Summary
Aquí, describimos un método simple para inducir úlceras piel clínicamente relevantes (PUs) en un modelo murino de lesión de la médula espinal (SCI). Este modelo puede utilizarse en los estudios preclínicos a la pantalla para diferentes terapias de sanación PUs en pacientes.
Abstract
Las úlceras por presión (PUs) son comunes debilitantes complicaciones de lesión traumática de la médula espinal (SCI) y tienden a ocurrir en los tejidos blandos alrededor de las prominencias óseas. Se, sin embargo, conoce poco sobre el impacto del SCI en curación de herida en la piel en el contexto de modelos animales en entornos experimentales controlados. En este estudio, se presenta un modelo de ratón simple, no invasivo, reproducible y clínicamente relevante de PUs en el contexto de lesión medular completa. Ratones machos adultos (Balb/c, 10 semanas de edad) eran afeitados y depilados. Post-depilatorio (24 h), ratones fueron sometidos a laminectomía seguida de transección completa de la médula espinal (vértebras T9-T10). Inmediatamente después, un pliegue de piel en la parte posterior de los ratones fue levantado e intercalado entre dos discos magnéticos en lugar de siguiente 12 h, creando así un área isquémico que en los próximos días se convirtió en un PU. Las áreas heridas demostraron edema de tejido y desaparición epidérmico por solicitud posterior al día 3. PUs espontáneamente desarrollado y curado. Curación fue, sin embargo, más lento en los ratones SCI comparado para controlar ratones no SCI cuando la herida fue creada por debajo del nivel por el contrario, no en la curación se observaron diferencias entre ratones de no SCI SCI y control cuando la herida fue creada por encima del nivel de la médula espinal. Este modelo es una herramienta potencialmente útil para el estudio de la dinámica de desarrollo de PU de la piel y cicatrización después de SCI, así como a prueba enfoques terapéuticos que pueden ayudar a curar esas heridas.
Introduction
Las úlceras por presión (PUs) son complicaciones secundarias principales de SCI traumático1. PUs son lesiones localizadas en la piel o tejidos subyacentes que ocurren generalmente sobre las prominencias óseas donde se concentra el peso del cuerpo mientras el paciente está sentado o acostado1. La piel, grasa y músculo están expuestos a esta presión constante que lleva al desarrollo de isquemia localizada, inflamación de los tejidos, daño mecánico y necrosis2,3.
El desarrollo de PUs es afectado por varios factores, incluyendo la magnitud de presión y de esquileo, carga duración, humedad de la piel y temperatura, longevidad de la lesión y la higiene general de la piel. También existen factores sistémicos que influyen, como la condición física general, hueso y morfología de tejido muscular y de fuerza4, edad del paciente, medidas hematológicas, género y factores socio-económicos incluso como estado civil, educación, y renta4,5.
La prevención y tratamiento de PUs siguen siendo retos significativos en pacientes. Pacientes desarrollan PUs en ~ 30-40% de los casos, con una tasa de re-ocurrencia de 60-85%, posiblemente debido a la débil formación de tejido cicatricial y la falta de sensación protectora1. Así, PUs a menudo conduce a la hospitalización de pacientes y en general representan una carga financiera significativa (80% vs SCI sólo) al sistema de salud5,6,7,8,9 , 10.
A lo mejor de nuestro conocimiento, no ha habido ningún estudio en ajustes experimentales controladas para investigar el impacto del SCI en el proceso de curación de PU debido a la falta de modelos animales adecuados. Aquí, se describe un modelo de ratón reproducible y clínicamente relevante de la PU de la piel. Este modelo puede utilizarse para estudiar la dinámica de aparición de la PU y curación posterior, así como para poner a prueba enfoques terapéuticos potenciales para prevenir PU o mejorar PU en el contexto de la médula espinal.
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Protocol
Todo manejo de animales y procedimientos quirúrgicos fueron realizados conforme a un protocolo aprobado por la Universidad de Rutgers institucional Animal cuidado y uso. Ratones fueron alimentados con dieta estándar y agua ad libitum.
1. preparación de instrumentos quirúrgicos y no quirúrgicos
- Esterilizar los instrumentos quirúrgicos y no quirúrgicos en el autoclave.
- Limpiar la mesa de operaciones quirúrgica con etanol al 70% y caliente una almohadilla térmica a 37 ° C.
- Coloque la almohada en la mesa de operaciones y cubrir con cortinas quirúrgicas estériles.
Nota: En todos los procedimientos de supervivencia, la técnica "No Touch" se utiliza aquí para mantener la esterilidad.
2. preparación de animales y realizar la laminectomía espinal T9-T10
- Provéase de ratones (Balb/c)-semana-varón de 10 adultos. Inducir la anestesia en cada animal con un principio de inhalador 5% isoflurano y luego reducir a 2-3% para mantener la sedación para el resto de los procedimientos.
- Por que no hay respuesta a un estímulo de cola/var pizca inducida por nocicepción confirman la anestesia completa.
- Afeitar el pelo del dorso (cabeza a cola) con una maquinilla eléctrica y luego aplicar la crema depilatoria (3 minutos) para eliminar el pelo restante. Finalmente, lave el dorso con corriente de agua y húmedos matorrales y regresar los animales a sus jaulas.
Nota: Esto es necesario para evitar más irritación a la piel y la contaminación química en el momento de herir la piel - Al día siguiente, aplicar pomada oftálmica a las córneas para proteger los ojos de secado durante el procedimiento quirúrgico y a continuación, frote la piel con 3 preparaciones alternativas de betadine scrub y el 70% de etanol.
- Con un bisturí, realizar una incisión en la piel (~1.0-1.5 cm) a lo largo de la línea media en la parte posterior a nivel de las vértebras T8-T12.
Nota: El nivel de las vértebras se identifica nuevamente contando la vértebra de T13 con la ubicación de las costillas flotantes que corresponden a T13 vértebra11,12. - Eliminar el tejido adiposo subcutáneo para obtener acceso a los músculos del paraspinal y luego disecar lentamente para exponer la apófisis espinosas y láminas en ambos lados.
Nota: Hacer este procedimiento con mucho cuidado para evitar sangrado excesivo o cualquier lesión a la médula espinal, en este punto. - Realizar una laminectomía para exponer la médula espinal (vértebras T9-T10) desprendiendo suavemente la lámina espinal utilizando pinzas de microdissecting.
Nota: Realizar la laminectomía para que un exceso de la médula espinal está expuesto para facilitar la creación de la lesión. En el grupo control, solamente la laminectomía se realiza.
3. realización de la lesión de médula espinal completa T9-T10
- Con pinzas, fije la columna vertebral en T8 y elevación hasta exagerar la curvatura de la columna.
- Con unas tijeras finas, sección de la médula espinal entre la vértebra T9 y T10 hasta el piso del canal vertebral, para asegurar la transección completa.
- Después de observar el transection completo bajo microscopio quirúrgico, aplique un trozo de grasa subcutánea en el sitio de laminectomía para proporcionar protección adicional a la médula espinal antes del cierre del sitio quirúrgico.
- Finalmente, cerrar la herida y la sutura de la musculatura paravertebral, fascia superficial, con sutura continua y luego cierre la piel con sutura clips12.
- Post-SCI, observar el movimiento del intestino en el día siguiente; sin embargo, gestionar la vejiga urinaria por evacuación de vejiga manual.
Nota: La escala de ratón de Basso (BMS) puede ser utilizado para monitorear el progreso del miembro posterior recuperación funcional post-SCI en día 2 y luego semanal, ver complementarios Figura 111,12,13.
4. inducción de úlcera de la presión de la piel después de SCI completa
- Inmediatamente después de la cirugía SCI, frote la parte posterior del animal con betadine y 70% de alcohol.
- Por un PU debajo del sitio SCI, inyectar en la piel dorsal cerca del sacro, un volumen muy pequeño (10 μl) de solución de bupivacaína 0.125% usando una aguja de 25 G en lugares equidistantes ~0.5-1.0 cm aparte, en una elipse alrededor del sitio de aplicación del imán.
Nota: Por un PU sobre el sitio SCI, inyectar la piel dorsal cerca de la región cervical. - Levantar un pliegue de piel en la parte posterior del ratón cuidadosamente y emparedado entre 2 discos magnéticos (5 × 12 mm de diámetro y 2,4 g, fuerza magnética de 3800 G) (figura 1). 11 , 12
- Inmediatamente después de solicitud, animales regreso a las jaulas individuales se coloca sobre una almohada hasta que el sentido completo es había recuperado (figura 1).
- Después de 12 h de la solicitud, ligeramente anestesiar animales con isoflurano y quitar los imanes. Tomar una fotografía de los sitios de la herida, para registrar la aparición de la PU (día hora 0 punto). Cubrir la herida con la película de apósito transparente (3M) para evitar sequedad o contaminación.
5. postoperatorio cuidado de los animales, la eutanasia y la colección de tejidos para histología
- Inmediatamente después de la cirugía, inyectar los animales con 1 mL de solución salina 0.9% por vía subcutánea para la hidratación.
- Inyectar por vía subcutánea buprenorfina-SR (1 mg/kg) inmediatamente para la analgesia.
- Inyecte meloxicam por vía subcutánea animal diaria (1 mg/kg) y cefazolina (50 mg/kg durante 3-7 días) y dos veces diaria evacuación vesical manual.
- Animales en jaulas individuales y proporcionar comida accesible y agua ad libitum. Ratones con SCI completa pueden caminar con sus patas delanteras y acercarse a la comida y el agua sin dificultad.
- Saque los clips quirúrgicos 7 días después de la cirugía SCI.
- En los puntos de tiempo deseado después de SCI y herir la piel, eutanasia animales por inhalación de CO2 (3-5 min), con arreglo a las pautas de AVMA en eutanasia14.
- Recoger muestras de piel heridas, fijar en formol al 10% durante 24 h y luego almacenar en etanol al 70% a 4 ° C hasta seccionar.
- Para procesar los tejidos, incluir en parafina y generar secciones delgadas (5 μm) en un micrótomo. Tinción con hematoxilina y eosina (H & E) para visualizar la morfología del tejido (figura 3). Estudios de inmunohistoquímica (figura 4), la mancha secciones usando los anticuerpos apropiados para Ki67 (proliferación), CD31 (angiogénesis) y la actinia alfa-lisa del músculo (α-SMA) como se describe en12 de Kumar et al.
Nota: Software de análisis de imagen puede utilizarse para cuantificar características imagen12.
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Representative Results
Este protocolo crea un PU en el ajuste de brevemente al completo (como se ilustra en la figura 1), todos los ratones con o sin SCI completa toleraron muy bien, los imanes que permanecía en su posición original para máximo 12 h (figuras 1C, 1D, 1f, 1 h ). Todos los ratones desarrollaron dos heridas circulares separadas por un puente de tejido normal (Figura 1e, 1 g, 1i). La respuesta inicial de la herida fue similar en los ratones sin SCI (Figura 1e), o con el SCI por debajo del sitio SCI (figura 1 g) o sobre el sitio SCI (figura 1i).
Figura 2 muestra la desaparición de la epidermis por día 3 post retiro del imán y su reaparición durante el día 7, aunque con una migración significativamente más lenta en las heridas creadas por debajo del nivel de la lesión medular en ratones SCI.
Las heridas de presión se clasificaron según criterios previamente publicados12. Figura 3 y figura 4 representan las características curativas de SCI y controlan ratones no SCI. El grupo SCI exhibió curativo más lento, más grande área de la cicatriz, epidermis más delgada y dermis y menor densidad de células de la proliferación (Ki67+ células), los vasos sanguíneos (CD31+ las células) y la actinia alfa-lisa del músculo (α-SMA+) en las heridas de la piel 11 , 12.
Cuando no se crearon las heridas de la piel por encima del nivel de lesión medular, como se muestra en la figura 5, cambios en el tiempo de curación, epidérmicas y dérmicas espesores o área de la cicatriz fue visto en comparación con controles no SCI.
Figura 1 : Procedimiento experimental para la creación de presión heridas en no SCI (n = 3) y SCI completa de ratones (n = 3). Después de 1 semana la habituación en el laboratorio, ratones fueron afeitados y había depilado (una). Esquema de colocación de disco magnético (M) (b, modificado de Stadler et al.15). Colocación de discos magnéticos en dorso de piel de un ratón normal y su actividad después de la recuperación de la anestesia en la jaula (d, c). En ratones SCI, los discos pueden colocarse por debajo (f) o arriba (h) el Lic sitio. El área de la lesión inducida por el imán de la piel es visible inmediatamente después de 12 h de la aplicación de M, que muestra las 2 heridas separadas por un puente de piel intacta en el no-SCI (e) y ratones SCI (g, i). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Piel herida histología (H & E mancha) y herida epidérmica ancho. El día 3 y día 7 después de la aplicación de M, un conjunto de ratones fueron sacrificados en los grupos de completar-LIC (LIC + M) para el estudio de la temprana efectos M-inducida por la isquemia y reperfusión y no SCI (Control + M). Las flechas indican los bordes de la herida epidérmica, situados en la guarnición epitelial se adelgaza hacia fuera y desaparece. Barra de escala = 1 mm. herida epidérmica ancho medido en cada grupo (n = 3 en cada punto del tiempo) se representa en el diagrama de barra panel inferior. Significación estadística se determinó por la prueba t de Student. * p < 0.05 y ** p < 0.01. Los datos se presentan como media ± SEM (error estándar de la media). Esta figura se ha modificado con permiso del diario de Neurotrauma, 35, 6, 815-824, (2018), publicó por Mary Ann Liebert, Inc., de New Rochelle, Nueva York12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Impacto del SCI completa en desarrollo PU M-inducida y la sanación. (un) representante imágenes de heridas de la piel en ratones completa-LIC (LIC + M) después de la inducción de la PU en el período de 21 días y no SCI (Control + M). Barra de escala = 1 cm. (b) Quantified herida imágenes que muestran la fracción de cierre de la herida como una función del tiempo. (c, d) Imágenes representativas de heridas cicatrizadas que muestra el área de la cicatriz no SCI y ratones SCI. área de la cicatriz (e) Quantified en no SCI versus ratones SCI. (f, g) Histología representativa de piel herida curada (tinción H & E) que muestra epidermis (E, flechas dobles), dermis (D, flechas dobles grandes) y la capa de grasa (F). Barra de escala = 100 μm. (h) cuantificación de espesores epidérmicas y dérmicas de heridas cicatrizadas en el tiempo de cierre de la herida (21 días para no SCI y 35 días para los ratones SCI). Datos se presentan como ±SEM. significación estadística determinado por ANOVA seguido de prueba de LSD de post-hoc Fisher y prueba t de Student. * p < 0.05, ** p < 0.01, y *** p < 0.001. Esta figura ha sido reimpreso con permiso del diario de Neurotrauma, 35, 6, 815-824, (2018), publicó por Mary Ann Liebert, Inc., de New Rochelle, Nueva York12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Expresión de Ki67, CD31 y a la SMA en las úlceras de la piel de ratones SCI y no SCI. Se cosecharon los tejidos de la herida después del cierre de la herida, es decir, en una inducción de post PU días 21 (Control + M) y 35 (SCI + M). Imágenes representativas de 5 μm de espesor secciones teñidas con anti-Ki67, anti-CD31 o anti-α-SMA y visualizaron con un objetivo 40 x. Imágenes representativas de no SCI (a, d, g) y ratones SCI (b, e, h) muestran la distribución de Ki67+, CD31+y α-SMA+ (mancha marrón, rojo punto de flechas a algunas áreas manchadas) . La zona positivos % de expresión obtenido por análisis de imagen se compara entre los grupos (c, f, i). La zona fue un promedio de tres 40 x campos (dos de los bordes de la herida) y uno del centro de la herida por sección (2, ratón, 3 ratones en cada grupo). Datos se presentan como media ± SEM. estadísticos de significación se determinó mediante la prueba t de Student. Esta figura ha sido reimpreso con permiso del diario de Neurotrauma, 35, 6, 815-824, (2018), publicó por Mary Ann Liebert, Inc., de New Rochelle, Nueva York12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Impacto del SCI en el desarrollo y la cicatrización de las úlceras sobre el sitio SCI. Imágenes representativas de las úlceras en el no-SCI (Control + M) y ratones de LIC (LIC + M) durante el período de observación (a). Barra de escala = 1 cm. El área de la cicatriz el día 21 está representado por círculos (a) y valores se promediaron en no SCI y SCI ratones (b). Herida cuantificados imágenes que muestran la fracción de cierre de la herida como una función del tiempo (c). Histología representativa de las úlceras de la piel curada que muestra epidermis (E, pequeña flecha doble) y la dermis (D, grande doble flecha). Barra de escala = 100 μm (d). Cuantificación de espesores epidérmicas y dérmicas de úlceras en la piel curada en el tiempo de cierre de la herida (día 21). Datos se presentan como media ± SEM. estadístico significación determinada por ANOVA seguido por LSD prueba posthoc Fisher o prueba t de Student. NS-estadísticamente no significativa. Esta figura ha sido modificada y reproducido con permiso del diario de Neurotrauma, 35, 6, 815-824, (2018), publicó por Mary Ann Liebert, Inc., de New Rochelle, Nueva York12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Complementarios figura 1: función de Motor en ratones SCI se evaluó mediante la puntuación de BMS en el día después de la lesión 2 y luego semanal. La puntuación de BMS en el día 2 y la semana 5 fueron 0.058 ±0.058 (mediana 0-no hay movimiento, n = 17) y 0.35±0.12 (n = 17, mediana-0). Los datos se representan como ±SEM. Esta figura ha sido modificada y reproducido con permiso del diario de Neurotrauma, 35, 6, 815-824, (2018), publicó por Mary Ann Liebert, Inc., de New Rochelle, Nueva York12. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
El protocolo en este estudio describe un nuevo modelo experimental de PUs para evaluar el impacto del SCI en la cicatrización de heridas. La piel PUs fueron inducidos a través de una aplicación de 12 h de dos imanes de disco de diámetro de 12 mm en un pliegue de piel dorsal, bien situado por encima o por debajo del sitio SCI. Los datos muestran que SCI retrasa la cicatrización de la piel en ratones. Importante, estas observaciones fueron hechas específicamente en heridas de la piel por debajo del nivel de inervación del SCI, como las heridas hechas por encima del nivel SCI, y así que seguía siendo inervada, fueron en gran parte inafectado en su patrón de curación en comparación con los ratones no SCI.
El protocolo de PU descrito en este documento se basa en un método publicado previamente utilizado en ratones, donde se aplicaron imanes más débiles (1000 Gauss) en tres ciclos de aplicación de imán 12 h separadas por 12 h sin imán15. Inicialmente, se compararon utilizando uno, dos y tres ciclos de 12 h de la solicitud. Una desventaja del uso de aplicaciones repetidas es que cada vez que se debe tener especial cuidado al separar el imán del doblez de la piel y reaplique en la ubicación exacta del mismo. Una sola aplicación, por tanto, es mucho más simple y fue suficiente para crear un PU en el pliegue de la piel dorsal de ratón. De lo contrario, esta metodología no requiere de un dispositivo complejo no impide movimientos de animales y es muy reproducible. Estudios usando imanes diferentes tamaños, formas y o fortalezas, o intentar crear PUs en diferentes localizaciones anatómicas deben optimizar el protocolo. Como en todos los estudios curación de herida en la piel, es importante aplicar correctamente y regularmente cambiar la película transparente para evitar la sequedad y contaminación del lecho de la herida.
El mecanismo de formación de la PU en este modelo se basa en la fuerza de compresión entre dos imanes, que se espera que supere sustancialmente las presiones de perfusión capilar y venosa en la piel y ha sido bien documentado previamente para inducir lesiones en mayor animales16. Usando un ciclo de solo 12 h creó una úlcera de piel que tenía lesión que se extiende profundamente en la dermis, que corresponde a las etapas I y II según criterios estándar15. Una limitación de esta técnica es que no fuimos capaces de conseguir una etapa III-IV PU. Por lo tanto, uno no podría estudiar la implicación de los músculos y huesos en desarrollo PU y la curación sin modificaciones significativas a nuestro modelo actual. Además, el PUs que generamos curan espontáneamente y, por lo tanto, no fielmente representan un PU crónica como puede verse en pacientes humanos. Curiosamente, sin embargo, el método resultó en una PU inicial similar del tamaño de la que se cerró con similar dinámica como comúnmente utilizado 1 cm x 1 cm grosor total la piel heridas. El método de inducción PU repuestos el subyacente panniculus carnosus, mientras que se quita totalmente en el modelo de escisión. Así pues, parece que el panniculus carnosus no juega un papel importante en el proceso de cierre de herida, que, en ratones y otros roedores, principalmente se produce mediante contracción mediada por fibroblastos y miofibroblastos en dermis viable que rodea el sitio de la herida, con formación de cicatriz poco17.
El sitio de la inducción de la PU, por encima o por debajo de SCI, no interfiere con la incisión de piel utilizada para acceder al sitio de la médula espinal. Por lo tanto, el método puede ser aplicado fácilmente por debajo o por encima del nivel de lesión medular, que permite a los estudios que pueden distinguir a los locales vs efectos sistémicos del SCI en la cicatrización de heridas. Mientras los animales no SCI a ganar peso después de la inducción de la PU, el crecimiento de animales SCI es retraso en el crecimiento. A pesar de este profundo cambio sistémico, cicatrización de la herida no fue afectada cuando se creó el PU sobre el nivel del SCI. Este modelo puede, por tanto, utilizarse para comprender mejor el papel de la inervación local en la cicatrización de heridas. Como en todos los estudios que involucran SCI, es importante dar especial atención y seguimiento a los ratones post-SCI, que requieren drenaje manual de la vejiga, control de las condiciones del intestino y tratamiento antibiótico profiláctico11,12 .
Pacientes substancialmente se enfrentan incluso con la mejor atención hospitalaria y la educación, y piel PUs impartir costos significativos para el sistema de salud de Estados Unidos. Este modelo permite la evaluación de side-by-side del efecto de lesión medular en el desarrollo de la PU de la piel y cicatrizante, que proporciona una plataforma para probar diversas estrategias terapéuticas que pueden ayudar a PU curativo en pacientes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente financiado por la Comisión de New Jersey de investigación de la médula espinal (CSCR15IRG010), el Departamento de defensa de Estados Unidos (SC160029) y el Yale Departamento de cirugía Ohse subvención programa de investigación. Agradecemos a Sean o ' Leary del centro W.M. Keck de Neurociencia colaboración, Rutgers para asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magnets | Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO | CD14C | 3800 G Magnetic force |
| Mice standard diet | PMI Nutrition International, Brentwood, MO | Standard Food Pellet | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 029405 | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | Image Analysis Software | |
| BETADINE Surgical Scrub | HENRY SCHEIN Animal Health | ||
| Ophthalmic Ointment | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 008897 | |
| NAIR-Hair Remover Lotion | Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ | ||
| ELOXIJECT (meloxicam) Injection | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 049755 | 5 mg/mL, 10 mL |
| Cefazolin Sodium | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 054846 | 1 g, 10 mL bottle |
| Buprenorphine-SR | ZooPharm, Windsor, CO | - | - |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | BRAUN, Irvine, CA | S8004-5384 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR, Radnor, PA | 16004-130 | |
| BALB/C Male Mouse | Charles River Lab., Wilmington, MA | 28 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicator | Puritan, Guilford, ME | SKU#: 25-806 | |
| Michel Suture Clips | Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA | 12040-01 | |
| Surgical Suture, U.S.P. | Henry Schein Animal Health | 101-2636 |
References
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