Summary
Wir beschreiben hier eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und Streptavidin.
Abstract
Salmonella Typhimurium ist ein fakultativ intrazellulären Bakterium, das Gastroenteritis beim Menschen verursacht. Nach der Invasion der Lamina Propria, S. Typhimurium Bakterien sind schnell erkannt und durch Makrophagen phagozytiert und enthielt in Vesikel genannt Phagosom um abgebaut werden. Isolierung von S. Typhimurium-enthaltenden Phagosom studieren verbreitet wie S. Typhimurium Infektion verändert den Prozess der Reifung Phagosom, bakteriellen Abbau zu verhindern. Klassisch, die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom von Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung durchgeführt wurde. Aber dieser Prozess ist zeitaufwändig und erfordert spezialisierte Ausrüstung und ein gewisses Maß an Geschicklichkeit. Hier ist eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit magnetischen Beads Biotin-Streptavidin-konjugiert. Phagosom erhalten durch diese Methode können in jeder Puffer der Wahl, so dass die Verwendung von isolierten Phagosom für ein breites Spektrum von Assays, wie Eiweiß, Metaboliten und Lipid-Analyse ausgesetzt werden. Fazit: Diese Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom ist spezifisch, effizient, schnell, erfordert eine minimale Ausstattung und ist vielseitiger als die klassische Methode der Isolation von Saccharose Farbverlauf-Ultrazentrifugation.
Introduction
Makrophagen im Umlauf sind spezialisierter phagocytic Zellen, die erkennen, verschlingen und Fremdkörper in peripheren Geweben, von apoptotischen Zellen bis hin zu eindringenden Mikroorganismen wie Bakterien abgebaut. Auf Oberfläche Rezeptor-vermittelte Anerkennung Erreger spezifischer Marker auf der Oberfläche von Mikroorganismen (bekannt als Pathogen-assoziierte molekulare Muster oder PAMPs) häufig vorhanden initiieren Makrophagen eine komplexe Reorganisation der Zellmembran in Bestellung zu umgeben und phagocytize der Erreger-1.
Die verschlungen Erreger ist dann durch die Makrophagen in einem intrazellulären Vesikel genannt Phagosom enthalten. Durch eine Reihe von Kernfusion und Kernspaltung Veranstaltungen mit anderen Vesikel wie Endosomen und Lysosomen erwirbt die Erreger-haltigen Phagosom eine Reihe von Proteinen, die für die Beseitigung des phagosomal Inhalts erforderlich. Daher ist die enzymatische Zusammensetzung der Phagosom im Laufe dieses Prozesses, bekannt als Phagosom Reifung2sehr variabel.
Kurz nach der Phagozytose, Multimeric, die komplexe vacuolar ATPase (V-ATPase) durch Fusion mit Endosomen3Phagosom Membran integriert ist. Die Anlage nutzt ATP zu Pumpe Protonen aus dem Zytosol in das Lumen der Phagosom4. Versauerung der Phagosom ist unerlässlich für die Fusion-Veranstaltungen mit anderen Vesikel5 und für die Aktivierung einer großen Anzahl von pH-abhängigen abbauende Enzyme6. Ein weiterer Multimeric enzymatischen Komplex, die schnell auf der Membran Phagosom montiert ist ist der NADPH-Oxidase (NOX) Komplex. Komplexe NOX oxidiert NADPH um reaktive Sauerstoffspezies (ROS), werden in das Phagosom Lumen abgesondert und, die wesentlich dazu beitragen, die Tötung der verschlungen Mikroorganismen7,zu produzieren.
Während die ersten Schritte der Reifung präsentieren Phagosom Marker in der Regel wie Rab5 und Rab7 der frühen und späten Endosomen bzw. zusammen mit der V-0 -Untereinheit des V-ATPase8. Fusion von Phagosom mit Lysosomen und späten Endosomen führt die Belichtung der phagocytized Erreger, eine Vielzahl von hydrolytische Enzyme wie Cathepsin Proteasen, Lipasen und β-Galaktosidase9. Versauerung des lumens ist auch erforderlich für die Aktivierung dieser Enzyme. Beispielsweise ist die Spaltung von Cathepsin D, die aktive Kurzform zu produzieren pH-abhängigen10. Diese Enzyme erniedrigen den Erreger und vermitteln die Herstellung von Pathogen-abgeleitete kurze Peptide, die durch die Makrophagen große Histocompatibility Komplexes (MHC) Klasse II Moleküle auf T-Zellen eine adaptive Immunantwort11auslösen dargestellt werden.
Daher Phagosom Reifung ist entscheidend für die angeborene Immunantwort und verbindet die angeborene und adaptive Waffen des Immunsystems. Es ist keine Überraschung, dass die Erreger Strategien zur Beseitigung von Makrophagen durch den oben beschriebenen Prozess der Reifung Phagosom Überwindung entwickelt haben. Beispielsweise verhindert die intrazellulären Bakterien Mycobacterium Tuberculosis und Legionella Pneumophila Phagosom Reifung durch hemmende V-ATPase Montage- und konsequente Lumen Versauerung12,13 . Andere Bakterien wie Listeria Monocytogenes oder Shigella Flexneri induzieren Porenbildung in der Phagosom Membran in die Zellflüssigkeit14,15zu entkommen. Auf der anderen Seite, Salmonella Enterica Serovar Typhimurium (S. Typhimurium) zum Ändern der Eigenschaften von Phagosom in die Vakuole, es in einen geeigneten Standort für ihre Replikation16verwandeln kann. Diese Fähigkeit macht S. Typhimurium ein sehr interessantes Modell Erreger-vermittelte Störungen von Phagosom Reifung zu studieren.
S. Typhimurium ist ein fakultativ intrazellulären Bakterium, das Gastroenteritis beim Menschen verursacht. Nach der Invasion der Lamina Propria, S. Typhimurium Bakterien werden schnell erkannt und durch Makrophagen phagozytiert und enthaltenen Phagosom17. Einige Berichte haben, dass S. oben beschrieben. Typhimurium-enthaltenden Phagosom präsentieren Hersteller für Endosomen und Lysosomen18, und andere Studien ergaben Phagosom-Lysosomen Fusion verhindert auf S. Typhimurium Infektion19.
Zunächst Phagosom Reifung auf S. Typhimurium Infektion ist durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht worden. Die Entwicklung von Techniken für die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom ermöglichte eine genauere Studie über das Phagosom Inhalte in Bezug auf Endosom und Lysosomen Marker. Bis heute ist die main-Methode verwendet für die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom ist der subzellulären Fraktionierung auf Saccharose Schritt Steigungen18,20. Diese Methode erfordert jedoch mehrere Zentrifugation Schritte, die Phagosom mechanische beschädigen können, beeinflussen die Stabilität der phagosomal Komponenten (Proteine und Lipide) und nimmt Zeit in Anspruch. Darüber hinaus erfordert die Verwendung einer Ultrazentrifuge: ein Stück von Spezialausrüstungen, die nicht für jedes Labor zugänglich ist.
Vor kurzem ein neuer Ansatz zur Isolierung der Bakterien-haltigen angewendet wurde Phagosom, in denen bakterielle Erreger mit biotinylierte Lipopetide (Lipobiotin) und später beschriftet sind mit Streptavidin-konjugiert magnetische Beads21 extrahiert . Wir schlagen eine alternative komplementäre Methode durch bakterielle Oberfläche Amin-haltigen Makromoleküle mit NHS-Biotin labeling von Streptavidin konjugiert magnetische Beads gefolgt. Phagosom erhalten durch diese Methode sind hochangereichertes im Endosom und Lysosomen Marker und können für eine breite Palette von Assays aus Protein-Analyse, Analyse der Omics verwendet werden. Darüber hinaus erfordert es keine Spezialausrüstung wie Ultrazentrifugen. Darüber hinaus werden durch den Wegfall der Zentrifugation Schritte, die mechanische Beschädigung Phagosom und der Höhe der Zeit beschäftigt erheblich reduziert. Diese Methode kann leicht für die Isolierung von Phagosom mit anderen Bakterien, wie z. B. die grampositive Staphylococcus Aureus, ebenfalls in dieser Handschrift angepasst werden. Fazit: Diese Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom ist eine einfache, kostengünstige, und weniger zeitaufwändig als die klassische Trennung von Saccharose Farbverlauf-Ultrazentrifugation, Rendern sehr bereichert Bakterien-haltigen Phagosom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle Schritte, die die Verwendung von pathogenen S. Typhimurium muss in einem BSL-2 oder höhere biologische Sicherheit Ebene Anlage durchgeführt werden. Die Kultur und die Beschichtung von S. Unter einem Laminar-Flow-Haube um Kontaminationen zu vermeiden muss Typhimurium sowie die Infektion des Knochenmarks abgeleitet Makrophagen (BMDMs) durchgeführt werden. Die Isolation der S. Typhimurium-mit Phagosom durchgeführt werden kann, auf jedem Labortisch BSL-2.
die Gewinnung von Knochenmark von Mäusen für seine Differenzierung in Makrophagen war in Übereinstimmung mit Richtlinien im Bereich des Tierschutzes durchgeführt und genehmigt von der Nordrhein-Westfälischen Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [Forschungsdefizite Für Natur, Umwelt und dieser (LANUV) Nordrhein-Westfalen; AZ.: 84-02.05.40.14.082 und 84-02.04.2015.A443] und der Universität zu Köln.
1. Culturing S. Typhimurium
- Impfung S. typhimurium (SL1344 Stamm) aus einer einzigen bakterielle Kolonie in 5 mL des Gehirns Herz Infusion (BHI) Brühe mit einer bakteriellen Schleife.
- Brüten die Bakteriensuspension in einem Inkubator bei 37 ° C über Nacht mit zitternden.
- Am folgenden Tag 1 mL der Bakteriensuspension in 19 mL BHI Brühe in einem konischen Kolben und Inkubation bei 37 ° C in einem Inkubator mit zitternden.
- Überwachen die S. Typhimurium Wachstum durch die Messung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm (OD 600) mit einem Spektrophotometer. Messungen sollten etwa alle 30 min.
- Bei OD 600 erreicht 1.0, entfernen Sie Bakteriensuspension aus dem Inkubator und Transfer in 50 mL-Tube. Zentrifugieren Sie Bakterien bei 5.400 x g für 15 min bei 4 ° c
- Überstand zu entfernen und erneut in 10 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Zentrifuge bei 5.400 x g für 15 min bei 4 ° C.
- Entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Bakterien in 4,9 mL sterile PBS.
2. Beschichtung von S. Typhimurium mit magnetischen Beads NHS-Biotin/Streptavidin-konjugiert
- Hinzufügen 100 µL von 10 mg/mL Biotin Lösung (NHS-Biotin in Dimethyl Sulfoxid, DMSO gelöst) frisch zubereitet, um die Bakteriensuspension verknüpfen in der vorherigen Schritt vorbereitet. Verdünnen Sie beispielsweise 5 mg von NHS-Biotin in 0,5 mL sterile DMSO. Mix richtig von oben und unten mehrmals pipettieren.
- Unterteilt den Mix in fünf 1,5 mL Röhrchen.
- Für 2 h bei Raumtemperatur (RT) auf einen Thermoblock mit konstanter Schütteln bei 350 u/min inkubieren.
- Rohre bei 15.000 x g für 10 min bei RT Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- In 1 mL sterile PBS, Zentrifuge bei 15.000 x g für 10 min bei RT Aufschwemmen und entsorgen des Überstands.
- Wiederholen Sie Schritt 2.5 zwei weitere Male, um die überschüssiges Biotin Verknüpfung Lösung vollständig zu entfernen.
- Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen das Pellet in 1 mL sterile PBS.
- Übertragen Sie 100 µL 10 mg/mL Streptavidin konjugiert magnetische Beads-Lösung in einem 1,5 mL-Tube und lassen Sie es auf dem magnetischen Rack für 5 min.
- Entfernen des Lösungsmittels mit einer Pipette, die Streptavidin-konjugiert magnetische Beads-Lösung aus der magnetischen Halterung zu nehmen und mit 1 mL Biotin beschichtet-bakterielle Suspension in Schritt 2.7 vorbereitet Aufschwemmen.
- Inkubation für 1 h bei RT auf einen Thermoblock mit konstanter Schütteln bei 350 u/min.
- Legen Sie die Lösung auf der magnetischen Zahnstange; 5 min warten und dann mit einer Pipette entfernen Bakterien, die nicht an die Wand gehalten haben (halten Sie es in ein Rohr mit der Bezeichnung als " nicht beschichteten Bakterien "). Der Anteil an der Wand des Rohres in Kontakt mit den Magneten ist Biotin/Streptavidin-beschichteten Bakterien.
- Das Rohr mit den beschrifteten Bakterien aus der magnetischen Halterung entfernen und in 1 mL sterile PBS Aufschwemmen.
- Der magnetischen Zahnstange wieder aufsetzen, 5 min warten und die PBS entfernen mit einer Pipette.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.13 und 2.14 zwei weitere Male, um die Bakterien zu entfernen, die nicht mit der Streptavidin konjugiert magnetischen Kügelchen beschichtet werden.
- Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen beschichtet-Bakterien in 500 µL steriler PBS und beschriften Sie das Rohr als " Bakterien beschichtet ".
- Zählen die Koloniebildenden Einheiten (KBE) beider " nicht beschichteten Bakterien " und " Bakterien beschichtet " Lösungen durch Ausplattieren Verdünnungsreihen auf Agarplatten BHI. Ca. 2 x 10 8 KBE/mL der beschichteten Bakterien stammen aus 20 mL der ursprünglichen Bakteriensuspension mit OD 600 von 1,0. Halten Sie die beschichtet, bakterieller Aussetzung bei 4 ° C am nächsten Tag verwendet werden, um Makrophagen infizieren.
3. Infektion von BDMDs
- am selben Tag, wenn die Bakterien mit Biotin und Streptavidin konjugiert magnetischen Kügelchen beschichtet, Platte voll differenzierte BMDMs 22 in 6 cm Gerichte bei einer Dichte von 5 x 10 6 Zellen pro Schale.
- Am nächsten Tag, Zentrifugieren beschichtet-bakterielle Aussetzung bei 15.000 x g für 5 min bei 4 ° c
- Den Überstand zu entfernen und erneut in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in einer Konzentration von 10 x 10 6 KBE/mL.
- , Infizieren Makrophagen an einer Vielzahl von Infektionen (MOI) 10, entfernen Sie das Medium aus der BMDMs und 5 mL beschichtet-bakterielle Suspension vorbereitet. Optimale MOI für jeden Zelltyp oder experimentelle Zwecke von isolierten Phagosom beurteilt werden kann.
- Inkubation bei RT für 10 min Phagozytose synchronisieren.
- Inkubation bei 37 ° C in einem 5 % CO 2 Inkubator für 30 min, Phagozytose zu initiieren. Andere Zelltypen erfordern unterschiedliche Inkubationszeiten zur Internalisierung der Bakterien zu gewährleisten.
- Der Bakterien-haltigen Medium vom Geschirr entfernen und Waschen der Zellen mit RPMI dreimal nicht verinnerlicht Bakterien entfernen.
- Schließlich fügen Sie 10 mL RPMI mit 10 % FBS und 50 µg/mL Gentamycin nicht phagozytiert Bakterien zu töten.
- Inkubieren der infizierten BMDMs bei 37 ° C mit 5 % CO 2, bis der gewünschte Zeitpunkt. Der gewünschte Zeitpunkt muss nach den Bakterien und Zelltyp verwendet und dem Zweck der Analyse experimentell ermittelt werden. Für die Studie der frühen Phagosom Endosom Fusion Events in S. Typhimurium-infizierten BMDMs, empfiehlt sich eine 30 min Inkubation. Für die Analyse der späteren Ereignisse können nach 2 h oder 4 h Inkubation Phagosom extrahiert werden. Längere Inkubationszeit von Makrophagen mit S. Tod von den Makrophagen führt Typhimurium über 24 h. Intrazelluläre Infektion verlängert, bevor die Phagosom Extraktion wahrscheinlich zu einer Verschlechterung der Biotin-Moleküle führen könnte. Aber wir waren nicht darauf bedacht Verlust von Biotin auf beschichteten Bakterien bis 24 Uhr
4. Isolierung von S. Typhimurium-Phagosom mit
- bereiten Sie das Volumen der erforderlichen Phagosom Isolierung Puffer ein (50-mM-Rohre, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) durch Zugabe von Dithiothreitol (DTT), eine Endkonzentration von 1 mM, Cytochalasin B, um eine endgültige Konzentration von 10 µM und Protease und Phosphatase-Inhibitoren, wie vom Hersteller empfohlen.
Hinweis: DVB-t und Cytochalasin B muss hinzugefügt werden das Phagosom Isolierung Puffer A immer unmittelbar vor dem Gebrauch. Cytochalasin B stört das Zytoskelett den Bruch der Zellmembran zu erleichtern. - Zum gewünschten Zeitpunkt zeigen, das Medium aus den infizierten Zellen zu entfernen und waschen Sie mit sterilen PBS erwärmt, RT.
- Fügen Sie 750 µL phagosome-Isolierung Puffer A pro Schale und inkubieren Sie 20 min auf Eis. Bei der Verwendung von verschiedenen Zellzahlen sollte das Volumen der Isolierung Puffer A proportional angepasst werden.
- Fügen Sie 250 µL Phagosom Isolierung Puffer B (50-mM-Rohre, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM Mannitol und 68 mM Saccharose). Rocken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass der Puffer die gesamte Oberfläche der Schale erreicht. Bei der Verwendung von verschiedenen Zellzahlen sollte das Volumen der Isolierung Puffer B proportional angepasst werden.
- Entfernen Sie die Zellen aus der Schale durch vorsichtig abkratzen mit einem Kautschuk-Polizisten und übertragen Sie sie auf einem vorgekühlt 1,5 mL-Tube.
- Die Zellsuspension durchlaufen eine 26G-Nadel mit einer 1 mL Spritze mindestens 15 Mal (eine Aspiration plus ein Auswurf der Aussetzung Zellzahlen als einmal). Dies ist genug, um die cytosolische Inhalte von BMDMs freizugeben. Die Anzahl der Durchläufe durch die Nadel muss für jeden Zelltyp optimiert werden.
- Legen die Zellsuspension auf dem magnetischen Rack und 5 min warten. Die Partikel an den Magneten befestigt sind die Phagosom mit beschichteten - S. Typhimurium. Die Suspension enthält den Rest der Zellkomponenten.
- Übertragen die Suspension in einem 1,5 mL Röhrchen beschriftet als " Zytosol ".
- Entfernen Sie das Rohr mit der isolierten Phagosom aus der magnetischen Rack und ihnen in 1 mL sterile PBS Aufschwemmen.
- Legen die Phagosom Aussetzung der magnetischen Zahnstange, 5 min warten und entfernen die PBS.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.9 und 4.10 zu isolierten S. waschen Typhimurium-mit Phagosom.
- Endlich die PBS zu entfernen und Aufschwemmen der Phagosom in den erforderlichen Puffer; z. B. in einem Tests (RIPA) Testpuffer für Proteinanalytik. Ca. 50-200 µg des Proteins ergibt sich pro Probe nach diesem Protokoll abhängig von den ursprünglichen Betrag von Zellen und das MOI Infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom durch dieses Protokoll erfordert die Biotinylierungen der Bakterien als ein erster Schritt. Wir beurteilen daher die Wirksamkeit von S. Typhimurium Biotinylierungen durch Analyse der konfokalen Mikroskopie der BMDMs infiziert mit biotinylierte mCherry -S. Typhimurium mit Cy5-Streptavidin beschriftet. Kurz, BMDMs infiziert wurden, wie in diesem Protokoll mit mCherry -Sbeschrieben. Typhimurium zuvor biotinylierte aber nicht mit magnetischen Beads Streptavidin konjugiert inkubiert. Nach 30 min Inkubation bei 37 ° C wurden die Zellen mit warmen PBS gewaschen und mit 4 % Formaldehyd für 20 min bei RT Fixation durch umfangreiche waschen mit PBS gestoppt wurde. Die Zellen wurden dann permeabilized mit 3 % Triton mit PBS-Puffer für 5 min bei RT infiziert BMDMs wurden dann mit Cy5-Streptavidin für 20 min bei 4 ° c inkubiert Nach der umfangreichen Reinigung wurden die Proben für die Analyse von konfokalen Mikroskopie (Abbildung 1) vorbereitet. Nicht biotinylierte mCherry -S. Typhimurium diente als Negativkontrolle. Fluoreszenzsignal aus Cy5-Streptavidin verzeichneten ausschließlich biotinylierte mCherry -S. Typhimurium, bestätigt, dass Biotinylierungen der Bakterien war erfolgreich. Mikroskopische Analyse erfolgte auf einem confocal Mikroskop mit "60 X O2 NA: 1,40" Ziel. Erregung Wellenlängen für die Fluorochromes wurden 405 nm (DAPI), 559 nm (mCherry) und 635 nm (Cy5) und PMT Spannung wurde bei 574v, 565v und 443v, "bzw." festgelegt.
Da die Immunantwort in Makrophagen durch Sausgelöst. Typhimurium ist weitgehend abhängig von der Makrophagen-Oberfläche-Rezeptor-Aktivierung durch bakterielle Liganden, die wir als nächstes getestet, ob die Beschichtung von S. Typhimurium mit Biotin und Streptavidin konjugiert magnetische Beads konnte der angeborenen Immunantwort in infizierten BMDMs geändert werden. Wir zunächst geprüft, ob der SBeschichtung. Typhimurium konnte die phagocytic Kapazität des BMDMs durch konfokale Mikroskopie geändert werden. BMDMs infiziert wurden, wie in diesem Protokoll mit mCherry -Sbeschrieben. Typhimurium beschichtet mit Biotin und Streptavidin konjugiert magnetische Beads oder unbeschichteten mCherry -S. Typhimurium. Nach 30 min Inkubation bei 37 ° C wurden die Zellen mit warmen PBS gewaschen und mit 4 % Formaldehyd für 20 min bei RT Nach dem umfangreichen waschen mit PBS, wurden die Proben für die Analyse von konfokalen Mikroskopie vorbereitet. Wie in Abbildung 2dargestellt, phagozytiert Makrophagen beschichteten und unbeschichteten mCherry -S. Typhimurium gleichermaßen.
Als nächstes haben wir die entzündliche Reaktion ausgelöst durch Sanalysiert. Typhimurium beschichtet mit Biotin und Streptavidin konjugiert magnetische Beads (Abbildung 3). Überstände von der BMDMs infiziert mit beschichteten und unbeschichteten S. Typhimurium wurden gesammelt, nach 24 Stunden nach der Infektion für Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) der sekretierten Interleukin-6 (IL-6). Die Beschichtung von S. Typhimurium mit Biotin und Streptavidin konjugiert magnetische Beads änderten nicht deutlich die entzündliche Reaktion von Makrophagen.
Um die Reinheit der Bakterien-haltigen Phagosom erhalten durch den Einsatz dieses Protokolls zu beurteilen haben wir isolierte mCherry -Sanalysiert. Typhimurium-mit Phagosom durch Immunoblotting. Mit Hilfe spezifischer Antikörper gegen das mCherry-Tag, fanden wir deutliche Anreicherung von mCherry exprimierenden S. Typhimurium in isolierten Phagosom im Vergleich zu die cytosolische Fraktion aus derselben Probe (Abbildung 4) gewonnen. Isolierte Phagosom, mCherry - Senthält. Typhimurium , die zuvor nicht mit Biotin wurde dienten als Negativkontrolle. Diese Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll für die Reinigung von Phagosom ermöglicht, die hoch in Bakterien angereichert sind.
Als nächstes haben wir durchgeführt Immunoblot Analyse der Endosom und Lysosomen Marker in isolierten Phagosom, Senthält. typhimurium (Abbildung 5). Die meisten der Endosom und Lysosomen Marker wurden deutlich im Phagosom isoliert in 4 h nach der Infektion im Vergleich zu 30 min beobachtet. Die Anreicherung der Endosomal Marker Rab5 und Rab7, sowie den Lysosomen Marker V-ATPase (V0 und V-1 -Untereinheiten) und Cathepsin D, wurden beobachtet. Interessanterweise wurde nur gespalten Form von Cathepsin D in isolierten Phagosom in 4 h nach der Infektion beobachtet. Die Spaltung von pro-Cathepsin D (48 kDa), die aktive Kurzform (33 kDa) produzieren tritt nur in der Phagosom aber nicht in das Zytosol, demonstrieren die Spezifität dieses Protokolls für Phagosom isoliert.
Da Markierungen von Organellen wie Mitochondrien oder endoplasmatische Retikulum (ER) oft in die Vorbereitungen der Bakterien-haltigen isoliert Phagosom, Serkannt werden. Typhimurium-mit isolierten Phagosom wurden sondiert mit spezifischen Antikörpern gegen die mitochondriale Transporter Tomm20 und ER Protein Calnexin (Abbildung 6). Wir testeten sie auch mit einem Antikörper gegen die Glykolyse Enzym GAPDH cytosolischen Kontamination in der isolierten Phagosom beurteilen. Wir fanden Mitochondrien und ER Marker in S. Typhimurium-Phagosom aber keine cytosolischen Kontamination isoliert.
Um die Vielseitigkeit des Protokolls für die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom, Biotin und Streptavidin konjugiert magnetische Beads zu studieren war der Gram-positiven Bakterium S. AureusCoating Verfahren zugewiesen. Durch die gleichen Fixierung und Färbeprotokoll für mCherry -Sbeschrieben. typhimurium (Abbildung 1) wir bestätigt erfolgreiche Biotinylierungen des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) auszudrücken -S. Aureus (Abbildung 7). Darüber hinaus wir erkannt Anreicherung von Endosom Marker Rab7 und Lysosomen Marker V-ATPase (V-0 -Untereinheit) und Cathepsin D durch Immunoblot Analyse der isolierten GFP -S. Aureus-mit Phagosom (Abbildung 8). Die Spaltung von Cathepsin D in seine Reife Form war nur nach einer Infektion in den isolierten Phagosom Proben aber nicht in den cytosolischen Fraktionen 4 h nachweisbar. S. Aureusisoliert-enthaltenden Phagosom waren frei von zytosolischen Kontamination, dargestellt durch die Immunodetection von GAPDH.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass unsere Phagosom Isolierung Protokoll die Isolation von hochangereichertem Bakterien-haltigen Phagosom, cytosolischen kontaminationsfrei ermöglicht. Die isolierten Phagosom Vorbereitungen können für die Analyse von Endosom und Lysosomen Marker zur pha studierenGosome Reifung. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass dieses Protokoll für gramnegative und grampositive Bakterien verwendet werden kann und die Kennzeichnung Verfahren der Immunantwort Makrophagen nicht verändert wird.
Abbildung 1: Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse der biotinylierte S. typhimurium mit Cy5-Streptavidin. BMDMs waren für 30 min mit mCherry -Sinfiziert. Typhimurium , die biotinylierte ("biotinylierte S. T."), wie in diesem Protokoll beschrieben. Nicht biotinylierte mCherry -S. typhimurium ("Nicht biotinylierte S. T.") als Negativkontrolle diente. Nach Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wurden Proben mit Cy5-Streptavidin für 20 min bei 4 ° c inkubiert. Fluoreszenzsignal aus dem Zellkern (DAPI), mCherry -S. Typhimuriumund Cy5-Streptavidin wurden analysiert mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Signal vom Cy5-Streptavidin konnte nur in den vorher beschriftet mit Biotin, und bestätigt damit die effiziente Biotinylierungen Bakterien nachgewiesen werden. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Mikroskopische Analyse der BMDMs mit mCherry -Sinfiziert. Typhimurium beschichtet mit Biotin und magnetische Beads Streptavidin konjugiert. BMDMs infiziert wurden mit mCherry -S.typhimurium mit Biotin und Streptavidin konjugiert magnetische Beads beschriftet, wie in diesem Protokoll beschrieben. Nach Abzug der Makrophagen, die Bakterien für 30 min phagocytize, wurden Zellen mit 4 % Formaldehyd für 20 min bei RT befestigt. Die beschichteten Bakterien durch Makrophagen phagozytiert wurden dann von konfokalen Mikroskopie analysiert. Analyse zeigte, dass die Einnahme von beschichteten Bakterien ("Coated S. T.") ist vergleichbar mit der Einnahme von unbeschrifteten mCherry Bakterien ("nicht beschichtet S. T."), zeigen diese Kennzeichnung mit Biotin und Streptavidin konjugiert magnetische Beads Phagozytose von Snicht ändert. Typhimurium durch Makrophagen. Kerne wurden für die Mikroskopie Visualisierung mit DAPI gefärbt. Daten werden angezeigt, wie meine ± S.E.M und die statistische Signifikanz berechnet mit dem Student t-Test wird als dargestellt * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001. Maßstabsleiste = 40 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: IL-6-Sekretion von BMDMs infiziert mit Biotin und Streptavidin konjugiert magnetische Beads, Sgekennzeichnet. Typhimurium im Vergleich zu unbeschriftete S. typhimurium . BMDMs wurden mit S. infiziert. Typhimurium mit Biotin und Streptavidin konjugiert magnetischen Kügelchen beschichtet, wie in diesem Protokoll beschrieben. Nach 24 Stunden nach der Infektion wurden Überstände zur weiteren Analyse des IL-6-Sekretion von ELISA gesammelt. Überstände bilden BMDMs mit unbeschichteten Sinfiziert. Typhimurium dienten als Kontrolle. Die Induktion von IL-6-Sekretion von beschichteten S. Typhimurium war nicht signifikant unterschiedlich im Vergleich zu unbeschichteten S. Typhimurium. Daten werden angezeigt, wie meine ± S.E.M und die statistische Signifikanz mit Student t-Test berechnet wird als dargestellt * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: bakterielle Anreicherung in isolierten Phagosom. Anreicherung von mCherry getaggt S. Typhimurium in isolierten Phagosom gesammelt nach 30 min und 4 h der Infektion wurde auf der cytosolischen Bruchteil verglichen. Β-Aktin diente als ein Steuerelement laden. Die negative-Kontrolle bezieht sich auf Phagosom isoliert mit unbeschichteten S. Typhimurium bei 30 min nach der Infektion. Wie zu erwarten, die endgültige Ausgabe der Phagosom Isolation benutzen unbeschriftete S. Typhimurium stellt keine erhebliche Mengen an mCherry oder β-Aktin, demonstrieren die Spezifität des Protokolls. 20 µg Protein wurde pro Probe geladen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Analyse der Markierungen in isolierten SEndosom und Lysosomen. Typhimurium-mit Phagosom. Die Anreicherung der Endosom Marker Rab5 und Rab7, und die Lysosomen Marker V-ATPase (V0 und V-1 -Untereinheiten) und Cathepsin D wurde in isolierten Sanalysiert. Typhimurium-mit Phagosom nach 30 min und 4 h der Infektion extrahiert. Β-Aktin diente als ein Steuerelement laden. 20 µg Protein wurde pro Probe geladen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Analyse der Mitochondrien, ER und cytosolischen Marker in isolierten S. Typhimurium-mit Phagosom. Die cytosolische Markierung GAPDH, ER Marker Calnexin und der mitochondrialen Marker Tomm20 in S. Typhimurium Phagosom isoliert auf 30 min und 4 h nach der Infektion wurden durch Immunoblotting analysiert und verglichen mit den entsprechenden cytosolischen Anteile. 20 µg Protein pro Probe geladen wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Mikroskopische Analyse der GFP -S. Aureus infizierten Makrophagen. BMDMs wurden mit Sinfiziert. Aureus mit dem Ausdruck grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) mit der Bezeichnung with Biotin beschriebene Methodik zur Kennzeichnung S. Typhimurium. Nach Abzug der Makrophagen, die Bakterien für 30 min phagocytize, wurden die Zellen fixiert. Unbeschichtete S. Aureus ("nicht biotinylierte S. A.") dienten als Negativkontrolle. Nach Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wurden Proben mit Cy5-Streptavidin für 20 min bei 4 ° c inkubiert. Das Fluoreszenzsignal aus dem Zellkern (DAPI), GFP -S. Aureusund Cy5-Streptavidin wurden von konfokalen Mikroskopie analysiert. Das Signal vom Cy5-Streptavidin konnte nur in den Bakterien, die zuvor mit der Bezeichnung mit Biotin, effiziente Biotinylierungen bestätigt gesehen werden. Skalieren von Balken = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Analyse der Markierungen in isolierten SEndosom und Lysosomen. Aureus-mit Phagosom. S. Aureus-mit Phagosom isoliert bei 30 min, 2 h und 4 h nach der Infektion, analysiert wurden, durch Immunoblotting für phagosomal Marker Rab5, Rab7 und V-ATPase im Vergleich zu den entsprechenden cytosolischen Anteile. 20 µg Protein pro Probe geladen wurden. Proben wurden auch mit einem spezifischen Antikörper gegen GAPDH, zeigen, dass das Sisoliert getestet. Aureus-enthaltenden Phagosom sind frei von zytosolischen Kontamination. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eine neue Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und magnetische Beads Streptavidin konjugiert wird hier beschrieben. Nach sanften Unterbrechung der Zellmembran können Bakterien-haltigen Phagosom leicht mit einem magnetischen Rack extrahiert werden. Wir zeigen, dass die Kennzeichnung der Bakterien die Fähigkeit des Erregers induzieren Entzündungen bewahrt und ändert nichts an der phagocytic Eigenschaft der Wirtszelle. Wichtig ist, Phagosom erhalten durch diese Methode werden in Bakterien und Endosom/Lysosomen bereichert Marker und frei von zytosolischen Kontamination.
Diese Methode bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu den traditionellen Phagosom Isolationsmethode, die Saccharose gradient Trennung beschäftigt. Es entfällt das zeitraubende mehrere Zentrifugation Schritte, so dass des Forschers zu handhaben mehr Proben in weniger Zeit und reinere Phagosom Proben zu erhalten, indem einfach die Zahl der Waschschritte. Die Verwendung dieses Protokolls erübrigt sich spezialisierte und empfindliche Geräte wie Ultrazentrifugation. High-Speed Zentrifugation könnte die Eigenschaften von Vesikeln und reduzieren die letzte Ausbeute22, der in diesem Protokoll vermieden wird. Wir haben auch gezeigt, dass die Beschichtung von S. Typhimurium mit Biotin und Streptavidin konjugiert magnetische Beads ändert nicht die phagocytic Kapazität von Makrophagen. Darüber hinaus bezeichnet die Induktion von IL-6 durch infizierte Makrophagen S. Typhimurium war unverändert im Vergleich zu Makrophagen mit unbeschrifteten Bakterien infiziert. Daher, Beschichtung von S. Typhimurium nicht signifikante Veränderungen in ihrer Pathogenität induzieren. Nach unserem Kenntnisstand Beschichtung von S. Typhimurium stellt kein Hindernis für die Verwendung von isolierten Phagosom für eines der gemeinsamen Labor-Analyse-Techniken dar.
S. Typhimurium-enthaltenden Phagosom isoliert von dieser Methode sind in Bakterien und vorliegenden typischen Endosomal und lysosomalen Marker, wie die V-ATPase Untereinheiten V0 V1 und gespalten Reife Protease bereichert Cathepsin D, die nur in den isolierten Phagosom Fraktionen nachgewiesen werden können. Darüber hinaus fanden wir Mitochondrien und ER Marker in isolierten S. Typhimurium-Phagosom enthalten. Zusammenspiel von Phagosom, mit der ER hat umfassend untersucht, obwohl die Menge der Proteine aus dem ER im Erreger-haltigen Phagosom variieren mit der Erreger untersucht und Zelltyp. Phagosom mit Brucella Abortus isoliert von nichtprofessionellen Fresszellen sind beispielsweise reich an ER Marker23 aber nicht die von Makrophagen24isoliert. Calnexin wurde zuvor in S. nachgewiesen Typhimurium-haltigen Phagosom von Saccharose gradient18isoliert. Enge Verzahnung von inerten Wulst-haltigen Phagosom und Mitochondrien wurde auch bereits berichtet25, erklärt das Vorhandensein von Tomm20 in isolierten Phagosom. Mitochondrialen Proteine in isolierten Phagosom, L. Pneumophila26 oder Mycobacterium27enthält gefunden. Jedoch die Erkennung von Mitochondrien Komponenten in Vorbereitung der isolierten Erreger-haltigen Phagosom mithilfe der Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung-Methode oft aufgrund der ähnlichen Dichte dieser Organellen werden geglaubt wurde und die Pathogen-haltigen Phagosom und daher unspezifischen28. Unsere Methode vermeidet solche eine Kontamination Problem und liefert mehr zuverlässige Informationen, die darauf hindeutet, dass mitochondriale Membranen mit den phagosomal Membranen mischen könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, es wird schwierig sein, ER und mitochondriale Marker in der Erreger-haltigen zu vermeiden Phagosom Vorbereitungen, je nach Zelltyp der Host und der Erreger isoliert. Die empfohlene Methode für die Überprüfung der Reinheit der isolierten Phagosom soll markiert-Bakterien und bestimmten Tag Antikörpern zum Nachweis von Bakterien durch Western-Blot zu verwenden. Wir zeigen auch, dass diese Isolationsmethode für andere Mikroorganismen mit verfügbaren Oberflächen Amin Gruppen angepasst werden kann, die biotinylierte sein können. Als Beispiel haben wir erfolgreich unser Protokoll zur Isolierung von S. Aureuseingesetzt-mit Phagosom. Phagosom mit S. Aureus isoliert unter Verwendung dieses Protokolls sind in Lysosomen und Endosom Marker wie V-ATPase (V-0 -Untereinheit) und Rab7, bzw. bereichert, sondern stellen keinen cytosolische Markierungen wie z. B. GAPDH.
Endosomal/phagosomal Vesikel bieten einzigartige Umgebungen für den Abbau der Krankheitserreger, sondern bewahren die Antigene für die Signalisierung des adaptiven Immunsystems. Obwohl Phagosom und der Reifungsprozess ausgiebig untersucht worden sind, bleibt der Mikroumgebung im Phagosom auf Hosting-verschiedene Erreger schwer. Es ist auch unklar, wie metabolische Veränderungen in Zellen Phagosom Reifung und dessen Inhalt zu ändern. Daher gibt das Protokoll hier mehr Möglichkeiten Phagosom Biogenese und seiner Funktion im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten zu studieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Forschung in der Robinson Lab wird unterstützt durch Mittel aus Köln-Exzellenz-Cluster auf zelluläre Stressreaktionen im Aging-Associated Krankheiten, Universität zu Köln, Deutschland (CECAD; gefördert durch die DFG im Rahmen der Exzellenzinitiative des Bundes und staatliche Regierungen) und Zuschüsse aus der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune und Maria Pesch-Stiftung der Universität zu Köln.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
