tiden peke. De ønsket tidspunktet må bestemmes eksperimentelt bakterier og celle type brukes og formålet med analyse. For studier av tidlig phagosome-endosome fusion hendelser i S. Typhimurium-infiserte BMDMs, en 30 min incubation anbefales. For analyse av senere hendelser, kan phagosomes hentes etter 2t eller 4 h med inkubering. Langvarig inkubasjonstiden for makrofager med S. Typhimurium utover 24 h resulterer i død i makrofager. Utvidet intracellulær infeksjon før phagosome utvinning kan trolig føre til nedbrytning av biotin molekyler. Men vi ikke observerer tap av biotin på belagt-bakterier til 24 h.
4. Isolering av S. Typhimurium-som inneholder Phagosomes
- forberede volumet av nødvendige phagosome isolasjon buffer en (50 mM rør, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) ved å legge dithiothreitol (DTT) til en siste konsentrasjon av 1 mM, Cytochalasin B til en endelig konsentrasjonen av 10 µM, og protease og fosfatase hemmere som anbefalt av produsenten.
Merk: DTT og Cytochalasin B må legges til den phagosome isolasjon bufferen A alltid umiddelbart før bruk. Cytochalasin B forstyrrer cytoskjelett, tilrettelegge brudd på cellemembranen. - Samtidig ønsket peker, fjerne mediet fra infiserte celler og vask med sterilt PBS varmet til RT.
- Legge til 750 µL av phagosome isolering buffer A per fat og ruge 20 min på is. Når du bruker forskjellige cellen tallene, volumet av isolasjon buffer A skal justeres proporsjonalt.
- Legge til 250 µL av phagosome isolasjon buffer B (50 mM rør, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM Mannitol og 68 mM sukrose). Rock platen for å sikre at bufferen når hele overflaten av fatet. Når du bruker forskjellige cellen tallene, volumet av isolasjon buffer B skal justeres proporsjonalt.
- Fjerne celler fra retten ved å forsiktig skrape bruke gummi politimann og overføre dem til en pre kjølt 1,5 mL tube.
- Passerer cellen suspensjon gjennom en 26G nål bruker en 1 mL sprøyte minst 15 ganger (en aspirasjon pluss en utstøting celle suspensjon teller som en gang). Dette er nok til å slippe cytosolic innholdet i BMDMs. Antall passerer gjennom nålen må være optimalisert for hver celle.
- Plasser celle suspensjon på magnetiske stativet og vent på 5 minutter. Partiklene knyttet til magneten er phagosomes som inneholder belagt - S. Typhimurium. Suspensjon inneholder resten av cellulære komponenter.
- Overføre suspensjon i en 1,5 mL tube merket som " stoffer ".
- Fjerne røret med de isolerte phagosomes fra magnetiske rack og resuspend dem i 1 mL steril PBS.
- Plasserer phagosome suspensjon på magnetiske stativet, vent 5 min og fjerne PBS.
- Gjennta punkt 4.9 og 4.10 å vaske den isolerte S. Typhimurium-som inneholder phagosomes.
- Til slutt fjerne PBS og resuspend phagosomes i nødvendig bufferen, for eksempel i en radioimmunoprecipitation-analysebuffer (RIPA) for protein analyse. Ca 50-200 µg protein hentes per prøve etter denne protokollen, avhengig av den innledende beløpet av celler og MOI infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering av bakterier inneholder phagosomes av denne protokollen krever biotinylation av bakterier som et første skritt. Vi derfor vurdert effektiviteten av S. Typhimurium biotinylation av AC confocal mikroskopi analyse av BMDMs infisert med biotinylated mCherry -S. typhimurium merket med Cy5-Streptavidin. Kort, BMDMs var infisert som beskrevet i denne protokollen med mCherry -S. Typhimurium tidligere biotinylated men ikke inkubert med streptavidin-konjugerte magnetiske perler. Etter 30 min incubation på 37 ° C, ble cellene vasket med varm PBS og fast med 4% formaldehyd for 20 min på RT. fiksering ble stoppet av omfattende vask med PBS. Cellene ble deretter permeabilized med 3% Triton i PBS i 5 min på RT. infisert BMDMs ble deretter inkubert med Cy5-Streptavidin etter 20 min på 4 ° C. Etter omfattende vasking, ble prøvene utarbeidet for analyse av AC confocal mikroskopi (figur 1). Ikke biotinylated mCherry -S. Typhimurium ble brukt som negativ kontroll. Fluorescerende signalet fra Cy5-Streptavidin ble observert i biotinylated mCherry -S. typhimurium, bekrefter at biotinylation av bakterier var vellykket. Microscopical analyse var utført på et AC confocal mikroskop med "60 X O2 NA: 1.40" mål. Eksitasjon bølgelengder for fluorochromes var 405 nm (DAPI), 559 nm (mCherry), og 635 nm (Cy5) og avdrag spenning ble satt på 574v, 565v og 443v, henholdsvis.
Siden immun respons utløst i makrofager av S. Typhimurium er i stor grad avhengig av macrophage overflaten reseptor aktiveringen av bakteriell ligander, testet vi neste hvis belegget på S. typhimurium med biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler kan endre medfødte immunforsvaret i infiserte BMDMs. Vi først vurdert om belegg s. Typhimurium kan endre phagocytic kapasitet på BMDMs av AC confocal mikroskopi. BMDMs var infisert som beskrevet i denne protokollen med mCherry -S. Typhimurium belagt med biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler eller ubestrøket mCherry -S. typhimurium. Etter 30 min incubation på 37 ° C, ble cellene vasket med varm PBS og fast med 4% formaldehyd etter 20 min på RT. Etter omfattende vask med PBS, ble prøvene utarbeidet for analyse av AC confocal mikroskopi. Som vist i figur 2, phagocytized makrofager bestrøket og ubestrøket papir mCherry -S. Typhimurium like.
Neste, vi analyserte inflammatorisk respons utløst av S. typhimurium belagt med biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler (Figur 3). Supernatants fra BMDMs infisert med bestrøkete eller ubestrøkete S. Typhimurium ble samlet etter 24 h infeksjon for enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) utskilles interleukin-6 (IL-6). Belegget på S. typhimurium med biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler ikke betydelig endre inflammatorisk respons av makrofager.
For å vurdere renheten av bakterier inneholder phagosomes oppnås ved å bruke denne protokollen analyserte vi isolerte mCherry -S. Typhimurium-som inneholder phagosomes av immunoblotting. Bruke spesifikke antistoffer mot mCherry koden, fant vi betydelige anriking av mCherry-uttrykke S. typhimurium i isolerte phagosomes i forhold til den cytosolic Brøkdelen samme prøven (Figur 4). Isolerte phagosomes som inneholder mCherry - S. typhimurium som ikke var tidligere belagt med biotin ble brukt som en negativ kontroll. Disse resultatene viser at denne protokollen tillater for rensing av phagosomes som er høyanriket i bakterier.
Vi neste utført immunoblot analyse av endosome og lysosome markører i isolerte phagosomes som inneholder S. Typhimurium (Figur 5). De fleste av endosome og lysosome markørene var tydelig observert i phagosomes isolert på 4 h etter infeksjon i forhold til 30 min. Anriking av endosomal markørene Rab5 og Rab7, samt lysosome markører v-ATPase (V0 og V1 underenheter) og katepsin D, ble observert. Interessant, ble bare cleaved form av katepsin D i isolerte phagosomes på 4 h etter infeksjon observert. Spalting av Pro katepsin D (48 kDa) å produsere den aktive kortformen (33 kDa) oppstår bare i phagosomes men ikke i stoffer demonstrere spesifisiteten av denne protokollen phagosome isolering.
Siden markører fra organelles som mitokondrier eller endoplasmatiske retikulum (ER) er ofte funnet i forberedelsene til bakterier inneholder isolert phagosomes, S. Typhimurium-som inneholder isolert phagosomes ble analysert med spesifikke antistoffer mot den mitokondrie transporter Tomm20 og ER protein calnexin (figur 6). Vi testet dem med et antistoff mot Glykolysen enzymet GAPDH å vurdere cytosolic forurensning i de isolerte phagosomes. Vi fant både mitokondrier og ER markører i S. Typhimurium-isolert phagosomes men ingen cytosolic forurensning.
For å studere allsidighet av protokollen for isolering av bakterier inneholder phagosomes, biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler ble belegg prosedyren brukt Gram-positive bakterien S. aureus. Ved å bruke samme fiksering og flekker protokollen som mCherry -S. Typhimurium (Figur 1) vi bekreftet vellykket biotinylation grønne fluorescerende protein (GFP) uttrykke -S. aureus (figur 7). Videre vi oppdaget anriking av endosome markøren Rab7 og den lysosome markører v-ATPase (V0 delenhet) og katepsin D av immunoblot analyse av isolerte GFP -S. aureus-som inneholder phagosomes (Figur 8). I spalting av katepsin D i sin eldre form var bare synlig etter 4 h infeksjon i isolerte phagosome prøvene, men ikke i cytosolic fraksjoner. Isolert S. aureus-inneholder phagosomes var gratis cytosolic forurensning som vist av immunodetection av GAPDH.
I sammendraget, har vi vist at våre phagosome isolasjon protokoll kan isolering av høyanriket bakterier inneholder phagosomes, gratis cytosolic forurensning. Isolert phagosome forberedelsene kan brukes til analyse av markører endosome og lysosome for å studere phagosome modning. Videre ble det vist at denne protokollen kan brukes for både Gram-negative og Gram-positive bakteriene og at merking prosedyren ikke endrer immunrespons av makrofager.
Figur 1: Fluorescens mikroskopi analyse av biotinylated S. Typhimurium med Cy5-Streptavidin. BMDMs var smittet i 30 min med mCherry -S. typhimurium som var biotinylated («Biotinylated S. T."), som beskrevet i denne protokollen. Ikke biotinylated mCherry -S. Typhimurium ("Ikke biotinylated S. T.") ble brukt som en negativ kontroll. Etter fiksering og permeabilization cellene, ble prøver inkubert med Cy5-Streptavidin etter 20 min på 4 ° C. Fluorescens signalet fra kjernen (DAPI), mCherry -S. Typhimuriumog Cy5-Streptavidin ble analysert ved hjelp av AC confocal mikroskopi. Signalet fra Cy5-Streptavidin kan bare registreres i bakterien tidligere merket med biotin, bekreftet dermed effektiv biotinylation. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Microscopical analyse av BMDMs infisert med mCherry -S. typhimurium belagt med biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler. BMDMs var infisert med mCherry -S.typhimurium merket med biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler som beskrevet i denne protokollen. Etter at makrofagene til phagocytize bakterier i 30 min, ble celler løst med 4% formaldehyd etter 20 min på RT. Bestrøket bakterier phagocytized av makrofager var da analysert av AC confocal mikroskopi. Analysen viste at inntak av belagt bakterier ("belagt S. T.") sammenlignes med inntak av umerkede mCherry bakterier ("ikke belagt S. T."), viser at merking med biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler endrer ikke fagocytose s. typhimurium av makrofager. Kjerner var farget med DAPI for mikroskopi visualisering. Dataene vises som betyr ± S.E.M., og den statistiske betydningen beregnes ved hjelp av student t-test er representert som * = p < 0,05; ** = p < 0.01; = p < 0,001. Skala bar = 40 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: IL-6 sekresjon av BMDMs infisert biotin-og-streptavidin-konjugerte magnetiske perler, merket S. typhimurium sammenlignet med umerkede S. Typhimurium . BMDMs var infisert med S. typhimurium belagt med biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler som beskrevet i denne protokollen. Etter 24 timer for infeksjon, ble supernatants samlet for videre analyse av IL-6 sekresjon av ELISA. Supernatants danner BMDMs infisert med ubestrøket S. Typhimurium ble brukt som en kontroll. Induksjon av IL-6 sekresjon av belagt S. Typhimurium var ikke signifikant forskjellig forhold til ubestrøket S. typhimurium. Dataene vises som betyr ± S.E.M., og den statistiske betydningen beregnes ved hjelp av student t-test er representert som * = p < 0,05; ** = p < 0.01; = p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bakteriell berikelse i isolerte phagosomes. Anriking av mCherry-merket S. typhimurium i isolerte phagosomes samlet etter 30 min og 4 h infeksjon var i forhold til cytosolic brøk. Β-utgangen ble brukt som en lasting. Kontrollen negative refererer til phagosomes isolert med ubestrøket S. typhimurium på 30 min etter infeksjon. Som forventet, det endelige resultatet av phagosome isolasjon med umerkede S. Typhimurium viser ikke betydelige mengder mCherry eller β-utgangen, demonstrere spesifisiteten av protokollen. 20 µg protein ble lastet inn per prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Analyse av endosome og lysosome markører i isolerte S. typhimurium-som inneholder phagosomes. Anriking av endosome markørene Rab5 og Rab7, og lysosome markører v-ATPase (V0 og V1 underenheter) og katepsin D ble analysert i isolerte S. Typhimurium-som inneholder phagosomes utdraget etter 30 min og 4 h infeksjon. Β-utgangen ble brukt som en lasting. 20 µg protein ble lastet inn per prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Analyse av mitokondrier og ER cytosolic markører i isolerte S. typhimurium-som inneholder phagosomes. Cytosolic markøren GAPDH og ER merket calnexin mitokondrie markøren Tomm20 i S. Typhimurium phagosomes isolert på 30 min og 4 h etter smitte ble analysert av immunoblotting og sammenlignet med tilsvarende cytosolic fraksjoner. 20 µg protein var lastet per prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Microscopical analyse av GFP -S. aureus infisert makrofager. BMDMs var infisert med S. aureus uttrykke grønne fluorescerende protein (GFP) merket with biotin som beskrevet under metode for merking S. typhimurium. Etter at makrofager til phagocytize bakterier i 30 min, ble cellene løst. Ubestrøket S. aureus ("ikke biotinylated S. A.") ble brukt som negativ kontroll. Etter fiksering og permeabilization cellene, ble prøver inkubert med Cy5-Streptavidin etter 20 min på 4 ° C. Fluorescerende signalet fra kjernen (DAPI), GFP -S. aureusog Cy5-Streptavidin ble analysert av AC confocal mikroskopi. Signalet fra Cy5-Streptavidin kan bare sees i bakterien tidligere merket med biotin, bekrefter effektiv biotinylation. Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Analyse av endosome og lysosome markører i isolerte S. aureus-som inneholder phagosomes. S. aureus-inneholder phagosomes isolert på 30 min og 2t 4 h etter infeksjon, ble analysert av immunoblotting for phagosomal markører Rab5, Rab7 og v-ATPase sammenlignet med tilsvarende cytosolic fraksjoner. 20 µg protein var lastet per prøve. Prøvene ble også testet med et spesifikt antistoff mot GAPDH, demonstrere som isolert S. aureus-inneholdende phagosomes er cytosolic forurensning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En ny metode for isolering av S. Typhimurium-som inneholder phagosomes av belegg bakterier med biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler er beskrevet her. Etter milde avbrudd av cellemembranen, kan bakterier inneholder phagosomes lett ut med en magnetisk rack. Vi viser at merking av bakterier bevarer kapasiteten av patogen å indusere betennelse og endrer ikke egenskapen phagocytic vert cellen. Viktigere, phagosomes ved denne metoden er beriket bakterier og endosome/lysosome indikatorer og blottet for cytosolic forurensning.
Denne metoden gir flere fordeler sammenlignet med tradisjonelle phagosome isolasjon metoden som sysselsetter sukrose gradient separasjon. Det eliminerer tidkrevende flere sentrifugering trinn, slik at forskeren håndtere flere prøver i mindre tid og få renere phagosome prøver av lett øke antall vasker trinnene. Bruk av denne protokollen eliminerer behovet for spesialisert og sensitivt utstyr, for eksempel ultracentrifugation. Høyhastighets sentrifugering kan endre egenskapene til blemmer og redusere det endelige avkastning22, som unngås i denne protokollen. Vi har også vist at belegget på S. typhimurium med biotin og streptavidin-konjugerte magnetiske perler endrer ikke phagocytic kapasitet makrofager. Videre merket induksjon av IL-6 av makrofager infisert med S. Typhimurium var uendret i forhold til makrofager infisert med umerkede bakterier. Derfor belegg av S. Typhimurium ikke få betydelige endringer i deres virusets. Vi vet, belegg av S. Typhimurium representerer ikke et hinder for bruk av de isolerte phagosomes for noen av de vanlige laboratorie analyse teknikkene.
S. typhimurium-som inneholder phagosomes isolert av denne metoden er beriket bakterier og nåværende typisk endosomal og lysosomale markører, v-ATPase underenheter V0 V1 og den cleaved eldre protease katepsin D, som kan oppdages i isolerte phagosome fraksjoner. I tillegg fant vi mitokondrier og ER markører i isolerte S. Typhimurium-som inneholder phagosomes. Samspillet av phagosomes med ER har studert allment, selv om mengden av proteiner fra ER tilstede i patogen inneholder phagosomes kan variere med patogen studerte og celle type. For eksempel er phagosomes som inneholder Brucella abortus isolert fra uprofesjonell phagocytes rike på ER markører23 men ikke de isolert fra makrofager24. Calnexin har blitt oppdaget tidligere i S. Typhimurium inneholder phagosomes isolert av sukrose gradient18. Tett interaksjon inert perle inneholder phagosomes og mitokondrier har også vært tidligere rapporterte25, forklarer tilstedeværelsen av Tomm20 i isolerte phagosomes. Mitokondrielt proteiner er funnet i isolerte phagosomes som inneholder L. pneumophila26 eller Mycobacterium27. Men gjenkjenning av mitokondrier komponenter i forberedelsene til isolerte patogen inneholder phagosomes ved hjelp av sukrose gradient sentrifugering metoden har ofte vært antatt av lignende tettheten av denne organeller og patogen inneholder phagosome og derfor uspesifikke28. Vår metode unngår slike en forurensning problemet og gir mer pålitelig informasjon som tyder på at mitokondrie membraner kan omgås phagosomal membraner. I sammendraget, vil det være vanskelig å unngå ER og mitokondrie markører i patogen inneholder isolert phagosomes preparater, avhengig celle vert og patogen. Den anbefalte metoden for verifisering av renhet av de isolerte phagosomes er å bruke merket-bakterier og koder antistoffer for påvisning av bakterier av Western Blot. Vi viser også at denne isolasjon metoden kan tilpasses for andre mikroorganismer med tilgjengelige overflate-Amin grupper som kan være biotinylated. Som et eksempel, har vi brukt vårt protokollen for å isolere S. aureus-som inneholder phagosomes. Phagosomes som inneholder S. aureus isolert bruker denne protokollen er beriket i lysosome og endosome markører som v-ATPase (V0 delenhet) og Rab7, henholdsvis, men presentere ikke cytosolic markører som GAPDH.
Endosomal/phagosomal blemmer gir unike miljøer for nedbrytning av patogener, men beholde antigener for signalering adaptive immunsystemet. Selv om, phagosomes og kjønnsmodning prosessen har blitt grundig undersøkt, forblir microenvironment i phagosome ved hosting ulike patogener unnvikende. Det er også uklart hvordan metabolske forandringer i celler endre phagosome modning og innholdet. Derfor gir protokollen finnesher flere muligheter til å studere phagosome biogenesis og dens funksjon i forbindelse med ulike patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forskning på Robinson's lab støttes av finansiering fra Köln Excellence klynge på mobilnettet stressresponser i Aging-Associated sykdommer, Universitetet i Köln, Tyskland (CECAD, finansiert av DFG innen Excellence initiativ fra tysk federal og statsmyndigheter) og tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670) og Köln formue Maria-dette grunnlaget for universitetet i Köln, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
